Введение
РНК, которая считывается рибосомой для производства белка.
В молекулярной биологии, матричная рибонуклеиновая кислота (мРНК) – это одноцепочечная молекула РНК, соответствующая генетической последовательности гена и считываемая рибосомой в процессе синтеза белка. мРНК образуется в процессе транскрипции, когда фермент (РНК-полимераза) преобразует ген в первичный транскрипт мРНК (также известный как пре-мРНК). Эта пре-мРНК обычно все еще содержит интроны – области, которые не кодируют конечную последовательность аминокислот. Они удаляются в процессе сплайсинга РНК, оставляя только экзоны – области, кодирующие белок. Эта последовательность экзонов составляет зрелую мРНК. Зрелая мРНК затем считывается рибосомой, которая создает белок, используя аминокислоты, переносимые транспортной РНК (тРНК). Этот процесс известен как трансляция. Все эти процессы являются частью центральной догмы молекулярной биологии, описывающей поток генетической информации в биологической системе. Как и в ДНК, генетическая информация в мРНК содержится в последовательности нуклеотидов, организованных в кодоны, состоящие из трех рибонуклеотидов каждый. Каждый кодон кодирует определенную аминокислоту, за исключением стоп-кодонов, которые прекращают синтез белка. Трансляция кодонов в аминокислоты требует двух других типов РНК: транспортной РНК, которая распознает кодон и предоставляет соответствующую аминокислоту, и рибосомальной РНК (рРНК) – центрального компонента белкосинтезирующего механизма рибосомы. Концепция мРНК была разработана Сиднеем Бреннером и Фрэнсисом Криком в 1960 году во время беседы с Франсуа Жакобом. В 1961 году мРНК была независимо идентифицирована и описана одной группой, состоящей из Бреннера, Жакоба и Мэтью Меселсона, и другой группой под руководством Джеймса Уотсона. Анализируя данные для публикации, Жакоб и Жак Монод предложили название «мРНК-посланник».
Синтез
Кратковременное существование молекулы мРНК начинается с транскрипции и завершается деградацией. В течение своего жизненного цикла молекула мРНК может подвергаться процессингу, редактированию и транспортировке перед трансляцией. Молекулы эукариотической мРНК часто нуждаются в значительном процессинге и транспортировке, в то время как молекулы прокариотической мРНК – нет. Молекула эукариотической мРНК вместе с окружающими её белками образует мессенджерный РНП.
Транскрипция
Транскрипция – это процесс копирования РНК с ДНК. Во время транскрипции РНК-полимераза синтезирует копию гена с ДНК на мРНК по мере необходимости. Этот процесс несколько отличается у эукариот и прокариот. Одним из заметных различий является то, что прокариотическая РНК-полимераза ассоциируется с ферментами, участвующими в обработке ДНК, непосредственно во время транскрипции, что позволяет обработке происходить одновременно с синтезом. В результате, новая цепь мРНК становится двухцепочечной за счет образования комплементарной цепи, известной как цепь тРНК, которая, будучи объединенной, не способна формировать структуры за счет спаривания оснований. Более того, матрицей для мРНК является комплементарная цепь тРНК, последовательность которой идентична последовательности антикодона, к которой связывается ДНК. Кратковременный, необработанный или частично обработанный продукт называется предшественником мРНК, или пре-мРНК; после полной обработки он называется зрелой мРНК.
Замена тимина урацилом
мРНК использует урацил (U) вместо тимина (T) в ДНК. Урацил (U) является комплементарным основанием к аденину (A) во время транскрипции, а не тимину (T). Таким образом, при использовании матричной цепи ДНК для построения РНК тимин заменяется урацилом. Эта замена позволяет мРНК переносить соответствующую генетическую информацию от ДНК к рибосоме для трансляции. Что касается эволюционной истории, урацил появился раньше тимина; данные свидетельствуют о том, что РНК предшествовала ДНК в процессе эволюции. Гипотеза мира РНК предполагает, что жизнь началась с молекул РНК, до появления геномов ДНК и кодируемых белков. В ДНК эволюционная замена урацила на тимин, вероятно, повысила стабильность ДНК и улучшила эффективность репликации ДНК.
Обработка эукариотической пре-мРНК
Обработка мРНК значительно различается у эукариот, бактерий и архей. Неэукариотическая мРНК, по сути, становится зрелой сразу после транскрипции и не требует дополнительной обработки, за редкими исключениями. Однако эукариотическая пре-мРНК нуждается в нескольких этапах обработки перед транспортировкой в цитоплазму и трансляцией рибосомой.
Сплит
Обширная обработка эукариотической пре-мРНК, приводящая к образованию зрелой мРНК, – это сплайсинг РНК, механизм, посредством которого интроны (некодирующие области) удаляются, а экзоны (кодирующие области) соединяются.
Добавление 5'-го капочка
5'-кэп (также называемый РНК-кэп, РНК-7-метилгуанозин-кэп или РНК-m7G-кэп) – это модифицированный нуклеотид гуанина, который добавляется к "переднему" или 5'-концу эукариотической матричной РНК (мРНК) вскоре после начала транскрипции. 5'-кэп состоит из терминального 7-метилгуанозинового остатка, соединенного через 5'-5'-трифосфатную связь с первым транскрибированным нуклеотидом. Его наличие критически важно для распознавания рибосомой и защиты от РНКаз. Добавление кэпа связано с транскрипцией и происходит ко-транскрипционно, таким образом, каждый процесс влияет на другой. Вскоре после начала транскрипции 5'-конец синтезируемой мРНК связывается с комплексом, синтезирующим кэп, который ассоциирован с РНК-полимеразой. Этот ферментативный комплекс катализирует химические реакции, необходимые для образования кэпа мРНК. Синтез протекает как многоступенчатая биохимическая реакция.
Редактирование
В некоторых случаях мРНК подвергается редактированию, что изменяет её нуклеотидный состав. Примером у человека является мРНК аполипопротеина B, которая редактируется в одних тканях, но не в других. В результате редактирования создается преждевременный стоп-кодон, который при трансляции приводит к образованию более короткого белка.
Полиаденолирование
Полиадениляция – это ковалентное присоединение полиаденильного фрагмента к молекуле РНК-мессенджера. У эукариотических организмов большинство молекул РНК-посланника (мРНК) полиаденилируются на 3'-конце, однако недавние исследования показали, что также распространены короткие последовательности уридина (олигоуридиляция). Поли(А)-хвост и связанный с ним белок способствуют защите мРНК от деградации экзонуклеазами. Полиадениляция также важна для завершения транскрипции, экспорта мРНК из ядра и трансляции. мРНК может полиаденилироваться и у прокариотических организмов, где поли(А)-хвосты способствуют, а не препятствуют экзонуклеолитической деградации. Полиадениляция происходит во время и/или сразу после транскрипции ДНК в РНК. После завершения транскрипции цепь мРНК расщепляется под действием эндонуклеазного комплекса, связанного с РНК-полимеразой. После расщепления мРНК к свободному 3'-концу в месте расщепления добавляется около 250 остатков аденозина. Эта реакция катализируется полиаденилат-полимеразой. Как и в случае альтернативного сплайсинга, для мРНК может существовать несколько вариантов полиаденилирования. Также встречаются мутации в сайтах полиаденилирования. Первичный РНК-транскрипт гена расщепляется в месте присоединения поли(А), и к 3'-концу РНК добавляется 100–200 аденозиновых нуклеотидов. Если этот сайт изменен, образуется аномально длинная и нестабильная структура мРНК.
Транспорт
Еще одно отличие между эукариотами и прокариотами — транспорт мРНК. Поскольку транскрипция и трансляция у эукариотов происходят в разных компартментах, эукариотические мРНК должны экспортироваться из ядра в цитоплазму — процесс, который может регулироваться различными сигнальными путями. Зрелые мРНК распознаются по своим модификациям после процессинга, а затем экспортируются через ядерные поры путем связывания с белками CBP20 и CBP80, а также с комплексом транскрипции/экспорта (TREX). У эукариотов выявлено несколько путей экспорта мРНК. В пространственно сложных клетках некоторые мРНК транспортируются к определенным субклеточным локализациям. В зрелых нейронах определенные мРНК транспортируются из сомы в дендриты. Одним из мест трансляции мРНК являются полирибосомы, избирательно локализованные под синапсами. мРНК для Arc/Arg3.1 индуцируется синаптической активностью и избирательно локализуется вблизи активных синапсов на основе сигналов, генерируемых NMDA-рецепторами. Другие мРНК также перемещаются в дендриты в ответ на внешние стимулы, такие как мРНК β-актина. Для экспорта из ядра мРНК актина ассоциируется с ZBP1 и затем с 40S субъединицей. Комплекс связывается с моторным белком и транспортируется к целевому месту (удлинение нейритов) вдоль цитоскелета. В конечном итоге ZBP1 фосфорилируется Src для инициации трансляции. В развивающихся нейронах мРНК также транспортируются в растущие аксоны и особенно в конусы роста. Многие мРНК несут так называемые "почтовые индексы", которые направляют их транспорт к определенной локализации. мРНК также могут передаваться между клетками млекопитающих через структуры, называемые туннелирующими нанотрубками.
Перевод
Поскольку прокариотическая мРНК не требует процессинга или транспортировки, трансляция рибосомой может начинаться сразу после завершения транскрипции. Следовательно, можно сказать, что прокариотическая трансляция связана с транскрипцией и происходит ко-транскрипционно. Эукариотическая мРНК, прошедшая процессинг и транспортированную в цитоплазму (то есть, зрелая мРНК), затем может быть транслирована рибосомой. Трансляция может происходить на свободно плавающих в цитоплазме рибосомах или направляться к эндоплазматической сети сигнальным распознающим комплексом. Таким образом, в отличие от прокариот, эукариотическая трансляция не связана напрямую с транскрипцией. В некоторых случаях даже наблюдается, что снижение уровня мРНК сопровождается увеличением уровня белка, как, например, для уровней мРНК/белка EEF1A1 при раке молочной железы.
Кодирующие регионы
Кодирующие области состоят из кодонов, которые декодируются и транслируются в белки рибосомой; у эукариот обычно в один, а у прокариот обычно в несколько. Кодирующие области начинаются со старт-кодона и заканчиваются стоп-кодоном. Как правило, старт-кодон представляет собой триплет AUG, а стоп-кодоны – UAG ("янтарный"), UAA ("охровый") или UGA ("опаловый"). Кодирующие области, как правило, стабилизируются внутренними комплементарными парами оснований, что препятствует их деградации. Помимо кодирования белков, участки кодирующих областей могут выполнять функцию регуляторных последовательностей в пре-мРНК, выступая в качестве энхансеров сплайсинга экзонов или силэнсеров сплайсинга экзонов.
Непереведенные регионы
Нетранслируемые области (UTR) — это участки мРНК, расположенные до стартового кодона и после стоп-кодона, которые не транслируются, и называются, соответственно, 5'-нетранслируемая область (5' UTR) и 3'-нетранслируемая область (3' UTR). Эти области транскрибируются вместе с кодирующей областью и, следовательно, являются экзонами, поскольку присутствуют в зрелой мРНК. Несколько функций в экспрессии генов приписываются нетранслируемым областям, включая стабильность мРНК, локализацию мРНК и эффективность трансляции. Способность UTR выполнять эти функции зависит от их последовательности и может различаться между разными мРНК. Генетические варианты в 3' UTR также были связаны с предрасположенностью к заболеваниям из-за изменения структуры РНК и трансляции белка. Стабильность мРНК может контролироваться 5' UTR и/или 3' UTR из-за различной аффинности к ферментам, разрушающим РНК, называемым рибонуклеазами, и к вспомогательным белкам, которые могут способствовать или ингибировать деградацию РНК. (См. также, С-богатый элемент стабильности.) Эффективность трансляции, включая иногда полное ингибирование трансляции, может контролироваться UTR. Белки, связывающиеся с 3' или 5' UTR, могут влиять на трансляцию, воздействуя на способность рибосомы связываться с мРНК. МикроРНК, связанные с 3' UTR, также могут влиять на эффективность трансляции или стабильность мРНК. Цитоплазматическая локализация мРНК, как считается, является функцией 3' UTR. Белки, необходимые в определенной области клетки, также могут быть там синтезированы; в этом случае 3' UTR может содержать последовательности, позволяющие транскрипту локализоваться в этой области для трансляции. Некоторые элементы, содержащиеся в нетранслируемых областях, формируют характерную вторичную структуру при транскрипции в РНК. Эти структурные элементы мРНК участвуют в регуляции мРНК. Некоторые, такие как элемент SECIS, являются мишенями для связывания белков. Один класс элементов мРНК, рибопереключатели, напрямую связывают небольшие молекулы, изменяя свою конформацию для модификации уровней транскрипции или трансляции. В этих случаях мРНК регулирует себя.
Полиатомный хвост
3'-поли(А)-хвост — это длинная последовательность адениновых нуклеотидов (часто несколько сотен), добавляемая к 3'-концу пре-мРНК. Этот хвост способствует экспорту из ядра и трансляции, а также защищает мРНК от разрушения.
Моноцистроновая и полицистроновая мРНК
Молекула мРНК называется моноцистронической, когда она содержит генетическую информацию для трансляции только одной белковой цепи (полипептида). Это характерно для большинства эукариотических мРНК. С другой стороны, полицистроническая мРНК содержит несколько открытых рамок считывания (ОРФ), каждый из которых транслируется в полипептид. Эти полипептиды обычно выполняют связанные функции (часто являясь субъединицами, составляющими конечный комплексный белок), и их кодирующие последовательности сгруппированы и регулируются совместно в регуляторной области, содержащей промотор и оператор. Большинство мРНК, встречающихся у бактерий и архей, является полицистроническими, дицистроническая или бицистроническая мРНК кодирует только два белка.
циркуляризация мРНК
В эукариотах молекулы мРНК образуют циклические структуры благодаря взаимодействию между eIF4E и поли(А)-связывающим белком, оба из которых связываются с eIF4G, формируя мостик мРНК-белок-мРНК. Считается, что циклизация способствует циклическому движению рибосом по мРНК, что приводит к эффективному и быстрому трансляции, а также может обеспечивать трансляцию только целых мРНК (частично деградированные мРНК обычно лишены m7G-колпачка или поли(А)-хвоста). Существуют и другие механизмы циклизации, особенно в вирусных мРНК. Полиовирусная мРНК использует участок в форме клеверного листа у своего 5'-конца для связывания с PCBP2, который, в свою очередь, связывается с поли(А)-связывающим белком, образуя хорошо известный цикл мРНК-белок-мРНК. Вирус желтой карликовости ячменя образует связи между сегментами мРНК на ее 5'- и 3'-концах (так называемые "поцелуйные шпильки"), циклизуя мРНК без участия каких-либо белков. Геномы РНК-вирусов (плюс-цепи которых транслируются как мРНК) также часто циклизуются. Во время репликации генома циклизация способствует увеличению скорости репликации генома, обеспечивая циклическое движение вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, аналогично тому, как предполагается, циклически движется рибосома.
Деградация
Различные мРНК в одной и той же клетке имеют различный период полураспада (стабильность). В бактериальных клетках отдельные мРНК могут существовать от нескольких секунд до более чем часа. Однако, в среднем, период полураспада составляет от 1 до 3 минут, что делает бактериальную мРНК значительно менее стабильной, чем эукариотическую мРНК. В клетках млекопитающих период полураспада мРНК варьируется от нескольких минут до нескольких дней. Чем выше стабильность мРНК, тем больше белка может быть синтезировано с её помощью. Ограниченный период полураспада мРНК позволяет клетке быстро изменять синтез белка в ответ на изменяющиеся потребности. Существует множество механизмов, приводящих к деградации мРНК, некоторые из которых описаны ниже.
Деградация прокариотической мРНК
В целом, у прокариот время жизни мРНК значительно короче, чем у эукариот. Прокариоты разрушают мРНК, используя комбинацию рибонуклеаз, включая эндонуклеазы, 3'-экзонуклеазы и 5'-экзонуклеазы. В некоторых случаях небольшие молекулы РНК (sRNA) длиной от десятков до сотен нуклеотидов могут стимулировать деградацию специфических мРНК за счет спаривания оснований с комплементарными последовательностями и облегчения расщепления рибонуклеазой RNase III. Недавно было показано, что у бактерий также присутствует своего рода 5'-"кэп", состоящий из трифосфата на 5'-конце. Удаление двух фосфатов приводит к образованию 5'-монофосфата, что вызывает разрушение мРНК экзонуклеазой RNase J, которая деградирует в направлении от 5' к 3'.
Оборот мРНК у эукариотов
Внутри эукариотических клеток существует баланс между процессами трансляции и деградации мРНК. мРНК, находящиеся в активной стадии трансляции, связываются с рибосомами, эукариотическими факторами инициации eIF4E и eIF4G, а также поли(А)-связывающим белком. eIF4E и eIF4G блокируют фермент декаппирования (DCP2), а поли(А)-связывающий белок блокирует экзосомный комплекс, защищая концы молекулы мРНК. Баланс между трансляцией и деградацией отражается в размере и количестве цитоплазматических структур, известных как P-тела. Поли(А)-хвост мРНК укорачивается специализированными экзонуклеазами, которые направляются к конкретным молекулам мРНК благодаря комбинации цис-регуляторных последовательностей на РНК и транс-действующих белков, связывающих РНК. Считается, что удаление поли(А)-хвоста нарушает циркулярную структуру мРНК и дестабилизирует комплекс, связывающийся с кэпом. Затем мРНК подвергается деградации либо экзосомным комплексом, либо комплексом декаппирования. Таким образом, трансляционно неактивные мРНК могут быть быстро разрушены, в то время как активные мРНК остаются неповрежденными. Механизм, посредством которого трансляция останавливается и мРНК передается комплексам деградации, изучен недостаточно подробно.
Распады элементов, богатые AU
Наличие богатых AU-элементов в некоторых мРНК млекопитающих способствует дестабилизации этих транскриптов посредством действия клеточных белков, которые связываются с этими последовательностями и стимулируют укорачивание поли(А)-хвоста. Потеря поли(А)-хвоста, как считается, ускоряет деградацию мРНК, облегчая её атаку экзосомным и декаппирующим комплексами. Быстрая деградация мРНК через AU-элементы является важным механизмом предотвращения избыточной продукции мощных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (TNF) и стимулирующий фактор колоний гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF). AU-элементы также регулируют биосинтез протоонкогенных факторов транскрипции, таких как c-Jun и c-Fos.
Бессмысленный распад
Эукариотические мРНК подвергаются контролю посредством нонсенс-опосредованного распада (NMD), который проверяет наличие преждевременных стоп-кодонов (нонсенс-кодонов) в мРНК. Они могут возникать в результате неполного сплайсинга, V(D)J-рекомбинации в адаптивной иммунной системе, мутаций в ДНК, ошибок транскрипции, "проскальзывания" рибосомы, приводящего к сдвигу рамки считывания, и других причин. Обнаружение преждевременного стоп-кодона запускает деградацию мРНК посредством 5'-декапирования, удаления 3'-поли(А)-хвоста или эндонуклеолитического расщепления.
Малая интерферентная РНК (siRNA)
У метазоанов малые интерферирующие РНК (siRNA), обработанные Dicer, включаются в комплекс, известный как РНК-индуцированный комплекс глушения, или RISC. Этот комплекс содержит эндонуклеазу, которая расщепляет мРНК, идеально комплементарную siRNA, к которой она связывается. Образующиеся фрагменты мРНК затем разрушаются экзонуклеазами. siRNA широко используется в лабораториях для блокирования функции генов в клеточных культурах. Предполагается, что он является частью врожденной иммунной системы, обеспечивающей защиту от вирусов с двухцепочечной РНК.
МикроРНК (миРНК)
МикроРНК (миРНК) — это небольшие РНК, которые обычно частично комплементарны последовательностям в мРНК метазоанов. Связывание миРНК с мРНК может подавлять трансляцию этой мРНК и ускорять удаление поли(А)-хвоста, тем самым ускоряя деградацию мРНК. Механизм действия микроРНК является предметом активных исследований.
Другие механизмы распада
Существуют и другие механизмы, посредством которых сообщения могут подвергаться деградации, включая непрерывный распад и подавление при участии piRNA-интерферирующей РНК Piwi, а также другие факторы.
Приложения
Введение нуклеозид-модифицированной последовательности мРНК может заставить клетку производить белок, который, в свою очередь, может непосредственно лечить заболевание или функционировать как вакцина; более косвенно, белок может стимулировать дифференцировку эндогенной стволовой клетки в желаемом направлении. Основные проблемы РНК-терапии сосредоточены на доставке РНК в соответствующие клетки. Эти проблемы включают тот факт, что "голая" РНК естественным образом деградирует после приготовления; она может вызывать атаку иммунной системы организма, воспринимая ее как чужеродный агент; и она непроницаема для клеточной мембраны. В 1990-х годах были разработаны мРНК-вакцины для персонализированной терапии рака, основанные на немодифицированной нуклеозидами мРНК. Терапии на основе мРНК продолжают изучаться в качестве метода лечения рака, аутоиммунных, метаболических и респираторных воспалительных заболеваний. Методы редактирования генома, такие как CRISPR, также могут извлекать выгоду из использования мРНК для индукции клеток к производству желаемого белка Cas. С 2010-х годов РНК-вакцины и другие РНК-терапевтические средства рассматриваются как "новый класс лекарственных препаратов". Первые вакцины на основе мРНК получили ограниченное разрешение и были внедрены во всем мире во время пандемии COVID-19, например, вакцины Pfizer–BioNTech и Moderna. Нобелевская премия по физиологии и медицине в 2023 году была присуждена Каталине Карико и Дрю Вайсману за разработку эффективных мРНК-вакцин против COVID-19.
История
Несколько исследований в области молекулярной биологии, проведенных в 1950-х годах, показали, что РНК играет ту или иную роль в синтезе белка, однако эта роль оставалась неясной. Например, в одном из первых докладов Жак Моно и его команда продемонстрировали, что синтез РНК необходим для синтеза белка, в частности, при производстве фермента β-галактозидазы в бактерии *E. coli*. Артур Парди также обнаружил аналогичное накопление РНК в 1954 году. В 1953 году Альфред Херши, Джун Диксон и Марта Чейз описали определенную ДНК, содержащую цитозин (что указывало на то, что это была РНК), которая быстро исчезала после синтеза в *E. coli*. Оглядываясь назад, можно предположить, что это было одним из первых наблюдений существования мРНК, но в то время это не было осознано. Идея мРНК впервые возникла у Сиднея Бреннера и Фрэнсиса Крика 15 апреля 1960 года в Королевском колледже Кембриджа, когда Франсуа Джейкоб рассказывал им о недавнем эксперименте, проведенном Артуром Парди, им самим и Монодом (так называемый эксперимент PaJaMo, который не доказал существование мРНК, но намекнул на такую возможность). Поощряемые Криком, Бреннер и Джейкоб немедленно приступили к проверке этой новой гипотезы и обратились за помощью к Мэтью Меселсону из Калифорнийского технологического института. Летом 1960 года Бреннер, Джейкоб и Меселсон провели эксперимент в лаборатории Меселсона в Калтехе, который впервые доказал существование мРНК. Осенью того же года Джейкоб и Монод предложили название "РНК-посланник" и разработали первую теоретическую модель для объяснения ее функции. В феврале 1961 года Джеймс Уотсон сообщил, что его исследовательская группа из Гарварда шла у них по пятам, проводя серию экспериментов, результаты которых указывали примерно в том же направлении. Бреннер и другие согласились с просьбой Уотсона отложить публикацию результатов их исследований. В результате статьи Бреннера и Уотсона были опубликованы одновременно в одном и том же выпуске журнала *Nature* в мае 1961 года, а в том же месяце Джейкоб и Монод опубликовали свою теоретическую модель мРНК в журнале *Journal of Molecular Biology*.