Цитогенетика: структура, методы и значение в генетических исследованиях.

Введение

Ветвь генетики — научный журнал, ранее известный под этим названием.

Цитогенетика по сути является ветвью генетики, но также относится к клеточной биологии/цитологии (подразделу анатомии человека), изучающей связь между хромосомами и поведением клеток, особенно во время митоза и мейоза. Используемые методы включают кариотипирование, анализ G-окрашенных хромосом, другие методы цитогенетического окрашивания, а также молекулярную цитогенетику, такую как флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) и сравнительная геномная гибридизация (CGH).

Работа Макклинтока по кукурузе

Барбара Макклинток начала свою карьеру как цитогенетик кукурузы. В 1931 году Макклинток и Харриет Крейтон показали, что цитологическая рекомбинация меченых хромосом коррелирует с рекомбинацией генетических признаков (генов). Работая в Институте Карнеги, Макклинток продолжила предыдущие исследования механизмов разрыва и восстановления хромосом в кукурузе. Она выявила конкретное событие разрыва хромосомы, которое всегда происходило в одном и том же локусе на 9-й хромосоме кукурузы, и назвала этот локус "Ds" или локусом "диссоциации". Макклинток продолжила свою карьеру в цитогенетике, изучая механизмы и наследование фрагментированных и кольцевых (циклических) хромосом кукурузы. В ходе своей цитогенетической работы Макклинток открыла транспозоны, что в конечном итоге привело к присуждению ей Нобелевской премии в 1983 году.

Природные популяции Drosophila

В 1930-х годах Добжанский и его коллеги собрали Drosophila pseudoobscura и D. persimilis из диких популяций в Калифорнии и соседних штатах. Используя технику Пейнера, они изучили политенные хромосомы и обнаружили, что дикие популяции были полиморфны по хромосомным инверсиям. Все мухи выглядят одинаково, независимо от того, какие инверсии они несут – это пример скрытого полиморфизма. Быстро накопились данные, подтверждающие, что за это отвечает естественный отбор. Используя метод, разработанный Л’Эритье и Тейсье, Добжанский разводил популяции в популяционных клетках, что позволяло проводить кормление, разведение и отбор образцов, предотвращая их побег. Это позволило исключить миграцию как возможное объяснение полученных результатов. Штаммы, содержащие инверсии с известной начальной частотой, можно поддерживать в контролируемых условиях. Было установлено, что различные типы хромосом не флуктуируют случайным образом, как это было бы, если бы они были селективно нейтральными, а стабилизируются на определенных частотах. К моменту публикации Добжанским третьего издания своей книги в 1951 году он убедился, что хромосомные морфы поддерживаются в популяции благодаря селективному преимуществу гетерозигот, как и большинство полиморфизмов.

Лилия и мышь

Лилия – предпочтительный объект для цитологического изучения мейоза, так как её хромосомы крупные, и каждую морфологическую стадию мейоза легко идентифицировать под микроскопом. Хотта, Чендли и др. представили данные о едином характере ников ДНК и репаративного синтеза в мужских мейотических клетках лилий и грызунов на стадиях зиготена – пахитены мейоза, когда предположительно происходит кроссинговер. Наличие общего паттерна у организмов, столь удалённых друг от друга в филогенетическом плане, как лилия и мышь, позволило авторам заключить, что организация мейотического кроссинговера, по крайней мере у высших эукариот, вероятно, имеет универсальное распространение.

Аномалии человека и медицинские применения

После появления методов, позволяющих легко подсчитывать хромосомы, были быстро сделаны открытия, связанные с аберрантными хромосомами или числом хромосом. Конституционная цитогенетика: При некоторых врожденных заболеваниях, таких как синдром Дауна, цитогенетика выявила природу хромосомного дефекта: «простую» трисомию. Аномалии, возникающие в результате неделения хромосом, могут приводить к анеуплоидии (добавлению или потере целых хромосом) у одного из родителей или у плода. В 1959 году Лежен обнаружил, что у пациентов с синдромом Дауна имеется дополнительная копия хромосомы 21. Синдром Дауна также называют трисомией 21. К другим выявленным числовым аномалиям относятся аномалии половых хромосом. Женщина с одной Х-хромосомой имеет синдром Тернера, а мужчина с дополнительной Х-хромосомой, в результате чего общее число хромосом составляет 47, – синдром Клайнфельтера. Многие другие комбинации половых хромосом совместимы с живорождением, включая XXX, XYY и XXXX. Способность млекопитающих переносить анеуплоидии половых хромосом обусловлена способностью инактивировать их, что необходимо нормальным самкам для компенсации наличия двух копий хромосомы. Не все гены на Х-хромосоме инактивируются, поэтому у людей с дополнительными Х-хромосомами наблюдается фенотипический эффект. Трисомия 13 связана с синдромом Патау, а трисомия 18 – с синдромом Эдвардса. Приобретенная цитогенетика: в 1960 году Питер Ноуэлл и Дэвид Хангерфорд обнаружили небольшую хромосому в лейкоцитах пациентов с хроническим миелолейкозом (ХМЛ). Эта аномальная хромосома получила название филадельфийской хромосомы, поскольку оба ученых проводили свои исследования в Филадельфии, штат Пенсильвания. Тринадцать лет спустя, с развитием более совершенных методов, Джанет Роули показала, что аномальная хромосома является результатом транслокации хромосом 9 и 22. Выявление филадельфийской хромосомы цитогенетическим методом является диагностическим критерием ХМЛ. Более 780 случаев лейкемии и сотни солидных опухолей (легких, предстательной железы, почек и т. д.) в настоящее время характеризуются приобретенной хромосомной аномалией, имеющей важное прогностическое значение. Выявление этих хромосомных аномалий привело к открытию огромного числа «генов рака» (или онкогенов). Углубляющиеся знания об этих генах рака позволяют разрабатывать таргетную терапию, что меняет прогноз выживания пациентов. Таким образом, цитогенетика играла и продолжает играть важную роль в прогрессе понимания рака. Обширные базы данных (Атлас генетики и цитогенетики в онкологии и гематологии, база данных рака COSMIC, база данных Mitelman по хромосомным аберрациям и слияниям генов при раке) предоставляют исследователям и клиницистам необходимый инструментарий для работы в этой области.

Following the advent of procedures that allowed easy enumeration of chromosomes, discoveries were quickly made related to aberrant chromosomes or chromosome number. Constitutional cytogenetics: In some congenital disorders, such as Down syndrome, cytogenetics revealed the nature of the chromosomal defect: a "simple" trisomy. Abnormalities arising from nondisjunction events can cause cells with aneuploidy (additions or deletions of entire chromosomes) in one of the parents or in the fetus. In 1959, Lejeune discovered patients with Down syndrome had an extra copy of chromosome 21. Down syndrome is also referred to as trisomy 21. Other numerical abnormalities discovered include sex chromosome abnormalities. A female with only one X chromosome has Turner syndrome, whereas a male with an additional X chromosome, resulting in 47 total chromosomes, has Klinefelter syndrome. Many other sex chromosome combinations are compatible with live birth including XXX, XYY, and XXXX. The ability for mammals to tolerate aneuploidies in the sex chromosomes arises from the ability to inactivate them, which is required in normal females to compensate for having two copies of the chromosome. Not all genes on the X chromosome are inactivated, which is why there is a phenotypic effect seen in individuals with extra X chromosomes. Trisomy 13 was associated with Patau syndrome and trisomy 18 with Edwards syndrome. Acquired cytogenetics: In 1960, Peter Nowell and David Hungerford discovered a small chromosome in the white blood cells of patients with Chronic myelogenous leukemia (CML). This abnormal chromosome was dubbed the Philadelphia chromosome as both scientists were doing their research in Philadelphia, Pennsylvania. Thirteen years later, with the development of more advanced techniques, the abnormal chromosome was shown by Janet Rowley to be the result of a translocation of chromosomes 9 and 22. Identification of the Philadelphia chromosome by cytogenetics is diagnostic for CML. More than 780 leukemias and hundreds of solid tumors (lung, prostate, kidney, etc.) are now characterized by an acquired chromosomal abnormality, whose prognostic value is crucial. The identification of these chromosomal abnormalities has led to the discovery of a very large number of "cancer genes" (or oncogenes). The increasing knowledge of these cancer genes now allows the development of targeted therapies, which transforms the prospects of patient survival. Thus, cytogenetics has had and continues to have an essential role in the progress of cancer understanding. Large databases (Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology, COSMIC cancer database, Mitelman Database of Chromosome Aberrations and Gene Fusions in Cancer) allow researchers and clinicians to have the necessary corpus for their work in this field.

Появление методов полосания

В конце 1960-х годов Торбьёрн Касперсон разработал метод флуоресцентного окрашивания квинакрином (Q-фрагментация), который позволил выявить уникальные фрагментарные рисунки для каждой пары хромосом. Это дало возможность различать пары хромосом, одинаковые по размеру, по характерным горизонтальным фрагментам. Фрагментарные рисунки в настоящее время используются для определения точек разрыва и составляющих хромосом, участвующих в хромосомных транслокациях. Делеции и инверсии внутри отдельной хромосомы также могут быть идентифицированы и описаны более точно с использованием стандартизированной номенклатуры фрагментации. G-фрагментация (с использованием трипсина и красителей Giemsa/Wright) была разработана параллельно в начале 1970-х годов и позволяет визуализировать фрагментарные рисунки с помощью светового микроскопа. Диаграммы, идентифицирующие хромосомы на основе фрагментарных рисунков, называются идиограммами. Эти карты стали основой для быстрого внедрения цитогенетики в клиническую лабораторию в пренатальной диагностике и онкологии, где кариотипирование позволило исследователям выявлять хромосомные аномалии. Методы были расширены для культивирования свободных амниоцитов, полученных из амниотической жидкости, и методов растяжения для всех типов культур, обеспечивающих фрагментацию с более высоким разрешением.

Начало молекулярной цитогенетики

В 1980-х годах произошел прогресс в молекулярной цитогенетике. Хотя радиоизотопно-меченые зонды гибридизовались с ДНК с 1969 года, теперь стали использовать флуоресцентно-меченые зонды. Гибридизация этих зондов к хромосомным препаратам с использованием существующих методик получила название флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Этот переход значительно расширил применение методов зондирования, поскольку флуоресцентно-меченые зонды более безопасны. Последующие усовершенствования в микроманипуляции и изучении хромосом привели к разработке метода микродиссекции хромосом, позволяющего выделять, клонировать и детально изучать аберрации в структуре хромосом.

Кариотипирование

Обычный хромосомный анализ (кариотипирование) включает анализ метафазных хромосом, обработанных трипсином с последующим окрашиванием по Giemsa, Leishmanns или их смесью. Это создает уникальные полосы на хромосомах. Молекулярный механизм и причина возникновения этих полос неизвестны, хотя, вероятно, они связаны со временем репликации и упаковкой хроматина. В цитогенетических лабораториях используется несколько методов хромосомного кариотипирования. Квинакриновое окрашивание (Q-кариотипирование) было первым методом, позволяющим получать специфические полосатые рисунки. Для этого метода требуется флуоресцентный микроскоп, и в настоящее время он используется реже, чем окрашивание по Giemsa (G-кариотипирование). Обратное окрашивание, или R-кариотипирование, требует термической обработки и инвертирует обычный черно-белый рисунок, наблюдаемый при G- и Q-кариотипировании. Этот метод особенно полезен для окрашивания дистальных участков хромосом. Другие методы окрашивания включают C-кариотипирование и окрашивание организационных областей ядрышек (NOR-окрашивание). Последние методы специфически окрашивают определенные участки хромосомы. C-кариотипирование окрашивает конститутивный гетерохроматин, который обычно расположен вблизи центромеры, а NOR-окрашивание выделяет спутники и перетяжки акроцентрических хромосом. Кариотипирование высокого разрешения включает окрашивание хромосом в профазу или раннюю метафазу (прометафазу), до достижения ими максимальной конденсации. Поскольку хромосомы профазы и прометафазы более протяженные, чем метафазные, количество наблюдаемых полос на всех хромосомах (полосы на гаплоидный набор, bph; "уровень полосатости") увеличивается примерно с 300–450 до 800. Это позволяет выявлять менее выраженные аномалии, которые обычно не обнаруживаются при обычном кариотипировании.

Подготовка слайдов

Клетки костного мозга, крови, околоплодных вод, пуповинной крови, опухолей и тканей (включая кожу, пуповину, хорионические ворсинки, печень и многие другие органы) могут быть культивированы с использованием стандартных методов клеточной культуры для увеличения их числа. Затем в культуру добавляют ингибитор митоза (колхицин, колцемид). Это останавливает клеточное деление в метафазе, что позволяет получить большее количество митотических клеток для анализа. Далее клетки центрифугируют, удаляют среду и ингибитор митоза, и заменяют их гипотоническим раствором. Это вызывает набухание лейкоцитов или фибробластов, что способствует расхождению хромосом при нанесении на предметное стекло, а также вызывает лизис эритроцитов. После выдерживания клеток в гипотоническом растворе добавляют фиксатор Карноя (3:1 метанол к ледяной уксусной кислоте). Это убивает клетки и фиксирует ядра оставшихся лейкоцитов. Клетки обычно фиксируют повторно для удаления остатков клеточного детрита или неразрушенных эритроцитов. Затем клеточную суспензию наносят на предметные стекла. После выдержки стекол в термостате или нескольких дней ожидания они готовы к окрашиванию и анализу.

Анализ

Анализ полосатых хромосом проводится под микроскопом специалистом клинической лаборатории по цитогенетике (CLSp(CG)). Как правило, анализируют 20 клеток, чего достаточно для исключения мозаицизма с допустимой степенью достоверности. Результаты суммируются и передаются врачу-цитогенетику, имеющему сертификат, для проверки и написания заключения с учетом анамнеза пациента и других клинических данных. Затем результаты оформляются в соответствии с Международной системой цитогенетической номенклатуры человека 2009 года (ISCN2009).

Анализ

Анализ образцов FISH проводится с помощью флуоресцентной микроскопии специалистом клинической лаборатории по цитогенетике. В онкологии, как правило, для исключения остаточной болезни низкого уровня оценивается большое количество межфазных клеток, обычно от 200 до 1000, которые подсчитываются и анализируются. При исследовании врожденных аномалий обычно оценивается 20 метафазных клеток.

Будущее цитогенетики

В настоящее время разработки сосредоточены на молекулярной цитогенетике, включая автоматизированные системы для подсчета результатов стандартных препаратов FISH и методы виртуального кариотипирования, такие как массивы сравнительной геномной гибридизации (CGH) и массивы однонуклеотидных полиморфизмов.