Кіріспе

Молекулалық биология техникасы

Полигистидин тегі, ең көп танымал саудалық атауымен His тегі, ақуыздағы аминқышқылдық мотивтер болып табылады, әдетте кем дегенде алты гистидин (His) қалдығынан тұрады, көбінесе ақуыздың N немесе C ұшында орналасады. Ол гексагистидин тегі, 6xHis тегі немесе His6 тегі деп те аталады. Тегті Roche компаниясы ойлап тапты, бірақ гистидиндер мен оның векторларын Qiagen компаниясы таратады. Гистидин тегі қойылған ақуыздарды тазартуға арналған әртүрлі жиынтықтар көптеген компаниялардан коммерциялық түрде қолжетімді. Тегтегі гистидин қалдықтарының жалпы саны екіден бастап 10 немесе одан да көп His қалдығына дейін өзгеруі мүмкін. N немесе C ұшқыш His тегтері эндопептидазаларды қолдану арқылы полигистидин тегін жоюға мүмкіндік беретін қолайлы аминқышқылдық тізбекпен бірге немесе оның алдында орналасуы мүмкін. Егер N ұшқыш His тегтерін жою үшін экзопептидазалар қолданылса (мысалы, Qiagen TAGZyme), бұл қосымша тізбек қажет емес. Сонымен қатар, экзопептидазамен кесу эндопротеазға негіделген тегтерді жою кезінде байқалатын нақты емес кесу мәселесін шеше алады. Полигистидин тегтері генетикалық түрлендірілген ақуыздарды аффиниттік тазалау үшін жиі қолданылады.

Принцип

Ақуыздар өз беттерінде металл иондарын үйлестіре алады және металл иондарына деген жақындығының айырмашылығын пайдаланып хроматография арқылы ақуыздарды бөлуге болады. Бұл 1975 жылы «металл келаттық аффинитет хроматографиясы» деген атаумен енгізілген иммобилизацияланған металл иондық аффинитет хроматографиясы (IMAC) деп аталады. Келесі зерттеулер ақуыздарды құрайтын аминқышқылдарының арасында гистидиннің металл иондарымен координациялық кешенге күшті қатысы бар екенін көрсетті. Сондықтан, егер ақуыздың соңына бірнеше гистидин қосылса, ақуыздың металл ионына жақындығы артады және бұл қызығушылық тудыратын ақуызды таңдап оқшаулау үшін қолданылуы мүмкін. His таңбасы бар ақуызды металл ионы, мысалы никель тұрақтандырылған тасушымен байланыстырғанда, гистидин қалдықтары металл ионын келаттайды және тасушыға байланысады. Басқа ақуыздар тасушыға байланыспайды немесе өте нашар байланысады, сондықтан оларды тиісті буфермен тасушыны жуу арқылы жоюға болады. Полигистидинмен таңбаланған ақуызды кейінде шайырдан элюциялау арқылы алуға болады.

Тегтің ұзындығы

Полигистидиндік белгілер көбінесе алты гистидин қалдығынан тұрады. Дегенмен, он екі гистидин қалдығынан тұратын немесе қысқа байланыстырғыш арқылы бекітілген қос белгілер де жиі кездеседі және аффинитті шайырмен байланысуды күшейту арқылы тазарту нәтижелерін жақсарта алады, соның нәтижесінде жуу кезіндегі қатаңдық пен эндогенді ақуыздардан бөлінуді арттыруға мүмкіндік береді. Белгіні қызығушылық тудыратын генге көптеген тазарту белгілеріне тән әдістерді қолдана отырып қосуға болады. Ең қарапайым әдіс – полигистидиндік белгі тізбегін қамтитын векторға қызығушылық тудыратын генді субклондау. Әртүрлі экспрессиялық жүйелерде қолдануға болатын көптеген векторлар полигистидиндік белгілермен, әртүрлі позицияларда және әртүрлі протеаза кесу орындарында, сондай-ақ басқа белгілермен бірге қол жетімді. Бірақ, егер тиісті вектор қол жетімді болмаса немесе белгіні ақуыздың N немесе C ұшынан басқа жерге енгізу қажет болса, қызығушылық тудыратын генді полигистидин белгісінің тізбегімен бірге тікелей синтездеуге болады немесе белгіні генге қосу үшін ПТР негізіндегі әртүрлі әдістерді қолдануға болады. Көп қолданылатын тәсіл – полигистидин белгісінің кодтау тізбесін ПТР праймерлеріне қосымша ретінде қосу.

Тегтің орны

Көбінесе полигистидиндік тег ақуыздың N немесе C ұшына қосылады және қысқа, икемді линкер арқылы байланыстырылады, онда протеазаның кесілу орны болуы мүмкін.

Тасымалдаушы матрицалар

Саудада қатты смолалық тірекке бекітілген әртүрлі тасымалдаушы матрицалар бар, оларды кейін металл катионымен зарядтауға болады. Бұл үшін имминодиацетит қышқылы (ИДА) мен нитрилотриацетит қышқылы (НТА) туындылары ең көп қолданылады, ал әртүрлі матрицалардың әр түрлі қолданыс салаларында өздерінің артықшылықтары мен кемшіліктері болады.

Металл иондары

Бірнеше металл катиондары гистидин таңбасының функционалдық тобы – имидазолға жоғары бейімділікке ие. Осы мақсатта дивалентті катион M2+ (M = Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn және т.б.) ауыспалы металл имидазол кешендері ең көп қолданылады. Катионды таңдау, әдетте, байланыстыру қабілеті мен тазалық арасындағы шартты келісім болып табылады. Никель осы факторлардың арасында жақсы тепе-теңдік ұсынатындықтан жиі қолданылады, ал кобальт тазалаудың тазалығын арттыру қажет болғанда қолданылады, себебі оның эндогенді ақуыздарға бейімділігі төмен; алайда, байланыстыру қабілеті никельге қарағанда төмендеуі мүмкін.

Белоктарды тазарту

Полигистидиндік тегтер көбінесе полигистидиндік тегті рекомбинантты ақуыздарды Escherichia coli немесе басқа экспрессия жүйелерінде өндіру үшін аффиндік тазалауда қолданылады. Әдетте, жасушалар центрифугалау арқылы жиналады, ал нәтижесіндегі жасушалар шөгіндісі физикалық әдістермен немесе лизозим сияқты детергенттер мен ферменттердің көмегімен, не олардың кез келген комбинациясы арқылы лизистеледі. Бұл кезеңде лизат, ие жасушалардан шыққан көптеген эндогенді ақуыздардың арасында рекомбинантты ақуызды қамтиды. Лизат, тасымалдаушы матрицаға байланыстырылған еківалентті катионмен байланысқан аффинитті шайырға тікелей қосылып (топтық байланысу) немесе бағана форматындағы шайыр төсегі арқылы өтеді. Содан кейін шайыр, байланысқан катионмен ерекше өзара әрекеттеспейтін ақуыздарды жою үшін буфермен жуылады, ал қызығушылық тудыратын ақуыз жоғары концентрациядағы имидазол немесе төмендетілген pH бар буферді қолдану арқылы шайырдан элюцияланады. Ақуыздың тазалығы мен мөлшері SDS-PAGE және Western blotting сияқты әдістермен бағалануы мүмкін. Полигистидиндік тегті қолдану арқылы аффинитті тазалау әдетте салыстырмалы түрде таза ақуызға әкеледі. Ақуыз тазалығын байлау және/немесе жуу буферлеріне төмен (20-40 мМ) концентрациядағы имидазол қосу арқылы жақсартуға болады. Дегенмен, төменгі сатыдағы қолданудың талаптарына байланысты иондық алмасу немесе молекулалық масса бойынша бөлу хроматографиясы сияқты әдістерді қолдана отырып, қосымша тазалау қадамдары қажет болуы мүмкін. IMAC шайырлары әдетте кіршік ретінде бірнеше айқын эндогенді ақуыздарды сақтайды. Мысалы, E. coli-де, SDS-PAGE-де шамамен 25 кДа көрінетін FKBP типті пептидил-пролил изомеразасы айқын мысал болып табылады. Бұл қоспаларды қосымша тазалау қадамдарын қолдану арқылы немесе рекомбинантты ақуызды кемшіліктері бар жасуша штаммында өндіру арқылы жоюға болады. Балама ретінде, эндогенді ақуыздарға азырақ аффинитеті бар кобальтпен зарядталған IMAC шайырларын қолдануға болады.

Байлаушы сынақтар

Полигистидиндік таңбалауды, тартымды әдіс сияқты, ақуыз-ақуыз өзара әрекеттесуін анықтау үшін де қолдануға болады. Полигистидиндік таңбалаудың, басқа таңбаларға қарағанда, тартымды әдіс үшін қолданылатын көптеген артықшылықтары бар: оның кішігірім мөлшері, тасымалдаушы матрицаларға байланысатын табиғи ақуыздардың азы және моноклоналды антидене матрицаларымен салыстырғанда тасымалдаушы матрицаның жоғары тұрақтылығы.

Флуоресцентті белгілер

Гексахистадиндік CyDye тегтері әзірленді, олар флуорофорларға жалғанған EDTA топтарымен никельдің ковалентті координациясын пайдаланып, полихистидиндік тегке қосылатын бояғыштарды жасауға мүмкіндік береді. Бұл техника ақуыздың қозғалысын және тасымалдануын қадағалауда пайдалы екені көрсетілді және Фёрстерлік резонанстық энергия тасымалы арқылы қашықтықты өлшеу үшін тиімді болуы мүмкін.

Фторгистидин белгілері

Полифторгистидин тегі in vitro аударма жүйелерінде қолданылуы туралы хабарланған. Бұл жүйеде гистидин 4-фторгистидинмен алмастырылатын кеңейтілген генетикалық код пайдаланылады. Фторланған аналог гистидин тРНК лигазасының кеңейтілген субстрат таңдаулылығы арқылы пептидтерге енгізіледі және тегтің жалпы pKa мәнін төмендетеді. Бұл, жуу буферлерінің pH-ын өзгерту арқылы, дәстүрлі полигистидин тегтерінің күрделі қоспаларында полифторгистидин тегі бар пептидтерді селективті түрде байытуға мүмкіндік береді.

Анықтау

Полигистидиндік тегті антиполигистидиндік тег антиденелері арқылы белокты анықтауға да болады, бұл субклеткалық локализация, ELISA, вестерн блоттинг және басқа иммуноаналитикалық әдістерде пайдалы. Балама ретінде, SDS PAGE немесе нативті PAGE гельдерінде металл иондары бар флуоресцентті зондтармен бояу арқылы полигистидинмен таңбаланған белокты анықтауға болады.

Бас кеңсе белгісі

Штаб-квартира таңбасында гистидин мен глутамин (HQHQHQ) кезектесіп орналасқан.

HN белгісі

HN белгісі гистидин мен аспарагин қышқылдығын (HNHNHNHNHN) кезектестіре түседі және тағы бір ғана гистидин белгісіне қарағанда ақуыз бетінде жиірек кездеседі. HN белгісі, His белгісіне қарағанда, бекітілген металл ионымен тиімдірек байланысады.

HAT белгісі

HAT белгісі – тауық лактат дегидрогеназасынан алынған пептидтік белгі (KDHLIHNVHKEEHAHAHNK), және His белгісімен салыстырғанда заряд таралуында ешқандай бағытталмағандықтан, ерігіш протеин болуы мүмкін. HAT белгісіндегі гистидиндердің орналасуы His белгісіне қарағанда жақсы қолжетімділікке мүмкіндік береді және ол иммобилизацияланған металл ионымен тиімді байланысады.