Жұмылдыру кезеңіндегі эпигенетикалық белгілердің өшінделуі мен қайта құрылуы

Кіріспе

Емшек жануарларының дамуы немесе жасуша мәдениетінде эпигенетикалық белгілерді жою және қайта құру – эпигенетикалық құбылыс.

Биологияда қайта бағдарламалау – емшек жануарларының дамуы немесе жасуша мәдениетінде ДНК метилирлеу сияқты эпигенетикалық белгілерді жою және қайта құру процесі. Мұндай реттеу жиі гистондардың балама коваленттік модификацияларымен байланысты. Эпигенетикалық белгілердің кең көлемде (10%-дан 100%-ға дейін) және жылдам (сағаттардан бірнеше күнге дейін) қайта бағдарламалануы емшек жануарларының өмір циклінің үш кезеңінде жүреді. Эпигенетикалық белгілердің шамамен 100% жұмыртқа клеткасы сперматозоидпен ұрықтанғаннан кейін дамудың алғашқы кезеңдерінде екі қысқа мерзім ішінде қайта бағдарламаланады. Сонымен қатар, гиппокамптың нейрондарынан ДНК метилирлеуінің шамамен 10% күшті қорқыныш жады қалыптасқанда тез өзгеруі мүмкін. Емшек жануарларында ұрықтандырудан кейін ДНК метилирлеу үлгілері көбінесе жойылады, содан кейін ерте эмбриональды даму кезінде қайта құрылады. Ата-аналардан келген метилирлеудің көбісі алдымен ерте эмбриогенез кезінде, содан кейін гаметогенез кезінде жойылады, әр ретте деметилдену және реметилдену процестері жүзеге асырылады. Ерте эмбриогенездегі деметилдену имплантацияға дейінгі кезеңде өтеді. Сперматозоид жұмыртқа клеткасын ұрықтандырып, зигота құрғаннан кейін, әкелік ДНК-ның жылдам деметилденуі және аналық ДНК-ның баяу деметилденуі метилирленбеген морула пайда болғанға дейін жүреді. Бластоцист пайда болғаннан кейін метилирлеу басталуы мүмкін, ал эпибласт пайда болғаннан кейін эмбрионның имплантация сатысына дейін метилирлеу толқыны жүзеге асырылады. Гаметогенез кезінде бастапқы ұрықтық жасушаларда (ПҰЖ) тағы бір жылдам және толық деметилдену кезеңі жүреді. ПҰЖ-дан басқа, имплантациядан кейінгі кезеңде соматикалық жасушалардағы метилирлеу үлгілері кезеңдік және тіндік ерекшеліктерге ие, бұл әрбір жеке жасуша түрін анықтайтын және ұзақ уақыт бойы тұрақты болатын өзгерістерге байланысты.

Эмбриондардың дамуы

Тышқан сперматозоидтарының геномдары ДНК-дағы CpG сайттарында 80–90% метилирленген, бұл шамамен 20 миллион метилирленген сайтты құрайды. Ұрықтандырудан кейін аталық хромосома алты сағат ішінде ДНК репликациясына дейін белсенді процесс арқылы дерлік толық деметилденеді (суреттегі көк сызық). Ересекті ооцитте оның CpG сайттарының шамамен 40% метилирленген. Аналық хромосоманың деметилденуі негізінен аналық ДНК-ға әсер ететін метилдеуші ферменттердің тоқтатылуы және репликация кезінде метилденген аналық ДНК-ның сұйытылуы арқылы жүзеге асады (суреттегі қызыл сызық). Морулада (16 жасушалық сатыда) ДНК метилирленуінің азын ғана мөлшері бар (суреттегі қара сызық). Метилирлеу бластоцисте ұрықтандырудан кейін 3,5 күннен бастап арта бастайды, ал метилирлеудің үлкен толқыны эпибласта 4,5–5,5 күндері пайда болады, 12%-дан 62%-ға дейін метилирленуге жетеді және жатырға имплантациядан кейін ең жоғары деңгейге жетеді. Ұрықтанғаннан кейін жетінші күні жаңа пайда болған бастапқы герм жасушалары (PGC) қалған соматикалық жасушалардан бөлініп шығады. Бұл кезде PGC-нің метилирлеу деңгейі соматикалық жасушалар деңгейімен шамалас болады. Имплантацияланған эмбриондағы жаңадан пайда болған бастапқы герм жасушалары (PGC) соматикалық жасушалардан дамиды. Бұл кезде PGC-де метилирлеу деңгейі жоғары болады. Бұл жасушалар эпибластан гонадтық қыртысқа қарай көшіп кетеді. Жасушалар тез көбейеді және екі толқынмен деметилдену процесін бастайды. Бірінші толқында деметилдену репликативті сұйыту арқылы жүзеге асады, ал екінші толқында деметилдену белсенді процесс арқылы жүзеге асады. Екінші толқын белгілі бір локустардың деметилденуіне әкеледі. Бұл кезде PGC геномдары бүкіл өмірлік циклдағы кез келген жасушаның ең төменгі ДНК метилирлеу деңгейін көрсетеді [эмбрионалды 13,5 күні (E13,5), осы бөлімдегі екінші суретті қараңыз]. Ұрықтанғаннан кейін жаңа түзілген эмбрионның кейбір жасушалары гермдік қыртысқа көшіп, ақырында келесі ұрпақтың герм жасушаларына (сперматозоидтар мен ооциттерге) айналады. Геномдық импринтинг құбылысына байланысты аналық және аталық геномдар әртүрлі белгіленеді және олар гермдік желі арқылы өтетін сайын дұрыс қайта бағдарламалануы керек. Сондықтан гаметогенез процесінде бастапқы герм жасушаларының бастапқы екі ата-аналық ДНК метилирлеу үлгілері жойылып, оларды ата-ананың жынысына қарай қайта құру керек. Ұрықтандырудан кейін аталық және аналық геномдар олардың эпигенетикалық белгілерін жою және тотипотенттілікті алу үшін деметилдендіріледі. Бұл кезде асимметрия пайда болады: еркек пронуклеус тез және белсенді деметилденуге ұшырайды. Ал әйел пронуклеусы бірізді жасушалық бөліну кезінде пассивті түрде деметилденеді. ДНК деметилдену процесіне базалық экзизия жөндеу және басқа да ДНК жөндеуге негізделген механизмдер қатысады. Бұл процестің жаһандық сипатына қарамастан, оны болдырмайтын белгілі бір тізбектер бар, мысалы, импринттелген гендермен, ретротранспозондармен және центромерлік гетерохроматинмен байланысты дифференциалды метилирленген аймақтар (DMRS). Эмбрионды толыққанды организмге айналдыру үшін реметилдеу тағы да қажет. Имплантацияға дейінгі эмбриондарды *in vitro* түрлендіру импринттелген локустардағы метилирлеу үлгілерін бұзады және клондалған жануарларда маңызды рөл атқарады.

The mouse sperm genome is 80–90% methylated at its CpG sites in DNA, amounting to about 20 million methylated sites. After fertilization, the paternal chromosome is almost completely demethylated in six hours by an active process, before DNA replication (blue line in Figure). In the mature oocyte, about 40% of its CpG sites are methylated. Demethylation of the maternal chromosome largely takes place by blockage of the methylating enzymes from acting on maternal origin DNA and by dilution of the methylated maternal DNA during replication (red line in Figure). The morula (at the 16 cell stage), has only a small amount of DNA methylation (black line in Figure). Methylation begins to increase at 3.5 days after fertilization in the blastocyst, and a large wave of methylation then occurs on days 4.5 to 5.5 in the epiblast, going from 12% to 62% methylation, and reaching maximum level after implantation in the uterus. By day seven after fertilization, the newly formed primordial germ cells (PGC) in the implanted embryo segregate from the remaining somatic cells. At this point the PGCs have about the same level of methylation as the somatic cells. The newly formed primordial germ cells (PGC) in the implanted embryo devolve from the somatic cells. At this point the PGCs have high levels of methylation. These cells migrate from the epiblast toward the gonadal ridge. Now the cells are rapidly proliferating and beginning demethylation in two waves. In the first wave, demethylation is by replicative dilution, but in the second wave demethylation is by an active process. The second wave leads to demethylation of specific loci. At this point the PGC genomes display the lowest levels of DNA methylation of any cells in the entire life cycle [at embryonic day 13.5 (E13.5), see the second figure in this section]. After fertilization some cells of the newly formed embryo migrate to the germinal ridge and will eventually become the germ cells (sperm and oocytes) of the next generation. Due to the phenomenon of genomic imprinting, maternal and paternal genomes are differentially marked and must be properly reprogrammed every time they pass through the germline. Therefore, during the process of gametogenesis the primordial germ cells must have their original biparental DNA methylation patterns erased and re established based on the sex of the transmitting parent. After fertilization, the paternal and maternal genomes are demethylated in order to erase their epigenetic signatures and acquire totipotency. There is asymmetry at this point: the male pronucleus undergoes a quick and active demethylation. Meanwhile the female pronucleus is demethylated passively during consecutive cell divisions. The process of DNA demethylation involves base excision repair and likely other DNA repair based mechanisms. Despite the global nature of this process, there are certain sequences that avoid it, such as differentially methylated regions (DMRS) associated with imprinted genes, retrotransposons and centromeric heterochromatin. Remethylation is needed again to differentiate the embryo into a complete organism. In vitro manipulation of pre implantation embryos has been shown to disrupt methylation patterns at imprinted loci and plays a crucial role in cloned animals.

Оқу мен есте сақтау

Оқу және есте сақтау тұрақтылық деңгейлеріне ие, бұл оларды ойлау, тіл және сана сияқты уақытша болатын басқа психикалық процестерден ерекшелендіреді. Оқу және есте сақтау баяу жинақталуы мүмкін (көбейту кестесі) немесе жылдам (қайыпқан пешке тию), бірақ бір рет қол жеткізілгеннен кейін ұзақ уақыт бойы саналы түрде қолдануға шақырылуы мүмкін. Контекстік қорқыныш жағдайына бір рет тап болған егеуқырлар ерекше күшті ұзақ мерзімді есте сақтау қабілетін жасайды. Жақсы оқытылғаннан кейін 24 сағат өткен соң, егеуқырлардың гиппокамп нейрондарының геномдарының 9,17% -ы әртүрлі метилирленгені анықталды. Бұл жаттығудан кейін 24 сағат ішінде 2000-нан астам әртүрлі метилирленген гендерді, ал 500-ден астам ген деметилирленгенін қамтиды. Мидың гиппокамп аймағы – контекстік қорқыныш естеліктері алғаш рет сақталанатын жер (мидің суретін қараңыз, осы бөлім), бірақ бұл сақтау уақытша және гиппокампта қалып қоймайды. Егеуқырларда контекстік қорқыныш жағдайы, жаттығудан кейін бір күн өткенде гиппокампты гиппокампектомия жасау арқылы жойылады, бірақ егеуқырлар жаттығу мен гиппокампектомия арасында ұзақ кешігу (28 күн) болған жағдайда контекстік қорқыныштың айтарлықтай бөлігін сақтайды.

Молекулалық сатылар

ДНК метиломын қайта бағдарламалау үшін үш молекулалық кезең қажет. 1-кезең: Тарту. Қайта бағдарламалауға қажетті ферменттер деметилдену немесе метилденуді қажет ететін геномдық орындарға тартылады. 2-кезең: Іске асыру. Алғашқы ферменттік реакциялар жүзеге асады. Метилдену жағдайында, бұл цитозиннің 5-метилцитозинге метилденуіне әкелетін қысқа кезең. 3-кезең: ДНҚ негіздерін жою арқылы жөндеу. Деметилденудің аралық өнімдері негіздерді жою арқылы ДНҚ жөндеу жолының арнайы ферменттерімен катализденеді, олар ДНК тізбегіндегі цитозиннің қалпына келтірілуін қамтамасыз етеді. Осы бөлімдегі сурет он бір транслокациялық метилцитозин диоксигеназаларының (ТЕТ) 5-метилцитозиннен цитозинге деметилденудегі орталық ролін көрсетеді. 2018 жылы шолуда көрсетілгендей, толық ұзындығы бар канондық TET1 изоформасы негізінен ерте эмбриондарда, эмбриондық сақталған жасушаларда және бастапқы ұрық жасушаларында (ҰЖ) кездеседі. Көптеген соматикалық тіндерде, кем дегенде егежкте, басым TET1 изоформасы балама промоторды пайдалану арқылы пайда болады, ол қысқа транскрипт пен TET1s деп аталатын уысқан белокты тудырады. TET3 изоформалары – толық формасы TET3FL, қысқа формасы TET3s және ооциттер мен нейрондарда кездесетін TET3o. TET3o балама промоторды пайдалану арқылы құрылады және 11 аминқышқылының кодировкасын қамтитын қосымша бірінші N-терминалды экзонды қамтиды. TET3o тек ооциттер мен нейрондарда ғана кездеседі және эмбриондық сақталған жасушаларда немесе басқа жасуша түрлерінде немесе ересек егежктің тіндерінде экспрессияланбайды. TET1 экспрессиясы ооциттер мен зиготаларда анықтау қиын, ал TET2 орташа деңгейде ғана экспрессияланады, ал TET3 варианты TET3o ооциттер мен зиготаларда өте жоғары экспрессия деңгейін көрсетеді, бірақ 2 жасушалық сатысында дерлік жоқ. TET3o, нейрондарда, ооциттерде және зиготаларда бір жасушалық сатысында жоғары, осы жасушаларда өте кең ауқымды жылдам деметилдену жүрген кезде қолданылатын негізгі ТЕТ ферменті болуы мүмкін.

ТЭТ-ті DNA-ға қабылдау

ТЭТ ферменттері тартылған кезде ғана 5 метилцитозинге арнайы байланыспайды. Тартылмаған немесе бағытталмаған жағдайда, ТЭТ1 геном бойынша жоғары CG промоторларына және CpG аралдарына (CGIs) CXXC домені арқылы байланысады, ол метилденбеген CGIs-ді тани алады. ТЭТ2 ДНК-дағы 5 метилцитозинге жақындық танытпайды. Нейрондарда басым түрде экспрессияланатын толық ұзындығы ТЭТ3-тің CXXC домені, C-сі 5 карбоксицитозинге (5caC) айналған CpG-лерге ең мықты байланысады. Дегенмен, ол метилденбеген CpG-лерге де байланысады, бұл алдыңғы суретте көрсетілген. ТЭТ ферменті деметилденуді бастау үшін алдымен ДНК-дағы метилденген CpG сайтына тартылуы керек. ДНК-дағы метилденген цитозинге ТЭТ ферментін тартуға қатысатын екі ақуыз – OGG1 (суретті қараңыз: ДНК деметилденуінің басталуы).

ОГГ1

Оксигоганин гликозилазасы (OGG1) окисденуге ұшыраған зақымдалған 8-OHdG негізін қалпына келтірудегі алғашқы қадамды катализдейді. OGG1 8-OHdG-ді сызықтық ДНК бойымен жылдам қозғалып, 0,1 секунд ішінде 1000 негіз жұбынан тұратын ДНК-да табады. OGG1 өте жылдам 8-OHdG-ні табады. OGG1 ақуыздары тотығуға ұшыраған зақымдалған ДНК-мен шамамен 6 секундтік жартылай максималды уақытта байланысады. OGG1 8-OHdG-ні тапқанда конформациясын өзгертеді және OGG1 байланысу қалтасында 8-OHdG-мен кешен құрайды. OGG1 8-OHdG-ні бірден алып тастамайды. HeLa жасушаларында in vitro жағдайында 8-OHdG-ні жартылай максималды түрде алып тастауға шамамен 30 минут, ал сәулеленген тышқандардың бауырында 11 минут уақыт кетеді. Реактивті оттегі түрлерінің ДНК-ны тотықтыруы метилденген CpG сайтындағы гуанинде, 5-метилцитозинге жақын орналасқан гуанин негіздерінің иондану потенциалының төмендеуіне байланысты басымдықпен жүзеге асады. TET1 8-OHdG-ге байланысқан OGG1-ге байланысады (оған тартылады) (суретті қараңыз). EGR1 нейрондық белсенділік арқылы жылдам түрде индукцияланады. Ересек жасында EGR1 мидың көп бөлігінде экспрессияланады, мидың бірнеше маңызды аймақтарында, соның ішінде ортаңғы префронтальді қабықта, стриатумда, гиппокампта және амигдаладағы базалық деңгейдегі экспрессияны сақтайды. Осы жетістігі үшін ол 2012 жылы Шиня Яманакамен бірге медицина саласындағы Нобель сыйлығын алды. Яманака алғаш рет (2006 жылы) Гурдон ашқан соматикалық жасуша ядролық трансфері немесе ооцит негізделген қайта бағдарламалау процесін (төменде қараңыз) анықталған факторлармен (Oct4, Sox2, Klf4 және c Myc) қайта жаңартуға болатынын көрсетті, бұл индукцияланған плюрипотентті стемдік жасушаларды (iPSC) жасауға мүмкіндік берді. Гендердің басқа комбинациялары да қолданылды, соның ішінде LIN25.

Қайта бағдарламалау кезеңдері

Жасуша тағдырын өзгертуге болатыны анықталғаннан кейін, жасушаны қайта бағдарламалау кезінде қандай оқиғалар тізбегі жүзеге асады деген сұрақ туындайды. iPSC-нің қайта бағдарламалаудың соңғы нәтижесі морфология, көбею, гендік экспрессия, көпұрықтылық және теломераза активтілігі тұрғысынан ұқсас болғандықтан, қайта бағдарламалаудың қай фазасында екенін анықтау үшін генетикалық және морфологиялық маркерлер пайдаланылды. Қайта бағдарламалау үш фазаға бөлінеді: бастама, жетілу және тұрақтандыру.

Іске қосу

Басталу кезеңі жасуша түріне тән гендердің төмендеуімен және плюрипотентті гендердің жоғарылауымен байланысты. Басталу кезеңінің аяқталғанын көрсететін басты белгі – плюрипотенттілікпен байланысты алғашқы гендердің экспрессиялануы. Бұл Oct 4 немесе Homeobox NANOG ақуызының экспрессиясын, мезенхималық-эпителиялық өту (MET) процесінде апоптоз бен қартаюдың жоғалуын қамтиды. Егер жасуша бір соматикалық жасушадан екіншісіне тікелей қайта бағдарламаланса, әрбір жасуша түріне қатысты гендер тиісінше жоғары және төмен реттеле бастайды. Қайта бағдарламалау соматикалық эпитиптің дамуынан өзгеше, себебі соматикалық эпитиптер организм даму кезеңінен өткен соң өзгеруі мүмкін. Соматикалық жасуша ядросын көшіру кезінде ооцит соматикалық жасуша ядросындағы тіндікке тән гендерді өшіріп, эмбриональды гендерді қайта қосады. Бұл процесс клондау арқылы дәлелденген, мысалы, Джон Гурдонның қосақа бақаларын клондауы арқылы. Атап айтқанда, осы оқиғалар жасуша тағдырының қайтымды процесс екенін көрсетті.

Жасушалық синтез

[[Файл:Клеткалық бірігу.png|thumb|Клеткалық бірігу. Екі жасуша бірігіп, ядролық ДНҚ-ны бөлісе алады, гетерокарионды құрайды, содан кейін нуклеаза бірігіп, гибридті жасайды.

Анықталған факторлар

[[Файл:Таңдалған факторлар.png|thumb|Таңдалған факторлар. МикроРНК, транскрипция факторлары, эпигенетикалық маркерлер және басқа да шағын молекулалар немесе олардың комбинациясы басқа гендердің экспрессиясын тудыру арқылы жасушалық қайта бағдарламалауға ықпал етеді. LIN25 қайта бағдарламалау тиімділігін арттыруға көмектеседі. МикроРНК және басқа да шағын молекулаларға негізделген процестер соматикалық жасушалардан плюрипотенттікке дифференциациялау тиімділігін арттыру үшін қолданылған. Активацияланған цитидин деаминазасын (AID), TET ферменттерін (TET) және ДНК метилтрансферазасын (DNMT) пайдалану жетілу фазасынан бастап тұрақтандыру сатысына дейін жүзеге асырылады. Oct4-тің тіпті шағын дозада қолданылуы да плюрипотенттікке дифференциациялануға мүмкіндік береді. Oct4, FGF4 экспрессиясы үшін Sox2-мен бірлесіп, дифференциацияға көмектеседі. Sox2 – бұл дің жасушаларының плюрипотенттілігін сақтауға қолданылатын ген. Oct4 және Sox2 бірлесіп, плюрипотенттікке қатысты жүздеген гендерді реттейді. Жасушалық қайта бағдарламалауда c-Myc жасушалық циклдың прогрессиясы, апоптоз және одан әрі дифференциация үшін жасушалық трансформация процесі үшін қолданылады.

НАНОГ

Гомеобокс ақуызы NANOG (NANOG) – пларипотенттілікті сақтап, жасушалық дифференциация факторларын басу арқылы iPSC-лерді жасау тиімділігін арттыратын транскрипция факторы. NANOG хроматинге қолжетімділікті арттыру арқылы, H3K27me3 сияқты гистон маркерлерін басу арқылы әсер етеді. NANOG транскрипцияда қолданылатын Oct4, Sox2 және Esrrb-ді тартуға көмектеседі, сондай-ақ хроматинге қолжетімділікті қамтамасыз ету үшін Брахмамен байланысты ген 1 (BRG1) ақуызын тартады.

C/EBPα

CEBPA – жасушаларды тек iPSC-ге ғана емес, басқа жасушаларға да қайта бағдарламалау кезінде жиі қолданылатын фактор. C/EBPα лимфоидты жасушаны миелоидты жасушаға тікелей қайта бағдарламалау барысында бірден-бір транзакциялық фактор екенін көрсетті. Қайта бағдарламалаудың нәтижесіндегі өнімділіктің өзгеруіне және соңғы өнімнің функционалдық ерекшеліктеріне әсер ететін факторларға генетикалық фон, тіндік көз, қайта бағдарламалау факторларының стехиометриясы және жасуша өсірумен байланысты стресс факторлары жатады.