Эпигенетическое перепрограммирование в развитии млекопитающих и клеточной культуре.

Введение

Стирание и ремоделирование эпигенетических отметок во время развития млекопитающих или в клеточной культуре – эпигенетическое явление.

В биологии перепрограммирование относится к стиранию и ремоделированию эпигенетических отметок, таких как метилирование ДНК, во время развития млекопитающих или в клеточной культуре. Такой контроль также часто связан с альтернативными ковалентными модификациями гистонов. Перепрограммирование, которое является масштабным (от 10% до 100% эпигенетических отметок) и быстрым (от нескольких часов до нескольких дней), происходит на трех этапах жизни млекопитающих. Почти 100% эпигенетических отметок перепрограммируются в два коротких периода в начале развития после оплодотворения яйцеклетки сперматозоидом. Кроме того, почти 10% метилирования ДНК в нейронах гиппокампа может быть быстро изменено во время формирования стойкой памяти страха. После оплодотворения у млекопитающих, паттерны метилирования ДНК в значительной степени стираются и затем восстанавливаются во время раннего эмбрионального развития. Почти все метилирования, унаследованные от родителей, стираются, сначала во время раннего эмбриогенеза, а затем снова в гаметогенезе, причем каждый раз происходит деметилирование и реметилирование. Деметилирование в период раннего эмбриогенеза происходит в предимплантационный период. После того как сперматозоид оплодотворяет яйцеклетку, образуя зиготу, происходит быстрое деметилирование ДНК отцовского происхождения и более медленное деметилирование ДНК материнского происхождения до образования морулы, которая практически не содержит метилирования. После формирования бластоцисты метилирование может начаться, а с образованием эпибласта происходит волна метилирования до стадии имплантации эмбриона. Другой период быстрого и почти полного деметилирования происходит во время гаметогенеза в примордиальных зародышевых клетках (ПЗК). Помимо ПЗК, на постимплантационной стадии паттерны метилирования в соматических клетках специфичны для стадии и ткани, с изменениями, которые, предположительно, определяют каждый отдельный тип клеток и стабильно сохраняются в течение длительного времени.

Эмбриональное развитие

Геном сперматозоида мыши метилирован на 80–90% в участках CpG ДНК, что соответствует примерно 20 миллионам метилированных участков. После оплодотворения отцовская хромосома почти полностью деметилируется в течение шести часов активным процессом, предшествующим репликации ДНК (голубая линия на рисунке). В зрелой яйцеклетке около 40% участков CpG метилированы. Деметилирование материнской хромосомы происходит главным образом за счет блокирования действия метилирующих ферментов на ДНК материнского происхождения и разбавления метилированной материнской ДНК в процессе репликации (красная линия на рисунке). В моруле (на стадии 16 клеток) содержится лишь небольшое количество метилированной ДНК (черная линия на рисунке). Метилирование начинает увеличиваться через 3,5 дня после оплодотворения в бластоцисте, а затем происходит выраженная волна метилирования в эпибласте с 4,5 по 5,5 день, увеличиваясь с 12% до 62% и достигая максимального уровня после имплантации в матку. На седьмой день после оплодотворения вновь образовавшиеся примитивные зародышевые клетки (ПЗК) в имплантированном эмбрионе отделяются от остальных соматических клеток. В этот момент уровень метилирования ПЗК примерно соответствует уровню соматических клеток. Новые примитивные зародышевые клетки (ПЗК) в имплантированном эмбрионе происходят из соматических клеток. В этот момент ПЗК характеризуются высоким уровнем метилирования. Эти клетки мигрируют из эпибласта к гонадному гребню. Теперь клетки быстро пролиферируют и начинают деметилирование в две волны. В первой волне деметилирование происходит за счет репликативного разбавления, а во второй – активным процессом. Вторая волна приводит к деметилированию специфических локусов. В этот момент геномы ПЗК демонстрируют самые низкие уровни метилирования ДНК среди всех клеток на протяжении всего жизненного цикла [на эмбриональный день 13.5 (E13.5), см. вторую фигуру в этом разделе]. После оплодотворения некоторые клетки новообразованного эмбриона мигрируют к зародышевому гребню и в конечном итоге становятся зародышевыми клетками (сперматозоидами и яйцеклетками) следующего поколения. В силу феномена геномного импринтинга материнские и отцовские геномы несут дифференциальные метки и должны быть надлежащим образом перепрограммированы каждый раз, когда они проходят через зародышевую линию. Следовательно, в процессе гаметогенеза примитивные зародышевые клетки должны стереть свои исходные бипарентальные паттерны метилирования ДНК и восстановить их в соответствии с полом передающего родителя. После оплодотворения отцовский и материнский геномы деметилируются для стирания их эпигенетических сигнатур и приобретения тотипотентности. В этот момент наблюдается асимметрия: мужское пронуклеус подвергается быстрому и активному деметилированию, в то время как женское пронуклеус деметилируется пассивно в ходе последовательных клеточных делений. Процесс деметилирования ДНК включает в себя иссечение основания и, вероятно, другие механизмы, основанные на репарации ДНК. Несмотря на глобальный характер этого процесса, существуют определенные последовательности, которые избегают его, такие как дифференциально метилированные области (DMR), связанные с генами с импринтингом, ретротранспозонами и центромерным гетерохроматином. Реметилирование вновь необходимо для дифференцировки эмбриона в полноценный организм. Было показано, что манипуляции с эмбрионами до имплантации in vitro нарушают паттерны метилирования в локусах с импринтингом и играют решающую роль в клонированных животных.

The mouse sperm genome is 80–90% methylated at its CpG sites in DNA, amounting to about 20 million methylated sites. After fertilization, the paternal chromosome is almost completely demethylated in six hours by an active process, before DNA replication (blue line in Figure). In the mature oocyte, about 40% of its CpG sites are methylated. Demethylation of the maternal chromosome largely takes place by blockage of the methylating enzymes from acting on maternal origin DNA and by dilution of the methylated maternal DNA during replication (red line in Figure). The morula (at the 16 cell stage), has only a small amount of DNA methylation (black line in Figure). Methylation begins to increase at 3.5 days after fertilization in the blastocyst, and a large wave of methylation then occurs on days 4.5 to 5.5 in the epiblast, going from 12% to 62% methylation, and reaching maximum level after implantation in the uterus. By day seven after fertilization, the newly formed primordial germ cells (PGC) in the implanted embryo segregate from the remaining somatic cells. At this point the PGCs have about the same level of methylation as the somatic cells. The newly formed primordial germ cells (PGC) in the implanted embryo devolve from the somatic cells. At this point the PGCs have high levels of methylation. These cells migrate from the epiblast toward the gonadal ridge. Now the cells are rapidly proliferating and beginning demethylation in two waves. In the first wave, demethylation is by replicative dilution, but in the second wave demethylation is by an active process. The second wave leads to demethylation of specific loci. At this point the PGC genomes display the lowest levels of DNA methylation of any cells in the entire life cycle [at embryonic day 13.5 (E13.5), see the second figure in this section]. After fertilization some cells of the newly formed embryo migrate to the germinal ridge and will eventually become the germ cells (sperm and oocytes) of the next generation. Due to the phenomenon of genomic imprinting, maternal and paternal genomes are differentially marked and must be properly reprogrammed every time they pass through the germline. Therefore, during the process of gametogenesis the primordial germ cells must have their original biparental DNA methylation patterns erased and re established based on the sex of the transmitting parent. After fertilization, the paternal and maternal genomes are demethylated in order to erase their epigenetic signatures and acquire totipotency. There is asymmetry at this point: the male pronucleus undergoes a quick and active demethylation. Meanwhile the female pronucleus is demethylated passively during consecutive cell divisions. The process of DNA demethylation involves base excision repair and likely other DNA repair based mechanisms. Despite the global nature of this process, there are certain sequences that avoid it, such as differentially methylated regions (DMRS) associated with imprinted genes, retrotransposons and centromeric heterochromatin. Remethylation is needed again to differentiate the embryo into a complete organism. In vitro manipulation of pre implantation embryos has been shown to disrupt methylation patterns at imprinted loci and plays a crucial role in cloned animals.

Умение учиться и память

Обучение и память обладают уровнями устойчивости, отличающимися от других психических процессов, таких как мышление, язык и сознание, которые носят временный характер. Обучение и память могут накапливаться медленно (например, таблицы умножения) или быстро (например, прикосновение к горячей плите), но однажды приобретенные, могут извлекаться в сознание для длительного использования. Крысы, подвергшиеся однократному контекстуальному обусловливанию страхом, формируют особенно прочную долговременную память. Через 24 часа после тренировки было обнаружено, что 9,17% генов в геномах нейронов гиппокампа были дифференциально метилированы. Это включало более 2000 дифференциально метилированных генов через 24 часа после тренировки, при этом более 500 генов подверглись деметилированию. Область гиппокампа мозга является местом первичного хранения контекстуальных воспоминаний о страхе (см. схему мозга в этом разделе), однако это хранение является временным и не сохраняется в гиппокампе. У крыс контекстуальное обусловливание страхом устраняется при проведении гиппокампэктомии всего через 1 день после обучения, но значительная часть контекстуального страха сохраняется, если между обучением и гиппокампэктомией выдерживается длительная задержка (28 дней).

Молекулярные стадии

Для перепрограммирования метилома ДНК требуются три молекулярных стадии. Стадия 1: Рекрутинг. Ферменты, необходимые для перепрограммирования, рекрутируются к участкам генома, требующим деметилирования или метилирования. Стадия 2: Реализация. Происходят начальные ферментативные реакции. В случае метилирования это короткий этап, приводящий к метилированию цитозина в 5-метилцитозин. Стадия 3: Репарация ДНК по пути вырезания оснований. Промежуточные продукты деметилирования катализируются специфическими ферментами пути репарации ДНК по вырезанию оснований, которые в конечном итоге восстанавливают цитозин в последовательности ДНК. Рисунок в этом разделе демонстрирует центральную роль десяти одиннадцати-транслокационных метилцитозин-диоксигеназ (ТET) в деметилировании 5-метилцитозина с образованием цитозина. Как было показано в обзоре 2018 года, полноразмерная каноническая изоформа TET1 практически ограничена ранними эмбрионами, эмбриональными стволовыми клетками и примордиальными зародышевыми клетками (ПЗК). Доминирующая изоформа TET1 в большинстве соматических тканей, по крайней мере, у мышей, образуется в результате использования альтернативного промотора, что приводит к короткому транскрипту и усеченному белку, обозначенному как TET1s. Изоформы TET3 включают полноразмерную форму TET3FL, короткий сплайс-вариант TET3s и форму, встречающуюся в ооцитах и нейронах, обозначенную как TET3o. TET3o образуется при использовании альтернативного промотора и содержит дополнительный первый N-концевой экзон, кодирующий 11 аминокислот. TET3o присутствует только в ооцитах и нейронах и не экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках или в каких-либо других типах клеток или тканях взрослой мыши. В то время как экспрессия TET1 едва обнаруживается в ооцитах и зиготах, а TET2 экспрессируется умеренно, вариант TET3 TET3o демонстрирует чрезвычайно высокие уровни экспрессии в ооцитах и зиготах, но практически отсутствует на 2-клеточной стадии. Возможно, что TET3o, с высокой экспрессией в нейронах, ооцитах и зиготах на одноклеточной стадии, является основным ферментом TET, используемым при крупномасштабном быстром деметилировании в этих клетках.

Наем ТЭТ в ДНК

Ферменты TET не связываются специфически с 5-метилцитозином, кроме случаев рекрутинга. Без рекрутинга или таргетирования TET1 преимущественно связывается с промоторами с высоким содержанием CG и CpG-островами (CGIs) во всем геноме посредством своего CXXC-домена, который способен распознавать неметилированные CGIs. TET2 не проявляет сродства к 5-метилцитозину в ДНК. CXXC-домен полноразмерной TET3, являющейся преобладающей формой, экспрессируемой в нейронах, наиболее прочно связывается с CpG, где цитозин преобразован в 5-карбоксицитозин (5caC). Однако он также связывается с неметилированными CpG, как показано на предыдущей схеме. Для инициации деметилирования ферменту TET необходимо сначала быть рекрутированным к метилированному участку CpG в ДНК. Два белка, показанных как рекрутирующих фермент TET к метилированному цитозину в ДНК, – это OGG1 (см. схему «Инициирование деметилирования ДНК»).

ОГГ1

Оксигуанин-гликозилаза (OGG1) катализирует первый этап в репарации оснований по механизму иссечения, удаляя окислительно поврежденное основание 8-OHdG. OGG1 обнаруживает 8-OHdG, скользя вдоль линейной ДНК со скоростью 1000 пар оснований за 0,1 секунды. OGG1 очень быстро находит 8-OHdG. Белки OGG1 связываются с окислительно поврежденной ДНК с временем достижения полумаксимального связывания около 6 секунд. Когда OGG1 находит 8-OHdG, он изменяет конформацию и образует комплекс с 8-OHdG в связывающем кармане OGG1. OGG1 не немедленно удаляет 8-OHdG. Достижение полумаксимального удаления 8-OHdG занимает около 30 минут в клетках HeLa in vitro или около 11 минут в печени облученных мышей. Окисление ДНК реактивными формами кислорода предпочтительно происходит в гуанине в метилированном CpG-сайте из-за пониженного потенциала ионизации гуаниновых оснований, соседствующих с 5-метилцитозином. TET1 связывается (рекрутируется) к OGG1, связанному с 8-OHdG (см. рисунок). EGR1 может быть быстро индуцирован нейронной активностью. У взрослых EGR1 широко экспрессируется во всем мозге, поддерживая базовый уровень экспрессии в нескольких ключевых областях мозга, включая медиальную префронтальную кору, стриатум, гиппокамп и миндалину. За это достижение он получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине 2012 года совместно с Синья Яманакой. Яманака первым продемонстрировал (в 2006 году), что этот процесс перепрограммирования соматических клеток путем переноса ядра или на основе ооцитов (см. ниже), открытый Гурдоном, может быть воспроизведен (у мышей) с помощью определенных факторов (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc) для генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Также использовались другие комбинации генов, включая LIN25.

Фазы перепрограммирования

С открытием того, что судьба клетки может быть изменена, возник вопрос о последовательности событий, происходящих при перепрограммировании клетки. Поскольку конечный продукт перепрограммирования iPSC был схож по морфологии, пролиферации, экспрессии генов, плюрипотентности и активности теломеразы, для определения фазы перепрограммирования использовались генетические и морфологические маркеры. Перепрограммирование определяется как состоящее из трех фаз: инициации, созревания и стабилизации.

Введение

Фаза инициирования связана с подавлением экспрессии генов, специфичных для данного типа клеток, и активацией экспрессии плюрипотентных генов. Главным признаком завершения фазы инициирования является экспрессия первых генов, связанных с плюрипотентностью. Это включает экспрессию Oct 4 или белка Homeobox NANOG, в то время как клетка претерпевает мезенхимально-эпителиальный переход (MET), а также происходит потеря апоптоза и старения. Если клетка непосредственно перепрограммируется из одного соматического типа в другой, гены, связанные с каждым типом клеток, начинают соответственно повышаться и понижаться в экспрессии. Перепрограммирование отличается от развития соматического эпитипа, поскольку соматические эпитипы могут потенциально изменяться после того, как организм завершил стадию развития. Во время переноса ядра соматической клетки, ооцит подавляет экспрессию генов, специфичных для тканей в ядре соматической клетки, и вновь активирует экспрессию генов, специфичных для эмбриона. Этот процесс был продемонстрирован посредством клонирования, как показал Джон Гордон на примере головастиков. Эти события показали, что судьба клетки – обратимый процесс.

Клеточный синтез

[[Файл:Соединение клеток.png|мини|Соединение клеток. Две клетки могут сливаться, объединяя ядерную ДНК и образуя гетерокарион, который затем может подвергнуться слиянию ядер, формируя гибрид.

Определенные факторы

[[Файл:Определенные факторы.png|thumb|Определяющие факторы. Добавление микроРНК, факторов транскрипции, эпигенетических маркеров и других малых молекул, или их комбинация, может индуцировать клеточное перепрограммирование, вызывая экспрессию других генов. LIN25 способствует повышению эффективности перепрограммирования. Использование микроРНК и других процессов, управляемых малыми молекулами, применяется для увеличения эффективности дифференцировки соматических клеток в плюрипотентные. Это достигается с использованием активированной цитидиновой деаминазы (AID), ферментов TET (TET) и ДНК-метилтрансфераз (DNMT), начиная с фазы созревания и переходя в стадию стабилизации. Даже небольшое увеличение уровня Oct4 позволяет инициировать дифференцировку в плюрипотентность. Oct4 действует совместно с Sox2 для экспрессии FGF4, что может способствовать дифференцировке. Sox2 – ген, используемый для поддержания плюрипотентности в стволовых клетках. Oct4 и Sox2 совместно регулируют сотни генов, участвующих в плюрипотентности. В клеточном перепрограммировании c-Myc используется для прогрессии клеточного цикла, апоптоза и клеточной трансформации, способствуя дальнейшей дифференцировке.

НАНОГ

Гомеобоксный белок NANOG (NANOG) — это фактор транскрипции, используемый для повышения эффективности получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) за счет поддержания плюрипотентности и подавления факторов, определяющих клеточную дифференцировку. NANOG действует, способствуя доступности хроматина путем подавления маркеров гистонов, таких как H3K27me3. NANOG способствует рекрутированию Oct4, Sox2 и Esrrb, используемых в транскрипции, а также рекрутирует ген, связанный с Брахмой 1 (BRG1), для обеспечения доступности хроматина.

C/EBPα

CEBPA – часто используемый фактор при перепрограммировании клеток не только в iPSC, но и в другие типы клеток. C/EBPα продемонстрировал свою способность выступать в качестве единственного трансляционного фактора при прямой перепрограммировании лимфоидной клетки в миелоидную клетку. Факторы, влияющие на эффективность перепрограммирования и функциональные характеристики конечных продуктов, включают генетический фон, источник ткани, стехиометрию факторов перепрограммирования и стрессовые факторы, связанные с культивированием клеток.