Кіріспе
Зерттеу үшін ДНК үлгісін көбейтудің зертханалық әдісі Полимераза тізбекті реакциясы (ПТР) – белгілі бір ДНК үлгісінің миллионнан миллиардқа дейінгі көшірмелерін жылдам жасауға кеңінен қолданылатын әдіс, бұл ғалымдарға ДНК-ның өте кішкентай үлгісін (немесе оның бір бөлігін) толық зерттеуге мүмкіндік беру үшін жеткілікті күшейтуге мүмкіндік береді. ПТР 1983 жылы Cetus Corporation компаниясында американдық биохимик Кэри Муллис ойлап тапты. Муллис пен биохимик Майкл Смит, ДНК-ны өңдеудің басқа да маңызды тәсілдерін жасаған, 1993 жылы химия саласындағы Нобель сыйлығын бірлесіп алды. ПТР әдістерінің көпшілігі термиялық циклға негізделген. Термиялық цикл реактивтерді қайталанатын қыздыру және салқындату циклдеріне ұшыратады, бұл әртүрлі температураға тәуелді реакцияларға мүмкіндік береді, атап айтқанда, ДНК балқуы және ферменттермен басқарылатын ДНК репликациясы. ПТР-да екі негізгі реагент қолданылады: праймерлер (мақсатты ДНК аймағына толықтыратын реттілік құрайтын, олигонуклеотидтер деп аталатын қысқа бір тізбекті ДНК фрагменттері) және ДНК полимераза. ПТР-ның бірінші кезеңінде ДНК қос спиралінің екі тізбегі жоғары температурада нуклеин қышқылының денатурация процесінде физикалық түрде бөлінеді. Екінші кезеңде температура төмендейді және праймерлер ДНК-ның толықтыратын тізбектеріне байланады. Содан кейін екі ДНК тізбегі ДНК полимеразаның үлгісіне айналып, ферменттер арқылы ДНК-ның құрылыс блоктары – еркін нуклеотидтерден жаңа ДНК тізбегін құрастырады. ПТР-ның дамуы кезінде алынған ДНК-ның өзі репликация үшін үлгі ретінде қолданылады, бұл тізбекті реакцияны іске қосады, онда бастапқы ДНК үлгісі экспоненциалды түрде күшейтіледі. ПТР-дың көптеген қолданылуларында жылу тұрақты ДНК полимеразасы, мысалы, Thermus aquaticus бактериясынан оқшауланған Taq полимеразасы қолданылады. Егер қолданылған полимераза жылуға сезімтал болса, ол денатурация кезеңінің жоғары температурасында денатурацияланады. Taq полимеразасын пайдаланар алдында ДНК полимеразасын әр цикл сайын қолмен қосу қажет болды, бұл қиын және қымбат процесс болды. Техниканың қолданылулары: ДНК-ны реттілікке түсіру, генді клондау және манипуляциялау, генді мутагенез; ДНК-ға негізделген филогенияларды құру немесе гендердің функционалдық талдауы; генетикалық ауруларды диагностикалау және бақылау; көне ДНК-ны күшейту; күшейтілген өнімнің мөлшері реакцияда қолда бар субстраттармен анықталады, ол реакция дамуымен шектеледі. Негізгі ПТР жинағына бірнеше компоненттер мен реагенттер қажет, соның ішінде: күшейтілетін ДНК-ның мақсатты аймағын қамтитын ДНК үлгісі; ДНК полимераза, жаңа ДНК тізбектерін полимерлейтін фермент; ыстыққа төзімді Taq полимеразасы, өйткені ол жоғары температурадағы ДНК денатурациясы кезінде бүтін болып қалуы мүмкін; ДНК-ның екі тізбегіне толықтыратын екі ДНК праймері (ДНК полимеразасы тек ДНК-ның қос тізбекті аймағына байлана алады және одан ұзара алады; праймерлер болмаса, полимераза байлана алатын екі тізбекті бастау орны жоқ); ДНК-ның мақсатты аймағына толықтыратын арнайы праймерлер алдын ала таңдалады және көбінесе зертханада немесе коммерциялық биохимиялық жеткізушілерден жасалады немесе сатып алынады; дезоксинуклеозид трифосфаттары немесе dNTP (кейде "дезоксинуклеотид трифосфаттары" деп аталады; ДНК полимеразасы жаңа ДНК тізбегін синтездеу үшін қолданатын нуклеотидтер, құрылыс блоктары); ДНК полимеразасының оңтайлы активтілігі мен тұрақтылығы үшін қолайлы химиялық ортаны қамтамасыз ететін буферлік ерітінді; әдетте магний (Mg) немесе марганец (Mn) иондары, ең көп қолданылатыны Mg2+, бірақ Mn2+ ДНК мутагенезіне қатысты ПТР үшін қолданылуы мүмкін, өйткені жоғары Mn2+ концентрациясы ДНК синтезі кезінде қателердің көбеюіне әкеледі; және әдетте калий (K) иондары.
The polymerase chain reaction (PCR) is a method widely used to make millions to billions of copies of a specific DNA sample rapidly, allowing scientists to amplify a very small sample of DNA (or a part of it) sufficiently to enable detailed study. PCR was invented in 1983 by American biochemist Kary Mullis at Cetus Corporation. Mullis and biochemist Michael Smith, who had developed other essential ways of manipulating DNA, were jointly awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1993. The majority of PCR methods rely on thermal cycling. Thermal cycling exposes reagents to repeated cycles of heating and cooling to permit different temperature dependent reactions—specifically, DNA melting and enzyme driven DNA replication. PCR employs two main reagents—primers (which are short single strand DNA fragments known as oligonucleotides that are a complementary sequence to the target DNA region) and a DNA polymerase. In the first step of PCR, the two strands of the DNA double helix are physically separated at a high temperature in a process called nucleic acid denaturation. In the second step, the temperature is lowered and the primers bind to the complementary sequences of DNA. The two DNA strands then become templates for DNA polymerase to enzymatically assemble a new DNA strand from free nucleotides, the building blocks of DNA. As PCR progresses, the DNA generated is itself used as a template for replication, setting in motion a chain reaction in which the original DNA template is exponentially amplified. Almost all PCR applications employ a heat stable DNA polymerase, such as Taq polymerase, an enzyme originally isolated from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. If the polymerase used was heat susceptible, it would denature under the high temperatures of the denaturation step. Before the use of Taq polymerase, DNA polymerase had to be manually added every cycle, which was a tedious and costly process. Applications of the technique include DNA cloning for sequencing, gene cloning and manipulation, gene mutagenesis; construction of DNA based phylogenies, or functional analysis of genes; diagnosis and monitoring of genetic disorders; amplification of ancient DNA; The amount of amplified product is determined by the available substrates in the reaction, which becomes limiting as the reaction progresses. A basic PCR set up requires several components and reagents, including:
a DNA template that contains the DNA target region to amplify
a DNA polymerase; an enzyme that polymerizes new DNA strands; heat resistant Taq polymerase is especially common, as it is more likely to remain intact during the high temperature DNA denaturation process
two DNA primers that are complementary to the 3' (three prime) ends of each of the sense and anti sense strands of the DNA target (DNA polymerase can only bind to and elongate from a double stranded region of DNA; without primers, there is no double stranded initiation site at which the polymerase can bind); specific primers that are complementary to the DNA target region are selected beforehand, and are often custom made in a laboratory or purchased from commercial biochemical suppliers
deoxynucleoside triphosphates, or dNTPs (sometimes called "deoxynucleotide triphosphates"; nucleotides containing triphosphate groups), the building blocks from which the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand
a buffer solution providing a suitable chemical environment for optimum activity and stability of the DNA polymerase
bivalent cations, typically magnesium (Mg) or manganese (Mn) ions; Mg2+ is the most common, but Mn2+ can be used for PCR mediated DNA mutagenesis, as a higher Mn2+ concentration increases the error rate during DNA synthesis; and monovalent cations, typically potassium (K) ions
The reaction is commonly carried out in a volume of 10–200 μL in small reaction tubes (0.2–0.5 mL volumes) in a thermal cycler. The thermal cycler heats and cools the reaction tubes to achieve the temperatures required at each step of the reaction (see below). Many modern thermal cyclers make use of a Peltier device, which permits both heating and cooling of the block holding the PCR tubes simply by reversing the device's electric current. Thin walled reaction tubes permit favorable thermal conductivity to allow for rapid thermal equilibrium. Most thermal cyclers have heated lids to prevent condensation at the top of the reaction tube. Older thermal cyclers lacking a heated lid require a layer of oil on top of the reaction mixture or a ball of wax inside the tube.
Реакция әдетте 10–200 мкл көлемде кішкентай реакциялық түтіктерде (0,2–0,5 мл көлемде) термиялық циклде жүргізіледі. Термиялық цикл реакцияның әр кезеңінде қажетті температураны алу үшін реакциялық түтіктерді қыздырады және салқындатады (төменде қараңыз). Көптеген қазіргі заманғы термиялық циклдер Пелтье құрылғысын қолданады, ол ПТР түтіктерін ұстап тұратын блокты құрылғының электр тогын кері бұру арқылы қыздыруға және салқындатуға мүмкіндік береді. Жұқа қабырғалы реакциялық түтіктер жылдам жылулық тепе-теңдікке мүмкіндік беретін жақсы жылу өткізгіштігіне мүмкіндік береді. Көптеген термиялық циклдер реакциялық түтіктің жоғарғы жағында конденсацияны болдырмау үшін қыздырылған қақпақтарына ие. Жылытылған қақпағы жоқ ескі термиялық циклдерге реакциялық қоспаның үстіне май қабаты немесе түтіктің ішіндегі балауыз шар қажет.
The polymerase chain reaction (PCR) is a method widely used to make millions to billions of copies of a specific DNA sample rapidly, allowing scientists to amplify a very small sample of DNA (or a part of it) sufficiently to enable detailed study. PCR was invented in 1983 by American biochemist Kary Mullis at Cetus Corporation. Mullis and biochemist Michael Smith, who had developed other essential ways of manipulating DNA, were jointly awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1993. The majority of PCR methods rely on thermal cycling. Thermal cycling exposes reagents to repeated cycles of heating and cooling to permit different temperature dependent reactions—specifically, DNA melting and enzyme driven DNA replication. PCR employs two main reagents—primers (which are short single strand DNA fragments known as oligonucleotides that are a complementary sequence to the target DNA region) and a DNA polymerase. In the first step of PCR, the two strands of the DNA double helix are physically separated at a high temperature in a process called nucleic acid denaturation. In the second step, the temperature is lowered and the primers bind to the complementary sequences of DNA. The two DNA strands then become templates for DNA polymerase to enzymatically assemble a new DNA strand from free nucleotides, the building blocks of DNA. As PCR progresses, the DNA generated is itself used as a template for replication, setting in motion a chain reaction in which the original DNA template is exponentially amplified. Almost all PCR applications employ a heat stable DNA polymerase, such as Taq polymerase, an enzyme originally isolated from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. If the polymerase used was heat susceptible, it would denature under the high temperatures of the denaturation step. Before the use of Taq polymerase, DNA polymerase had to be manually added every cycle, which was a tedious and costly process. Applications of the technique include DNA cloning for sequencing, gene cloning and manipulation, gene mutagenesis; construction of DNA based phylogenies, or functional analysis of genes; diagnosis and monitoring of genetic disorders; amplification of ancient DNA; The amount of amplified product is determined by the available substrates in the reaction, which becomes limiting as the reaction progresses. A basic PCR set up requires several components and reagents, including:
a DNA template that contains the DNA target region to amplify
a DNA polymerase; an enzyme that polymerizes new DNA strands; heat resistant Taq polymerase is especially common, as it is more likely to remain intact during the high temperature DNA denaturation process
two DNA primers that are complementary to the 3' (three prime) ends of each of the sense and anti sense strands of the DNA target (DNA polymerase can only bind to and elongate from a double stranded region of DNA; without primers, there is no double stranded initiation site at which the polymerase can bind); specific primers that are complementary to the DNA target region are selected beforehand, and are often custom made in a laboratory or purchased from commercial biochemical suppliers
deoxynucleoside triphosphates, or dNTPs (sometimes called "deoxynucleotide triphosphates"; nucleotides containing triphosphate groups), the building blocks from which the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand
a buffer solution providing a suitable chemical environment for optimum activity and stability of the DNA polymerase
bivalent cations, typically magnesium (Mg) or manganese (Mn) ions; Mg2+ is the most common, but Mn2+ can be used for PCR mediated DNA mutagenesis, as a higher Mn2+ concentration increases the error rate during DNA synthesis; and monovalent cations, typically potassium (K) ions
The reaction is commonly carried out in a volume of 10–200 μL in small reaction tubes (0.2–0.5 mL volumes) in a thermal cycler. The thermal cycler heats and cools the reaction tubes to achieve the temperatures required at each step of the reaction (see below). Many modern thermal cyclers make use of a Peltier device, which permits both heating and cooling of the block holding the PCR tubes simply by reversing the device's electric current. Thin walled reaction tubes permit favorable thermal conductivity to allow for rapid thermal equilibrium. Most thermal cyclers have heated lids to prevent condensation at the top of the reaction tube. Older thermal cyclers lacking a heated lid require a layer of oil on top of the reaction mixture or a ball of wax inside the tube.
Процедура
Көбінесе ПТР (полимераза тізбекті көбейту) 20–40 рет қайталанатын температуралық өзгерістер сериясынан тұрады, бұл термиялық циклдар деп аталады, әр цикл әдетте екі немесе үш жеке температуралық қадамнан тұрады (төмендегі суретті қараңыз). Циклдарды бастамас бұрын, көбінесе өте жоғары температурада (> ) бір температуралық қадам орындалады, содан кейін соңғы өнімді ұзарту немесе қысқа мерзімге сақтау үшін бір рет ұсталады. Әр циклда қолданылатын температуралар мен олардың қолданылу ұзақтығы ДНК синтезі үшін қолданылатын фермент, реакциядағы еківалентті иондар мен dNTP-лердің концентрациясы және праймерлердің балқу температурасы (Tm) сияқты әртүрлі параметрлерге байланысты. ПТР әдістерінің көпшілігіне ортақ жеке қадамдар: Бастапқылау: Бұл қадам тек ыстық старт ПТР арқылы жылуды қолдануды қажет ететін ДНК полимеразалар үшін ғана қажет. Ол реакциялық камераны 1 °C температураға дейін қыздырудан тұрады, немесе егер өте термостабильді полимеразалар қолданылса, онда 1–10 минут бойы ұсталады. Денатурациялау: Бұл қадам – циклдың бірінші рет қайталанатын кезеңі, онда реакциялық камера 20–30 секунд бойы қыздырылады. Бұл екі тізбекті ДНК-ның еріп, денатурациялануына себеп болады, себебі қосымша негіздер арасындағы сутекті байланыстар бұзылады, нәтижесінде екі бір тізбекті ДНК молекуласы пайда болады. Жабысу: Келесі кезеңде реакция температурасы 20–40 секундқа дейін төмендетіледі, бұл праймерлердің әрбір бір тізбекті ДНК үлгісіне жабысуына мүмкіндік береді. Реакциялық қоспаға әдетте екі түрлі праймер қосылады: біреуі мақсатты аймақты қамтитын екі бір тізбекті толықтырушылардың әрқайсысы үшін. Праймерлер өзі бір тізбекті тізбектер болып табылады, бірақ мақсатты аймақтың ұзындығынан әлдеқайда қысқа, әр тізбектің 3' ұшындағы өте қысқа тізбектерді ғана толықтырады. Жабысу қадамы үшін дұрыс температураны анықтау өте маңызды, өйткені тиімділік пен ерекшелік жабысу температурасына күшті әсер етеді. Бұл температура праймердің тізбекке гибридтелуіне жеткілікті төмен болуы керек, бірақ гибридтелудің ерекше болуы үшін жеткілікті жоғары болуы керек, яғни праймер тек тізбектің бір-біріне толық сәйкес келетін бөлігіне ғана, басқа еш жерде емес, байланысуы керек. Егер температура тым төмен болса, праймер дұрыс байланбауы мүмкін. Егер ол тым жоғары болса, праймер мүлдем байланбауы мүмкін. Типтік жабысу температурасы пайдаланылатын праймерлердің Tm-нен шамамен 3–5 °C төмен. Толықтырушы негіздер арасындағы тұрақты сутекті байланыстар праймер тізбегі үлгі тізбегімен өте жақын сәйкес келгенде ғана қалыптасады. Бұл кезеңде полимераза гибридтік праймерге байланады және ДНК түзілуі басталады. Ұзарту/көбейту: Бұл кезеңдегі температура қолданылған ДНК полимеразасына байланысты; Taq полимеразасының термостабильді ДНК полимеразасының оңтайлы белсенділік температурасы шамамен , бірақ осы ферментпен жиі қолданылатын температура . Бұл кезеңде ДНК полимераза 5'-ден 3'-ге дейінгі бағыттағы үлгіге қосымша болатын реакциялық қоспадан бос dNTP-лерді қосу арқылы жаңа ДНК тізбегін синтездейді, dNTP-нің 5'-фосфат тобын пайда болатын (ұзарған) ДНК тізбегінің соңындағы 3'-гидрокси тобына конденсациялайды. Ұзарту үшін қажетті нақты уақыт қолданылған ДНК полимеразасына және амплификацияланатын ДНК нысанасының ұзындығына байланысты. Ереже бойынша, олардың оңтайлы температурасында ДНК полимеразаларының көпшілігі минутына мың негізді полимерлендіреді. Оңтайлы жағдайларда (яғни, егер шектеуші субстраттар немесе реагенттерден туындаған шектеулер болмаса) әрбір ұзарту/көбейту сатысында ДНК нысаналық тізбектерінің саны екі есеге көбейтіледі. Әрбір кезекті цикл кезінде бастапқы үлгілік тізбектер мен жаңадан пайда болған барлық тізбектер келесі ұзарту кезеңіне арналған үлгілік тізбектерге айналады, бұл белгілі бір ДНК нысаналық аймағының экспоненциалды (геометриялық) күшеюіне әкеледі. Денатурациялау, жабысу және ұзарту процестері бір циклды құрайды. ДНК-ның миллиондаған көшірмелерін көбейту үшін бірнеше цикл қажет. Белгілі бір циклден кейін қалыптасқан ДНК көшірмелерінің санын есептеу үшін қолданылатын формула 2n, мұндағы n – циклдардың саны. Осылайша, 30 циклге арналған реакция нәтижесінде бастапқы екі тізбекті ДНК нысанасының 230, яғни 000 көшірмесі пайда болады. Соңғы ұзарту: Бұл бір қадам міндетті емес, бірақ кез келген қалған бір тізбекті ДНК толық ұзартылуын қамтамасыз ету үшін соңғы ПТР циклынан кейін 5–15 минут бойы (ПТР-де қолданылатын көптеген полимеразалардың оңтайлы белсенділігі үшін қажетті температурада) орындалады. Соңғы ұстау: Соңғы қадам реакциялық камераны белгісіз мерзімге дейін төмендетіп, ПТР өнімдерін қысқа мерзімде сақтау үшін қолданылуы мүмкін. ПТР сәтті күтілген ДНК нысаналық аймағын (кейде амплимер немесе ампликон деп те аталады) жасады ма, жоқ па, соны тексеру үшін агароздық гель электрофорезі ПТР өнімдерінің мөлшері бойынша бөлуге қолданылуы мүмкін. ПТР өнімдерінің мөлшері белгілі мөлшердегі ДНК фрагменттерін қамтитын молекулалық салмақ маркері – ДНК сатысымен салыстыру арқылы анықталады, ол ПТР өнімдерімен қатар гельде жүреді.
Initialization: This step is only required for DNA polymerases that require heat activation by hot start PCR. It consists of heating the reaction chamber to a temperature of , or if extremely thermostable polymerases are used, which is then held for 1–10 minutes. Denaturation: This step is the first regular cycling event and consists of heating the reaction chamber to for 20–30 seconds. This causes DNA melting, or denaturation, of the double stranded DNA template by breaking the hydrogen bonds between complementary bases, yielding two single stranded DNA molecules. Annealing: In the next step, the reaction temperature is lowered to for 20–40 seconds, allowing annealing of the primers to each of the single stranded DNA templates. Two different primers are typically included in the reaction mixture: one for each of the two single stranded complements containing the target region. The primers are single stranded sequences themselves, but are much shorter than the length of the target region, complementing only very short sequences at the 3' end of each strand. It is critical to determine a proper temperature for the annealing step because efficiency and specificity are strongly affected by the annealing temperature. This temperature must be low enough to allow for hybridization of the primer to the strand, but high enough for the hybridization to be specific, i. e., the primer should bind only to a perfectly complementary part of the strand, and nowhere else. If the temperature is too low, the primer may bind imperfectly. If it is too high, the primer may not bind at all. A typical annealing temperature is about 3–5 °C below the Tm of the primers used. Stable hydrogen bonds between complementary bases are formed only when the primer sequence very closely matches the template sequence. During this step, the polymerase binds to the primer template hybrid and begins DNA formation. Extension/elongation: The temperature at this step depends on the DNA polymerase used; the optimum activity temperature for the thermostable DNA polymerase of Taq polymerase is approximately , though a temperature of is commonly used with this enzyme. In this step, the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand complementary to the DNA template strand by adding free dNTPs from the reaction mixture that is complementary to the template in the 5' to 3' direction, condensing the 5' phosphate group of the dNTPs with the 3' hydroxy group at the end of the nascent (elongating) DNA strand. The precise time required for elongation depends both on the DNA polymerase used and on the length of the DNA target region to amplify. As a rule of thumb, at their optimal temperature, most DNA polymerases polymerize a thousand bases per minute. Under optimal conditions (i. e., if there are no limitations due to limiting substrates or reagents), at each extension/elongation step, the number of DNA target sequences is doubled. With each successive cycle, the original template strands plus all newly generated strands become template strands for the next round of elongation, leading to exponential (geometric) amplification of the specific DNA target region. The processes of denaturation, annealing and elongation constitute a single cycle. Multiple cycles are required to amplify the DNA target to millions of copies. The formula used to calculate the number of DNA copies formed after a given number of cycles is 2n, where n is the number of cycles. Thus, a reaction set for 30 cycles results in 230, or , copies of the original double stranded DNA target region. Final elongation: This single step is optional, but is performed at a temperature of (the temperature range required for optimal activity of most polymerases used in PCR) for 5–15 minutes after the last PCR cycle to ensure that any remaining single stranded DNA is fully elongated. Final hold: The final step cools the reaction chamber to for an indefinite time, and may be employed for short term storage of the PCR products. To check whether the PCR successfully generated the anticipated DNA target region (also sometimes referred to as the amplimer or amplicon), agarose gel electrophoresis may be employed for size separation of the PCR products. The size of the PCR products is determined by comparison with a DNA ladder, a molecular weight marker which contains DNA fragments of known sizes, which runs on the gel alongside the PCR products.
Кезеңдер
Басқа химиялық реакциялардағыдай, ПТР реакциясының жылдамдығы мен тиімділігі шектеуші факторларға тәуелді. Сондықтан, ПТР процесін реакцияның барысына қарай үш кезеңге бөлуге болады: Экспоненциалды күшейту: Әр цикл сайын өнімнің мөлшері екі есеге артады (реакцияның тиімділігі 100% деп есептесек). 30 циклдан кейін ДНК-ның бір көшірмесі 1 000 000 000 (бір миллиард) көшірмеге дейін көбейе алады. Яғни, ДНК-ның жеке тізбегін түтікшеде бақыланатын жағдайларда көбейтуге болады. Реакция өте сезімтал: ДНК-ның өте аз мөлшері ғана қажет. Тепе-теңдікке қарай кезең: ДНК полимераза белсенділігін жоғалта бастағанда және dNTP және праймерлер сияқты реагенттердің жетіспеуі салдарынан реакция баяулайды. Плато: Реагенттер мен ферменттердің таусылуына байланысты өнімнің жинақталуы тоқтатылады.
Exponential amplification: At every cycle, the amount of product is doubled (assuming 100% reaction efficiency). After 30 cycles, a single copy of DNA can be increased up to 1,000,000,000 (one billion) copies. In a sense, then, the replication of a discrete strand of DNA is being manipulated in a tube under controlled conditions. The reaction is very sensitive: only minute quantities of DNA must be present. Leveling off stage: The reaction slows as the DNA polymerase loses activity and as consumption of reagents, such as dNTPs and primers, causes them to become more limited. Plateau: No more product accumulates due to exhaustion of reagents and enzyme.
Оңтайландыру
Іс жүзінде ПТР әр түрлі себептермен сәтсіз аяқталуы мүмкін, мысалы, сезімталдық жеткіліксіздігі немесе ластану салдарынан. Сыртқы ДНК-мен ластану жалған өнімдерге алып келуі мүмкін, сондықтан зертханалық хаттамалар мен процедуралар ПТР-ге дейінгі қоспаларды ықтимал ДНК ластаушылардан бөліп сақтауды қамтамасыз етеді. ПТР-дің спецификалықтығы мен өнімділігін жұмыс параметрлері (мысалы, температура және циклдер ұзақтығы) немесе формамид сияқты реагенттерді қосу арқылы арттыруға болады. Праймерлерді жобалауға көмектесу үшін ПТР-дің теориялық нәтижелерін компьютерлік симуляциялау (электрондық ПТР) жүргізілуі мүмкін.
ДНК-ның селективті оқшаулануы
ПТР геномдық ДНК-дан ДНК фрагменттерін белгілі бір ДНК аймағын селективті күшейту арқылы оқшалауға мүмкіндік береді. ПТР-ны қолданудың көптеген артықшылықтары бар, мысалы, оңтүстік немесе солтүстік гибридтеу және ДНК клондау үшін гибридтеу зондтарын жасау, олар үшін белгілі бір ДНК аймағын көрсететін ДНК-ның үлкен көлемі қажет. ПТР осы әдістерді таза ДНК-ның жоғары мөлшерімен қамтамасыз етеді, бұл бастапқы материалдың өте аз мөлшерінен де ДНК үлгілерін талдауға мүмкіндік береді. ПТР-ның басқа да қолданылуларына ДНК тізбегін анықтау кіреді, бұл ПТР-мен күшейтілген тізбектерді анықтау үшін қолданылады, сондай-ақ күшейту праймерлерінің бірін Сангер тізбегінде пайдалануға болады. ПТР ДНК тізбегін оқшаулауға көмектеседі, бұл рекомбинантты ДНК технологияларын жеделдетуге мүмкіндік береді, оған ДНК тізбегін плазмидке, фагқа немесе космидке (өлшеміне байланысты) немесе басқа организмнің генетикалық материалына енгізу кіреді. Бактериялық колонияларды (мысалы, E. coli) ПТР арқылы ДНК вектор конструкцияларының дұрыстығын тез арада тексеруге болады. ПТР генетикалық саусақ іздерін анықтау үшін де қолданылуы мүмкін; бұл сот-медициналық техника, ол әртүрлі ПТР-не негізделген әдістер арқылы сынақ ДНК-ларын салыстыру арқылы адамды немесе организмді анықтау үшін қолданылады. Кейбір ПТР саусақ іздері әдістері жоғары ажыратымдылыққа ие және адамдар арасындағы генетикалық байланыстарды анықтау үшін қолданылуы мүмкін, мысалы, ата-бала немесе туыстар арасындағы байланыстарды, сондай-ақ әкелік тестілеуде қолданылады (4-суретті қараңыз). Бұл техника белгілі бір молекулалық сағаттар қолданылғанда (мысалы, микроорганизмдердің 16S рРНК және recA гендері) организмдер арасындағы эволюциялық байланыстарды анықтау үшін де қолданылуы мүмкін.
ДНҚ-ны күшейту және сандық анықтау
ПТР ДНК-ның таңдамал аймақтарын күшейтетіндіктен, ПТР өте аз мөлшердегі сынаманы талдау үшін қолданылуы мүмкін. Бұл әсіресе сот-медициналық сараптамада маңызды, себебі дәлел ретінде ДНК-ның тек іздері ғана қолжетімді болуы мүмкін. ПТР ондаған мың жылдық ежелгі ДНК-ны талдау үшін де пайдаланылуы мүмкін. Осы ПТР-ге негізделген әдістер жануарларда, мысалы, қырық мың жылдық мамонтта, сондай-ақ адам ДНК-сында, Мысыр мумияларын талдаудан бастап, Ресей патшасы мен ағылшын королі Ричард III-тің денесін анықтауға дейін сәтті қолданылды. Салықты ПТР немесе нақты уақыт ПТР (qPCR, РТ ПТР-мен шатастырмау) әдістері сынамадағы белгілі бір тізбектің мөлшерін бағалауға мүмкіндік береді – бұл ген экспрессиясы деңгейін сандық түрде анықтау үшін жиі қолданылады. Салықты ПТР – ДНК-ны сандық өлшеудің жақсы қалыптасқан құралы, ол ПТР күшейтуінің әр кезеңінен кейін ДНК өнімінің жинақталуын өлшейді. qPCR нақты уақытта белгілі бір ДНК тізбегін анықтауға және сандық өлшеуге мүмкіндік береді, өйткені ол синтез процесі жүріп жатқанда концентрацияны өлшейді. Бір мезгілде анықтау және сандық өлшеудің екі әдісі бар. Бірінші әдіс екі тізбектің арасында ерекшеленбейтін флуоресценттік бояуларды пайдаланудан тұрады. Екінші әдіс – белгілі бір тізбектерді кодтайтын және флуоресценттік таңбаланған зондтарды пайдалану. Бұл әдістерді қолдана отырып, ДНК-ны анықтау тек оның комплементарлы ДНК-мен (кДНК) гибридтелуі болғанда ғана байқалады. Нақты уақыт ПТР және кері транскрипцияның біріктірілген әдісі қызықты. RT qPCR деп аталатын бұл күрделі әдіс аз мөлшерде РНК-ны сандық өлшеуге мүмкіндік береді. Бұл біріктірілген әдіс арқылы мРНК кДНК-ға түрлендіріледі, содан кейін qPCR арқылы сандық өлшенеді. Бұл әдіс ПТР-дің соңғы нүктесінде қате болу ықтималдығын азайтады, соның салдарынан қатерлі ісік сияқты генетикалық аурулармен байланысты гендерді анықтау мүмкіндігі артады. RT qPCR зерттеу, медициналық, диагностикалық және жұқпалы аурулар саласындағы тәжірибелік деректерді дәл сәйкестендіру процедураларын жүзеге асыруға көмектеседі.
Артықшылықтар
ПТР-ның бірнеше артықшылықтары бар. Оны түсіну және қолдану оңай, ал нәтижелер жылдам алынады. Бұл техника өте сезімтал, және белгілі бір өнімнің миллиондаған, тіпті миллиардтаған көшірмесін жасауға мүмкіндік береді, оларды тізбектеп алу, клондау және талдау үшін пайдалануға болады. qRT ПТР ПТР-дың барлық артықшылықтарын бөліседі, сонымен қатар синтезделген өнімнің мөлшерін анықтау мүмкіндігіне ие. Сондықтан, ол ісіктерде, микроорганизмдерде немесе басқа да аурулардағы гендік экспрессия деңгейлерінің өзгеруін талдау үшін қолданылады. ПТР-дың тағы бір кемшілігі – тіпті ең аз мөлшердегі ластанушы ДНК-ның да күшейтілуі мүмкін, бұл қате немесе түсініксіз нәтижелерге әкелуі мүмкін. Ластану қаупін азайту үшін зерттеушілер реагенттерді дайындау, ПТР жүргізу және өнімді талдау үшін бөлек бөлмелерді пайдалануы керек. Реактивтерді бір рет қолдануға арналған порцияларға бөлу керек. Тек бір рет қолданылатын поршеньдері және ұзын пипетка ұштары бар пипеткаларды үнемі қолдану керек. Гумин қышқылы бар қоршаған ортаның сынамалары ПТР күшейтуін тежеуі және қате нәтижелерге әкелуі мүмкін.
Вариациялар
Аллельге спецификалық ПТР немесе амплификациялық рефракторлық мутация жүйесі (ARMS): бір нуклеотидтік вариацияларға (SNV, СНП-мен шатастырылмау керек) негізделген диагностикалық немесе клондау техникасы (науқастағы бір негіздік айырмашылықтар). Бұл жүйе бір негіздік өзгеріске байланысты кез келген мутацияны анықтауға мүмкіндік береді. Ол ДНК тізбегін, аллельдер арасындағы айырмашылықтарды қоса алғанда, алдын ала білуді қажет етеді және 3' ұштары SNV-ді қамтитын праймерлерді пайдаланады (әдетте SNV төңірегіндегі базалық жұп буфері). ПТР-ді қатаң жағдайларда күшейту, шаблон мен праймер арасындағы сәйкессіздік болған жағдайда әлдеқайда тиімсіз болады, сондықтан SNP-ге спецификалық праймермен сәтті күшейту, SNP-нің немесе тізбектегі кішігірім жойылулардың болуын көрсетеді. Толық ақпарат алу үшін SNP генотипіне қараңыз. Ассемблеялық ПТР немесе полимеразалық циклдік ассемблея (PCA): қысқа, бір-бірімен жапсарлас сегменттері бар ұзын олигонуклеотидтер жиынтығына ПТР жүргізу арқылы ұзын ДНК тізбектерін жасанды синтездеу. Олигонуклеотидтер сезімді және антисезімді бағыттарды ауыстырады, ал жапсарлас сегменттер ПТР фрагменттерінің реттілігін анықтайды, осылайша соңғы ұзын ДНК өнімін іріктеп шығарады. Асимметриялық ПТР: екі тізбекті ДНК шаблонында бір ДНК тізбегін басымдықпен күшейтеді. Ол реттіктеу және гибридизациялық зондтау үшін қолданылады, онда екі толықтырылған тізбектің тек біреуін күшейту қажет. ПТР әдеттегідей жүргізіледі, бірақ күшейтілуге арналған тізбек үшін праймердің көп мөлшері қосылады. Реакцияның кейінгі кезеңдеріндегі баяу (арифметикалық) күшейтуге байланысты, шектеуші праймердің пайдаланылуынан кейін ПТР-дің қосымша циклдары қажет. Бұл процеске енгізілген соңғы өзгеріс, экспоненциалды ПТР-дан кейін сызықтық (LATE PCR) деп аталады, ол реакция тиімділігін сақтау үшін жоғары балқу температурасы (Tm) бар шектеуші праймерді пайдаланады, өйткені шектеуші праймердің концентрациясы реакцияның ортасында төмендейді. Конвективтік ПТР: ПТР-ды псевдоизотермиялық түрде жүргізудің әдісі. ПТР қоспасын қайта-қайта қыздыру мен салқындатудың орнына, ерітіндіге жылу градиенті қолданылады. Нәтижесіндегі термиялық тұрақсыздық тудырған конвективтік ағын ПТР реагенттерін ыстық және суық аймақтардан қайта-қайта араластырады, осылайша ПТР-ді жүзеге асырады. Термиялық шекаралық жағдайлар және ПТР корпусының геометриясы сияқты параметрлерді хаотикалық ағын өрістерінің пайда болуын пайдалану арқылы берік және жылдам ПТР алу үшін оңтайландыруға болады. Мұндай конвективтік ағынды ПТР орнату құрылғының қуаттылығы мен жұмыс уақытын едәуір қысқартады. Диалдық ПТР: ген синтезі үшін ДНК молекулаларын дәл алудың жоғары параллель әдісі. ДНК молекулаларының күрделі кітапханасы массивті параллель реттілік алдында бірегей фланкинг тегтерімен өңделеді. Тагты бағытталған праймерлер кейін ПТР арқылы қажетті тізбектегі молекулаларды алуға мүмкіндік береді. Цифрлық ПТР (dPCR): ДНК үлгісіндегі мақсатты ДНК тізбегінің мөлшерін өлшеу үшін қолданылады. ДНК үлгісі өте сұйылтылған, сондықтан көптеген ПТР-ды бір уақытта жүргізгеннен кейін олардың кейбіреулері мақсатты ДНК-ның бір молекуласын да қабылдамайды. Мақсатты ДНК концентрациясы теріс нәтижелердің үлесін пайдалана отырып есептеледі. Сондықтан "цифрлық ПТР" деп аталады. Геликазаға тәуелді күшейту: дәстүрлі ПТР-ға ұқсас, бірақ денатюрациялау және оттану/кеңейту циклдері арқылы циклденудің орнына тұрақты температураны қолданады. ДНК-ны айналдыратын фермент - ДНК геликаза термиялық денатюрациялаудың орнына қолданылады. Ыстық старт ПТР: ПТР-дың бастапқы дайындық кезеңдерінде спецификалық емес күшейтуді азайтатын техника. Реакция компоненттерін полимераза қосылғанға дейін денатюрациялау температурасына (мысалы, 95 °C) дейін қыздыру арқылы қолмен орындауға болады. Полимеразаның белсенділігін қоршаған орта температурасында антиденемен байланысу арқылы немесе ковалентті байланыстағы ингибиторлардың болуы арқылы, тек жоғары температурада белсенділік кезеңінен кейін ғана ажыратылатын арнайы фермент жүйелері әзірленді. Ыстық старт/суық финиш ПТР-ге қоршаған орта температурасында белсенді емес, ал ұзарту температурасында бірден белсенді болатын жаңа гибридті полимеразалар қолданылады. In silico PCR (цифрлық ПТР, виртуалды ПТР, электрондық ПТР, e PCR) - секвенирленген геномнан немесе транскриптомнан ДНК тізбектерін күшейту үшін берілген праймерлер (пробтар) жиынтығын пайдаланып, полимераза тізбекті реакциясының теориялық нәтижелерін есептеуге арналған есептеу құралдары. In silico PCR молекулярлық биологияны оқыту құралы ретінде ұсынылды. Интерсеквенциялық спецификалық ПТР (ISSR): ДНК сақ еңгейлері арасындағы аймақтарды күшейтетін ДНК сақ еңгейлеу әдісі, күшейтілген фрагменттер ұзындығының бірегей сақ еңгейін жасайды. Кері ПТР: геномдық енгізулердің төңірегіндегі тізбектерді анықтау үшін әдетте қолданылады. Ол ДНК-ның кесілуі және өзіндік лигатурасынан тұрады, нәтижесінде белгілі тізбектер белгісіз тізбектің екі басында болады. Лигатураға тәуелді ПТР: ДНК-ның қызығушылық тудыратын ДНК-сына кіші ДНК байланыстырғыштарын лигатуралауды және ДНК байланыстырғыштарына жабысатын көптеген праймерлерді пайдаланады; ол ДНК реттілігін анықтау, геномды жүру және ДНК іздерін табу үшін қолданылған. Метилдеуге спецификалық ПТР (MSP): Стивен Бейлин және Джеймс Г. Герман Джон Хопкинс медицина мектебінде әзірлеген, геномдық ДНК-дағы CpG аралдарының метилдеуін анықтау үшін қолданылады. ДНК алдымен натрий бисульфитпен өңделеді, ол метилделмеген цитозин негіздерін урацилге айналдырады, ол ПТР праймерлерімен тимин ретінде танылады. Содан кейін екі ПТР реакциясы модификацияланған ДНК-да жүргізіледі, праймер жиынтықтары бірдей, бірақ праймер тізбектеріндегі кез келген CpG аралдарында ғана ерекшеленеді. Бұл жерлерде бір праймер жиынтығы метилделген ДНК-дағы цитозинді таниды, ал екінші жиынтық урацил немесе тиминмен ДНК-ны таниды, метилделмеген ДНК-ны күшейтеді. MSP, qPCR-ды пайдалану арқылы метилдеу туралы сапалық емес, сандық ақпарат алуға да болады. Минимизер ПТР: S Tbr термостабильді полимеразаны (9 немесе 10 нуклеотидке дейін қысқа праймерлерден ("кішкентай олиголар") кеңейтуге қабілетті) пайдаланады. Бұл әдіс ПТР-ды кішкентай праймер байланысу аймақтарына бағыттауға мүмкіндік береді және 16S (немесе эукариотық 18S) рРН гені сияқты сақталған ДНК тізбектерін күшейту үшін қолданылады. Көптеген лигатураға тәуелді зонд күшейту (MLPA): бір праймер жұбымен бірнеше мақсаттарды күшейтуге мүмкіндік береді, осылайша көптеген ПТР-дың шешілу шектеулерінен (төменде қараңыз) аулақ болады. Көптеген ПТР: әртүрлі ДНК тізбектеріне спецификалық түрде күшейтілген әртүрлі өлшемдегі ампликонды жасау үшін бір ПТР қоспасында бірнеше праймер жиынтықтарынан тұрады. Бірнеше генді бірден бағыттап, бір сынақтан басқа жағдайда бірнеше есе көбірек реагенттерді және уақытты қажет ететін қосымша ақпарат алуға болады. Әр праймер жиынтығы үшін оттану температураларын бір реакцияда дұрыс жұмыс істеуі үшін оңтайландыру қажет, ампликон өлшемдері. Яғни, олардың базалық жұп ұзындығы гель электрофорезімен визуализацияланғанда ерекше жолақтарды құру үшін жеткілікті түрде ерекшеленуі керек. Нанобөлшектерге көмектесетін ПТР (nanoPCR): кейбір нанобөлшектер (NP) ПТР тиімділігін арттыра алады (осылайша nanoPCR деп аталады), ал кейбіреулері бастапқы ПТР күшейткіштерінен де жақсы нәтиже береді. Кванттық нүктелердің (QD) ПТР спецификалық еместігі мен тиімділігін жақсартатыны хабарланды. Қабыршақты көміртекті наноқұбырлар (SWCNT) және көп қабатты көміртекті наноқұбырлар (MWCNT) ұзақ ПТР-дың күшейтілуін арттыруда тиімді. Көміртекті ұнтақ (CNP) қайталамалы ПТР және ұзақ ПТР тиімділігін жақсарта алады, ал мырыш оксиді, титан диоксиді және Ag NP ПТР шығымын арттырады. Алдыңғы деректер металл емес NP-лердің қабылданатын күшейту адалдығын сақтағанын көрсетті. Көптеген NP-лер ПТР тиімділігін арттыра алатындықтан, nanoPCR технологиясын жақсарту және өнімді әзірлеу үшін үлкен әлеует бар екені анық. Ішкі ПТР: ДНК күшейтуінің спецификалық еместігін азайтады, ДНК-ның спецификалық емес күшейтуінен туындаған фонды азайту арқылы. Екі праймер жиынтығы екі қатарынан ПТР-да қолданылады. Бірінші реакцияда бір праймер жұбы ДНК өнімдерін жасау үшін қолданылады, ол қажетті мақсаттан басқа, әлі де бірге болуы мүмкін...
Тарих
Жылуға төзімді ферменттер, полимераза тізбекті реакциясының (ПТР) негізгі құралы, 1960 жылдары Йеллоустоунның Машрүм Спрингінің (саңырауқұлақтар бұлағы) қызып тұрған суларында тіршілік еткен микроорганизмдердің өнімі ретінде табылды. 1971 жылы Кьелл Клеппе және Х. Гобинд Хорананың зертханасындағы әріптестері «Молекулалық биология журналында» ферменттік талдау арқылы қысқа ДНК матрицасын праймерлермен in vitro жағдайында көбейту әдісін алғаш рет сипаттады. Алайда, ПТР принципінің бұл алғашқы нұсқасына сол кезде көп көңіл бөлінбеді, ал полимераза тізбекті реакциясының 1983 жылғы өнертабысы көбінесе Кари Муллиске жатқызылады. Муллис 1983 жылы ПТР-ды әзірлеген кезде, Cetus Corporation компаниясында жұмыс істеді, ол – алғашқы биотехнологиялық компаниялардың бірі. Ол ДНК-ның қысқа тізбектерін синтездеуге жауапты болды. Муллис ПТР идеясын бір түні, Тынық мұхитының жағалау жолымен келе жатып ойлап тапқанын айтады. ДНК-дағы өзгерістерді (мутацияларды) талдаудың жаңа тәсілімен ойланып отырғанда, ол ДНК полимеразаның қайталама циклдар арқылы кез келген ДНК аймағын күшейтуге мүмкіндік беретін әдіс ойға келгенін түсінді. «Scientific American» журналында Муллис процедураны былай қорытындылады: «ПТР ДНК-ның бір молекуласынан бастап, бір түстен кейін 100 миллиардқа жуық ұқсас молекулаларды жасауға мүмкіндік береді. Реакцияны орындау оңай. Ол үшін тек бір сынақ түтігі, бірнеше қарапайым реагенттер және жылу көзі ғана қажет». ДНК-ның саусақ іздері алғаш рет 1988 жылы әкелік тексеруде қолданылды. Муллис ПТР-ды әзірлеуде ЛСД-ны қолдануын маңызды фактор деп есептейді: «Егер мен ЛСД қабылдамасам, ПТР-ды ойлап тапқан болар ма едім? Мен күмәнданамын. Мен ДНК молекуласында отырып, полимерлердің қалай өтетінін көре алатынмын. Мен мұны психоделикалық препараттардың көмегімен үйрендім». Муллис және ДНК-ны өңдеудің басқа да маңызды әдістерін әзірлеген биохимик Майкл Смит 1993 жылы химия саласындағы Нобель сыйлығымен марапатталды, бұл Муллис пен оның Cetus-тегі әріптестері алғаш рет ұсынысын іске асырғаннан кейін жеті жыл өткен соң болды. Муллистің 1985 жылғы Р.К. Саики және Х.А. Эрлихпен бірлескен «Бетта-глобин геномдық тізбектерінің ферменттік күшеюі және серпалы жасушалы анемияны диагностикалау үшін шектеу орны талдауы» (полимераза тізбектік реакциясының (ПТР) өнертабы) еңбегі 2017 жылы Америка Химиялық қоғамының Химия тарихы бөлімінен «Химиялық Жетістік» сыйлығымен марапатталды. Швейцариялық Hoffmann La Roche фармацевтикалық компаниясы 1992 жылы патенттерге құқықты сатып алды. Коммерциялық ПТР патенттерінің соңғысы 2017 жылы қолданыстан шықты. Roche және Promega компаниялары арасында Taq полимераза ферментіне қатысты патенттік дау әлемнің бірнеше юрисдикциясында әлі де жалғасуда. Құқықтық аргументтер 2005 жылдың 28 наурызында мерзімі аяқталған бастапқы ПТР және Taq полимераза патенттерінің өмір сүру мерзімін асып түсті.