Полимеразная цепная реакция: метод амплификации ДНК

Введение

Лабораторная техника для умножения образца ДНК для исследования.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это широко используемый метод для быстрого создания миллионов – миллиардов копий конкретного образца ДНК, позволяющий ученым усиливать очень небольшой образец ДНК (или его часть) в достаточном количестве для проведения детального исследования. ПЦР была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом в компании Cetus Corporation. Муллис и биохимик Майкл Смит, разработавший другие важные способы манипулирования ДНК, совместно были удостоены Нобелевской премии по химии в 1993 году. Большинство методов ПЦР основаны на термическом циклировании. Термическое циклирование подвергает реагенты повторным циклам нагрева и охлаждения для обеспечения различных температурно-зависимых реакций – в частности, денатурации ДНК и репликации ДНК, управляемой ферментами. В ПЦР используются два основных реагента – праймеры (короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, известные как олигонуклеотиды, которые являются комплементарной последовательностью к целевой области ДНК) и ДНК-полимераза. На первом этапе ПЦР две нити двойной спирали ДНК физически разделяются при высокой температуре в процессе, называемом денатурацией нуклеиновых кислот. На втором этапе температура понижается, и праймеры связываются с комплементарными последовательностями ДНК. Затем две нити ДНК становятся матрицами для ДНК-полимеразы, которая ферментативно собирает новую нить ДНК из свободных нуклеотидов – строительных блоков ДНК. По мере прогрессирования ПЦР генерируемая ДНК сама используется в качестве матрицы для репликации, запуская цепную реакцию, в которой исходная матрица ДНК усиливается экспоненциально. Почти во всех применениях ПЦР используется термостабильная ДНК-полимераза, такая как Taq-полимераза, фермент, первоначально выделенный из термофильной бактерии *Thermus aquaticus*. Если используемая полимераза была бы термочувствительной, она денатурировала бы при высоких температурах этапа денатурации. До использования Taq-полимеразы ДНК-полимеразу приходилось добавлять вручную каждый цикл, что было утомительным и дорогостоящим процессом. Применение метода включает в себя клонирование ДНК для секвенирования, клонирование и манипулирование генами, мутагенез генов; построение филогений на основе ДНК или функциональный анализ генов; диагностику и мониторинг генетических заболеваний; амплификацию древней ДНК. Количество амплифицированного продукта определяется доступными субстратами в реакции, которое становится лимитирующим по мере прогрессирования реакции. Для создания базового набора ПЦР требуются несколько компонентов и реагентов, в том числе:
шаблон ДНК, содержащий целевую область ДНК для амплификации;
ДНК-полимераза – фермент, который полимеризует новые нити ДНК; теплостойкая Taq-полимераза особенно распространена, так как более вероятно, что она останется неповрежденной во время процесса высокотемпературной денатурации ДНК;
два ДНК-праймера, комплементарных 3'-концам каждой из сенсорной и антисенсорной нитей ДНК-мишени (ДНК-полимераза может связываться только и удлинять из двухцепочечной области ДНК; без праймеров нет участка инициации двухцепочечной структуры, к которому полимераза может связаться); специфические праймеры, комплементарные целевой области ДНК, выбираются заранее и часто изготавливаются в лаборатории или приобретаются у коммерческих поставщиков биохимических реагентов;
дезоксинуклеозидтрифосфаты или dNTP (иногда называемые "дезоксинуклеотидтрифосфатами" – нуклеотиды, содержащие трифосфатные группы), строительные блоки, из которых ДНК-полимераза синтезирует новую нить ДНК;
буферный раствор, обеспечивающий подходящую химическую среду для оптимальной активности и стабильности ДНК-полимеразы;
двухвалентные катионы, обычно магний (Mg) или марганец (Mn) ионы; Mg2+ является наиболее распространенным, но Mn2+ может использоваться для ПЦР-опосредованного мутагенеза ДНК, поскольку более высокая концентрация Mn2+ увеличивает частоту ошибок во время синтеза ДНК; и одновалентные катионы, обычно калий (K) ионы.

The polymerase chain reaction (PCR) is a method widely used to make millions to billions of copies of a specific DNA sample rapidly, allowing scientists to amplify a very small sample of DNA (or a part of it) sufficiently to enable detailed study. PCR was invented in 1983 by American biochemist Kary Mullis at Cetus Corporation. Mullis and biochemist Michael Smith, who had developed other essential ways of manipulating DNA, were jointly awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1993. The majority of PCR methods rely on thermal cycling. Thermal cycling exposes reagents to repeated cycles of heating and cooling to permit different temperature dependent reactions—specifically, DNA melting and enzyme driven DNA replication. PCR employs two main reagents—primers (which are short single strand DNA fragments known as oligonucleotides that are a complementary sequence to the target DNA region) and a DNA polymerase. In the first step of PCR, the two strands of the DNA double helix are physically separated at a high temperature in a process called nucleic acid denaturation. In the second step, the temperature is lowered and the primers bind to the complementary sequences of DNA. The two DNA strands then become templates for DNA polymerase to enzymatically assemble a new DNA strand from free nucleotides, the building blocks of DNA. As PCR progresses, the DNA generated is itself used as a template for replication, setting in motion a chain reaction in which the original DNA template is exponentially amplified. Almost all PCR applications employ a heat stable DNA polymerase, such as Taq polymerase, an enzyme originally isolated from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. If the polymerase used was heat susceptible, it would denature under the high temperatures of the denaturation step. Before the use of Taq polymerase, DNA polymerase had to be manually added every cycle, which was a tedious and costly process. Applications of the technique include DNA cloning for sequencing, gene cloning and manipulation, gene mutagenesis; construction of DNA based phylogenies, or functional analysis of genes; diagnosis and monitoring of genetic disorders; amplification of ancient DNA; The amount of amplified product is determined by the available substrates in the reaction, which becomes limiting as the reaction progresses. A basic PCR set up requires several components and reagents, including:
a DNA template that contains the DNA target region to amplify
a DNA polymerase; an enzyme that polymerizes new DNA strands; heat resistant Taq polymerase is especially common, as it is more likely to remain intact during the high temperature DNA denaturation process
two DNA primers that are complementary to the 3' (three prime) ends of each of the sense and anti sense strands of the DNA target (DNA polymerase can only bind to and elongate from a double stranded region of DNA; without primers, there is no double stranded initiation site at which the polymerase can bind); specific primers that are complementary to the DNA target region are selected beforehand, and are often custom made in a laboratory or purchased from commercial biochemical suppliers
deoxynucleoside triphosphates, or dNTPs (sometimes called "deoxynucleotide triphosphates"; nucleotides containing triphosphate groups), the building blocks from which the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand
a buffer solution providing a suitable chemical environment for optimum activity and stability of the DNA polymerase
bivalent cations, typically magnesium (Mg) or manganese (Mn) ions; Mg2+ is the most common, but Mn2+ can be used for PCR mediated DNA mutagenesis, as a higher Mn2+ concentration increases the error rate during DNA synthesis; and monovalent cations, typically potassium (K) ions

Реакция обычно проводится в объеме 10–200 мкл в небольших реакционных пробирках (объемом 0,2–0,5 мл) в термическом циклере. Термический циклор нагревает и охлаждает реакционные пробирки для достижения температур, необходимых на каждом этапе реакции (см. ниже). Многие современные термические циклеры используют устройство Пельтье, которое позволяет нагревать и охлаждать блок, удерживающий пробирки ПЦР, просто путем изменения направления электрического тока устройства. Тонкостенные реакционные пробирки обеспечивают благоприятную теплопроводность для быстрого достижения теплового равновесия. Большинство термических циклеров имеют нагретые крышки для предотвращения конденсации на верхней части реакционной пробирки. Старые термические циклеры, не имеющие нагретой крышки, требуют слоя масла над реакционной смесью или шарика воска внутри пробирки.

Процедура

Как правило, ПЦР состоит из серии 20–40 повторных изменений температуры, называемых термическими циклами, причем каждый цикл обычно состоит из двух или трех дискретных температурных стадий (см. рисунок ниже). Циклированию часто предшествует одна температурная стадия при очень высокой температуре (>), а завершается одна выдержка для окончательного удлинения продукта или кратковременного хранения. Используемые температуры и продолжительность их поддержания в каждом цикле зависят от различных параметров, включая используемый для синтеза ДНК фермент, концентрацию двухвалентных ионов и dNTP в реакции, а также температуру плавления (Tm) праймеров. Индивидуальные этапы, общие для большинства методов ПЦР, следующие: Инициализация: Эта стадия требуется только для ДНК-полимераз, нуждающихся в тепловой активации с помощью горячего старта ПЦР. Она состоит из нагрева реакционной камеры до температуры , или если используются чрезвычайно термостабильные полимеразы, с последующей выдержкой в течение 1–10 минут. Денатурация: Эта стадия является первым регулярным циклом и состоит из нагрева реакционной камеры до в течение 20–30 секунд. Это вызывает плавление ДНК, или денатурацию, двухцепочечного ДНК-шаблона путем разрыва водородных связей между комплементарными основаниями, в результате чего образуются две одноцепочечные молекулы ДНК. Отжиг: На следующем этапе температура реакции снижается до в течение 20–40 секунд, что позволяет праймерам отжигаться к каждому из одноцепочечных ДНК-шаблонов. Обычно в реакционную смесь включают два различных праймера: по одному для каждого из двух одноцепочечных комплементов, содержащих целевую область. Праймеры сами по себе являются одноцепочечными последовательностями, но значительно короче длины целевой области, комплементарными только коротким последовательностям на 3'-конце каждой цепи. Критически важно определить подходящую температуру для этапа отжига, поскольку эффективность и специфичность сильно зависят от температуры отжига. Эта температура должна быть достаточно низкой, чтобы обеспечить гибридизацию праймера к цепи, но достаточно высокой, чтобы гибридизация была специфичной, то есть праймер должен связываться только с идеально комплементарным участком цепи и нигде более. Если температура слишком низкая, праймер может связываться неспецифично. Если она слишком высокая, праймер может вообще не связываться. Типичная температура отжига примерно на 3–5 °C ниже Tm используемых праймеров. Стабильные водородные связи между комплементарными основаниями образуются только тогда, когда последовательность праймера очень близко соответствует последовательности шаблона. Во время этого этапа полимераза связывается с гибридом праймер-шаблон и начинает формирование ДНК. Элонгация/удлинение: Температура на этом этапе зависит от используемой ДНК-полимеразы; оптимальная температура активности для термостабильной ДНК-полимеразы Taq-полимеразы составляет приблизительно , хотя с этим ферментом обычно используется температура . На этом этапе ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК, комплементарную цепи ДНК-шаблона, добавляя свободные dNTP из реакционной смеси, комплементарные шаблону в направлении 5'–3', конденсируя 5'-фосфатную группу dNTP с 3'-гидроксильной группой на конце формирующейся (удлиняющейся) цепи ДНК. Точное время, необходимое для элонгации, зависит как от используемой ДНК-полимеразы, так и от длины целевой области ДНК для амплификации. Как правило, при оптимальной температуре большинство ДНК-полимераз полимеризуют тысячу оснований в минуту. При оптимальных условиях (то есть, если нет ограничений из-за лимитирующих субстратов или реагентов) на каждом этапе элонгации/удлинения количество целевых последовательностей ДНК удваивается. С каждым последующим циклом исходные цепи шаблона плюс все вновь сгенерированные цепи становятся цепями шаблона для следующего раунда элонгации, что приводит к экспоненциальному (геометрическому) увеличению специфической целевой области ДНК. Процессы денатурации, отжига и элонгации составляют один цикл. Для амплификации целевой ДНК до миллионов копий требуется несколько циклов. Формула, используемая для расчета количества копий ДНК, образовавшихся после заданного числа циклов, равна 2n, где n — число циклов. Таким образом, реакция, установленная на 30 циклов, дает 230, или , копий исходной двухцепочечной целевой области ДНК. Окончательная элонгация: Этот однократный этап является необязательным, но выполняется при температуре (температурный диапазон, необходимый для оптимальной активности большинства полимераз, используемых в ПЦР) в течение 5–15 минут после последнего цикла ПЦР, чтобы гарантировать полное удлинение любой оставшейся одноцепочечной ДНК. Окончательная выдержка: На заключительном этапе реакционная камера охлаждается до на неопределенное время и может использоваться для кратковременного хранения продуктов ПЦР. Для проверки успешности генерации ожидаемой целевой области ДНК (иногда называемой ампликоном) может быть использован электрофорез в агарозном геле для разделения продуктов ПЦР по размеру. Размер продуктов ПЦР определяется путем сравнения с ДНК-лестницей, молекулярным маркером веса, содержащим фрагменты ДНК известных размеров, которые запускаются в геле вместе с продуктами ПЦР.

Typically, PCR consists of a series of 20–40 repeated temperature changes, called thermal cycles, with each cycle commonly consisting of two or three discrete temperature steps (see figure below). The cycling is often preceded by a single temperature step at a very high temperature (>), and followed by one hold at the end for final product extension or brief storage. The temperatures used and the length of time they are applied in each cycle depend on a variety of parameters, including the enzyme used for DNA synthesis, the concentration of bivalent ions and dNTPs in the reaction, and the melting temperature (Tm) of the primers. The individual steps common to most PCR methods are as follows:
Initialization: This step is only required for DNA polymerases that require heat activation by hot start PCR. It consists of heating the reaction chamber to a temperature of , or if extremely thermostable polymerases are used, which is then held for 1–10 minutes. Denaturation: This step is the first regular cycling event and consists of heating the reaction chamber to for 20–30 seconds. This causes DNA melting, or denaturation, of the double stranded DNA template by breaking the hydrogen bonds between complementary bases, yielding two single stranded DNA molecules. Annealing: In the next step, the reaction temperature is lowered to for 20–40 seconds, allowing annealing of the primers to each of the single stranded DNA templates. Two different primers are typically included in the reaction mixture: one for each of the two single stranded complements containing the target region. The primers are single stranded sequences themselves, but are much shorter than the length of the target region, complementing only very short sequences at the 3' end of each strand. It is critical to determine a proper temperature for the annealing step because efficiency and specificity are strongly affected by the annealing temperature. This temperature must be low enough to allow for hybridization of the primer to the strand, but high enough for the hybridization to be specific, i. e., the primer should bind only to a perfectly complementary part of the strand, and nowhere else. If the temperature is too low, the primer may bind imperfectly. If it is too high, the primer may not bind at all. A typical annealing temperature is about 3–5 °C below the Tm of the primers used. Stable hydrogen bonds between complementary bases are formed only when the primer sequence very closely matches the template sequence. During this step, the polymerase binds to the primer template hybrid and begins DNA formation. Extension/elongation: The temperature at this step depends on the DNA polymerase used; the optimum activity temperature for the thermostable DNA polymerase of Taq polymerase is approximately , though a temperature of is commonly used with this enzyme. In this step, the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand complementary to the DNA template strand by adding free dNTPs from the reaction mixture that is complementary to the template in the 5' to 3' direction, condensing the 5' phosphate group of the dNTPs with the 3' hydroxy group at the end of the nascent (elongating) DNA strand. The precise time required for elongation depends both on the DNA polymerase used and on the length of the DNA target region to amplify. As a rule of thumb, at their optimal temperature, most DNA polymerases polymerize a thousand bases per minute. Under optimal conditions (i. e., if there are no limitations due to limiting substrates or reagents), at each extension/elongation step, the number of DNA target sequences is doubled. With each successive cycle, the original template strands plus all newly generated strands become template strands for the next round of elongation, leading to exponential (geometric) amplification of the specific DNA target region. The processes of denaturation, annealing and elongation constitute a single cycle. Multiple cycles are required to amplify the DNA target to millions of copies. The formula used to calculate the number of DNA copies formed after a given number of cycles is 2n, where n is the number of cycles. Thus, a reaction set for 30 cycles results in 230, or , copies of the original double stranded DNA target region. Final elongation: This single step is optional, but is performed at a temperature of (the temperature range required for optimal activity of most polymerases used in PCR) for 5–15 minutes after the last PCR cycle to ensure that any remaining single stranded DNA is fully elongated. Final hold: The final step cools the reaction chamber to for an indefinite time, and may be employed for short term storage of the PCR products. To check whether the PCR successfully generated the anticipated DNA target region (also sometimes referred to as the amplimer or amplicon), agarose gel electrophoresis may be employed for size separation of the PCR products. The size of the PCR products is determined by comparison with a DNA ladder, a molecular weight marker which contains DNA fragments of known sizes, which runs on the gel alongside the PCR products.

Этапы

Как и в случае с другими химическими реакциями, скорость и эффективность ПЦР зависят от лимитирующих факторов. Таким образом, весь процесс ПЦР можно разделить на три стадии, основанные на ходе реакции:
Экспоненциальное нарастание: на каждом цикле количество продукта удваивается (при условии 100% эффективности реакции). После 30 циклов одна копия ДНК может быть увеличена до 1 000 000 000 (одного миллиарда) копий. В некотором смысле, таким образом, репликация дискретной цепи ДНК манипулируется в пробирке в контролируемых условиях. Реакция очень чувствительна: требуется лишь незначительное количество ДНК. Стадия замедления: реакция замедляется по мере потери активности ДНК-полимеразы и истощения реагентов, таких как dNTP и праймеры. Плато: дальнейшее накопление продукта прекращается из-за полного истощения реагентов и фермента.

Оптимизация

На практике ПЦР может не удаться по разным причинам, таким как недостаточная чувствительность или загрязнение. Загрязнение посторонней ДНК может приводить к образованию ложных продуктов и решается путем соблюдения лабораторных протоколов и процедур, которые разделяют смеси, используемые до ПЦР, от потенциальных источников загрязнения ДНК. Как параметры проведения реакции (например, температура и продолжительность циклов), так и добавление реагентов, таких как формамид, могут повысить специфичность и выход ПЦР. Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР (электронная ПЦР) может использоваться для помощи в подборе праймеров.

Селективная изоляция ДНК

ПЦР позволяет изолировать фрагменты ДНК из геномной ДНК путем селективного усиления определенного участка ДНК. Это применение ПЦР расширяет возможности многих методов, таких как получение гибридизационных зондов для саузерн- или нозерн-блотинга и клонирования ДНК, которым требуются большие количества ДНК, представляющей конкретный участок генома. ПЦР обеспечивает эти методы достаточным количеством чистой ДНК, позволяя анализировать образцы ДНК даже из очень малых количеств исходного материала. Другие области применения ПЦР включают секвенирование ДНК для определения неизвестных последовательностей, амплифицированных с помощью ПЦР, при котором один из праймеров для амплификации может быть использован в секвенировании по Сэнгеру, а также выделение последовательности ДНК для ускорения рекомбинантных технологий ДНК, связанных с введением последовательности ДНК в плазмиду, фаг или космид (в зависимости от размера) или генетический материал другого организма. Бактериальные колонии (например, E. coli) могут быть быстро проверены с помощью ПЦР на наличие правильных конструкций ДНК-векторов. ПЦР также может использоваться для генетического типирования – судебно-медицинской методики, применяемой для идентификации человека или организма путем сравнения образцов ДНК с использованием различных методов, основанных на ПЦР. Некоторые методы генетического типирования на основе ПЦР обладают высокой дискриминационной способностью и могут использоваться для установления генетических связей между индивидуумами, например, между родителем и ребенком или между братьями и сестрами, и применяются в тестировании отцовства (рис. 4). Этот метод также может быть использован для определения эволюционных взаимосвязей между организмами при использовании определенных молекулярных часов (например, генов 16S рРНК и recA микроорганизмов).

Амплификация и количественное определение ДНК

Поскольку ПЦР усиливает области ДНК, на которые она нацелена, ПЦР может использоваться для анализа чрезвычайно небольших количеств образца. Это часто критически важно для судебно-медицинского анализа, когда в качестве доказательства доступно лишь следовое количество ДНК. ПЦР также может использоваться при анализе древней ДНК, возраст которой составляет десятки тысяч лет. Эти методы ПЦР успешно применялись к животным, например, к мамонту возрастом 40 000 лет, а также к ДНК человека в самых разных областях, от анализа египетских мумий до идентификации российского царя и тела английского короля Ричарда III. Количественная ПЦР или ПЦР в реальном времени (qPCR, не путать с РТ-ПЦР) позволяет оценить количество определенной последовательности, присутствующей в образце – метод, часто используемый для количественного определения уровней экспрессии генов. Количественная ПЦР является общепринятым инструментом для количественной оценки ДНК, измеряющим накопление продукта ДНК после каждого раунда амплификации ПЦР. qPCR позволяет количественно определять и обнаруживать конкретную последовательность ДНК в реальном времени, поскольку измеряет концентрацию в процессе синтеза. Существуют два метода одновременного обнаружения и количественного определения. Первый метод заключается в использовании флуоресцентных красителей, которые неспецифически связываются с двойными нитями. Второй метод включает в себя зонды, кодирующие определенные последовательности и имеющие флуоресцентную метку. Обнаружение ДНК с использованием этих методов возможно только после гибридизации зондов с комплементарной ДНК (кДНК). Интересным сочетанием методов является ПЦР в реальном времени и обратная транскрипция. Эта сложная методика, называемая RT-qPCR, позволяет количественно определить небольшое количество РНК. С помощью этой комбинированной методики мРНК преобразуется в кДНК, которая затем количественно определяется с помощью qPCR. Этот метод снижает вероятность ошибки в конечной точке ПЦР, повышая вероятность обнаружения генов, связанных с генетическими заболеваниями, такими как рак. RT-qPCR также облегчает применение точных методов подгонки экспериментальных данных в исследованиях, медицине, диагностике и при инфекционных заболеваниях.

Because PCR amplifies the regions of DNA that it targets, PCR can be used to analyze extremely small amounts of sample. This is often critical for forensic analysis, when only a trace amount of DNA is available as evidence. PCR may also be used in the analysis of ancient DNA that is tens of thousands of years old. These PCR based techniques have been successfully used on animals, such as a forty thousand year old mammoth, and also on human DNA, in applications ranging from the analysis of Egyptian mummies to the identification of a Russian tsar and the body of English king Richard III. Quantitative PCR or Real Time PCR (qPCR, not to be confused with RT PCR) methods allow the estimation of the amount of a given sequence present in a sample—a technique often applied to quantitatively determine levels of gene expression. Quantitative PCR is an established tool for DNA quantification that measures the accumulation of DNA product after each round of PCR amplification. qPCR allows the quantification and detection of a specific DNA sequence in real time since it measures concentration while the synthesis process is taking place. There are two methods for simultaneous detection and quantification. The first method consists of using fluorescent dyes that are retained nonspecifically in between the double strands. The second method involves probes that code for specific sequences and are fluorescently labeled. Detection of DNA using these methods can only be seen after the hybridization of probes with its complementary DNA (cDNA) takes place. An interesting technique combination is real time PCR and reverse transcription. This sophisticated technique, called RT qPCR, allows for the quantification of a small quantity of RNA. Through this combined technique, mRNA is converted to cDNA, which is further quantified using qPCR. This technique lowers the possibility of error at the end point of PCR, increasing chances for detection of genes associated with genetic diseases such as cancer. and RT qPCR facilitate the implementation of accurate fitting procedures of experimental data in research, medical, diagnostic and infectious disease applications.

Преимущества

ПЦР обладает рядом преимуществ. Ее относительно легко понять и применять, и она позволяет быстро получать результаты. Эта методика отличается высокой чувствительностью и способна создавать миллионы или миллиарды копий конкретного продукта для секвенирования, клонирования и анализа. qRT-ПЦР разделяет все преимущества ПЦР, дополненные возможностью количественной оценки синтезированного продукта. Поэтому она находит применение в анализе изменений уровней экспрессии генов в опухолях, микроорганизмах или при других патологических состояниях. Ограничением ПЦР также является то, что даже незначительное количество контаминирующей ДНК может быть амплифицировано, приводя к ошибочным или неоднозначным результатам. Чтобы минимизировать риск контаминации, исследователям следует выделять отдельные помещения для подготовки реагентов, проведения ПЦР и анализа продуктов. Реагенты следует разносить на одноразовые аликвоты. Рекомендуется регулярно использовать пипетки с одноразовыми поршнями и удлиненными наконечниками. Образцы окружающей среды, содержащие гуминовые кислоты, могут ингибировать амплификацию ПЦР и приводить к неточным результатам.

Вариации

Аллель-специфическая ПЦР или система амплификации рефракторных мутаций (ARMS): диагностический или клонирующий метод, основанный на однонуклеотидных вариациях (SNV, не путать с SNP) (однонуклеотидные различия у пациента). Любая мутация, включающая однонуклеотидное изменение, может быть обнаружена с помощью этой системы. Требуется предварительное знание последовательности ДНК, включая различия между аллелями, и используются праймеры, 3'-концы которых охватывают SNV (обычно включается буфер из нескольких пар оснований вокруг SNV). Усиление ПЦР в строгих условиях значительно менее эффективно при наличии несовпадения между матрицей и праймером, поэтому успешное усиление со специфичным для SNP праймером указывает на наличие специфического SNP или небольших делеций в последовательности. Подробнее см. в разделе "Генотипирование SNP". Сборная ПЦР или полимеразная циклическая сборка (PCA): искусственный синтез длинных последовательностей ДНК путем проведения ПЦР на пуле длинных олигонуклеотидов с короткими перекрывающимися сегментами. Олигонуклеотиды чередуются по направлению от 5' к 3' и от 3' к 5', а перекрывающиеся сегменты определяют порядок фрагментов ПЦР, избирательно образуя конечный длинный продукт ДНК. Асимметричная ПЦР: предпочтительно усиливает одну цепь ДНК в двухцепочечной матрице ДНК. Используется в секвенировании и гибридизационном зондировании, когда требуется усиление только одной из двух комплементарных цепей. ПЦР проводится как обычно, но с большим избытком праймера для целевой цепи. Из-за медленного (арифметического) усиления на более поздних стадиях реакции после исчерпания лимитирующего праймера требуются дополнительные циклы ПЦР. Недавняя модификация этого процесса, известная как линейная ПЦР после экспоненциальной фазы (LATE PCR), использует лимитирующий праймер с более высокой температурой плавления (Tm), чем избыточный праймер, для поддержания эффективности реакции по мере снижения концентрации лимитирующего праймера в середине реакции. Конвективная ПЦР: псевдоизотермический способ проведения ПЦР. Вместо многократного нагрева и охлаждения смеси ПЦР раствор подвергается термическому градиенту. Возникающая в результате тепловой нестабильности конвективная циркуляция автоматически перемешивает реагенты ПЦР из горячих и холодных областей, обеспечивая проведение ПЦР. Параметры, такие как термические граничные условия и геометрия корпуса ПЦР, могут быть оптимизированы для получения надежной и быстрой ПЦР за счет использования хаотических полей потока. Такая конвективная установка ПЦР значительно снижает энергопотребление устройства и время его работы. Диаловая ПЦР: высокопараллельный метод для получения точных молекул ДНК для синтеза генов. Сложная библиотека молекул ДНК модифицируется уникальными фланговыми метками перед массовым параллельным секвенированием. Затем праймеры, направленные метками, позволяют извлекать молекулы с желаемыми последовательностями с помощью ПЦР. Цифровая ПЦР (dPCR): используется для измерения количества целевой последовательности ДНК в образце ДНК. Образец ДНК сильно разбавляется, так что после проведения множества ПЦР параллельно некоторые из них не получают ни одной молекулы целевой ДНК. Концентрация целевой ДНК рассчитывается на основе доли отрицательных результатов. Отсюда и название "цифровая ПЦР". Амплификация, зависящая от геликазы: аналогична традиционной ПЦР, но использует постоянную температуру вместо циклов денатурации и отжига/удлинения. Вместо термической денатурации используется ДНК-геликаза, фермент, расплетающий ДНК. ПЦР с горячим стартом: метод, снижающий неспецифическое усиление на начальных этапах настройки ПЦР. Может выполняться вручную путем нагрева компонентов реакции до температуры денатурации (например, 95 °C) перед добавлением полимеразы. Разработаны специализированные ферментные системы, ингибирующие активность полимеразы при комнатной температуре, либо путем связывания антитела, либо наличием ковалентно связанных ингибиторов, которые диссоциируют только после активации при высокой температуре. ПЦР с горячим стартом и холодным завершением достигается с помощью новых гибридных полимераз, которые неактивны при комнатной температуре и мгновенно активируются при температуре удлинения. In silico ПЦР (цифровая ПЦР, виртуальная ПЦР, электронная ПЦР, ePCR) относится к вычислительным инструментам, используемым для расчета теоретических результатов полимеразной цепной реакции с использованием заданного набора праймеров (зондов) для амплификации последовательностей ДНК из секвенированного генома или транскриптома. In silico ПЦР была предложена в качестве образовательного инструмента для молекулярной биологии. Интерсеквенс-специфическая ПЦР (ISSR): метод ПЦР для ДНК-датирования, который усиливает области между простыми повторными последовательностями для получения уникального "отпечатка" длин фрагментов амплификации. Обратная ПЦР: обычно используется для идентификации фланкирующих последовательностей вокруг геномных вставок. Она включает серию перевариваний ДНК и самолигирование, в результате чего на обоих концах неизвестной последовательности оказываются известные последовательности. ПЦР, опосредованная лигированием: использует небольшие линкеры ДНК, лигированные к интересующей ДНК, и несколько праймеров, отжигающихся к линкерам ДНК; использовалась для секвенирования ДНК, "хождения" по геному и картирования отпечатков ДНК. ПЦР, специфичная для метилирования (MSP): разработана Стивеном Бейлином и Джеймсом Г. Германом в Медицинской школе Университета Джонса Хопкинса и используется для обнаружения метилирования CpG-островов в геномной ДНК. ДНК сначала обрабатывается бисульфитом натрия, который превращает неметилированные основания цитозина в урацил, которые распознаются праймерами ПЦР как тимин. Затем на модифицированной ДНК проводятся две ПЦР с использованием наборов праймеров, идентичных, за исключением любых CpG-островов в последовательностях праймеров. В этих точках один набор праймеров распознает ДНК с цитозинами для амплификации метилированной ДНК, а один набор распознает ДНК с урацилом или тимином для амплификации неметилированной ДНК. MSP с использованием qPCR также может быть выполнена для получения количественной, а не качественной информации о метилировании. Минипраймерная ПЦР: использует термостабильную полимеразу (S Tbr), которая может удлиняться от коротких праймеров ("малых олиго"), длиной всего 9 или 10 нуклеотидов. Этот метод позволяет проводить ПЦР с таргетингом на небольшие участки связывания праймеров и используется для амплификации консервативных последовательностей ДНК, таких как 16S (или эукариотическая 18S) рРНК. Мультиплексная ПЦР, зависящая от лигирования (MLPA): позволяет амплифицировать несколько мишеней с одной парой праймеров, тем самым избегая ограничений по разрешению мультиплексной ПЦР (см. ниже). Мультиплексная ПЦР: состоит из нескольких наборов праймеров в одной смеси ПЦР для получения ампликонов разных размеров, специфичных для различных последовательностей ДНК. Путем таргетинга на несколько генов одновременно можно получить дополнительную информацию из одного эксперимента, который в противном случае потребовал бы в несколько раз больше реагентов и времени. Температуры отжига для каждого набора праймеров должны быть оптимизированы для правильной работы в одной реакции, а также размеры ампликонов. То есть их длина в парах оснований должна быть достаточно разной, чтобы образовывать отчетливые полосы при визуализации с помощью электрофореза в геле. ПЦР, усиленная наночастицами (nanoPCR): некоторые наночастицы (NP) могут повысить эффективность ПЦР (и, следовательно, называются nanoPCR), а некоторые даже превосходят исходные усилители ПЦР. Сообщалось, что квантовые точки (QD) могут улучшить специфичность и эффективность ПЦР. Одностенные углеродные нанотрубки (SWCNT) и многостенные углеродные нанотрубки (MWCNT) эффективно усиливают амплификацию длинной ПЦР. Нанопорошок углерода (CNP) может повысить эффективность повторной ПЦР и длинной ПЦР, а оксид цинка, диоксид титана и Ag NP были обнаружены увеличивающими выход ПЦР. Предыдущие данные указывали на то, что неметаллические NP сохраняют приемлемую точность амплификации. Учитывая, что многие NP способны повысить эффективность ПЦР, очевидно, что существует большой потенциал для улучшения технологии nanoPCR и разработки продуктов. Вложенная ПЦР: повышает специфичность амплификации ДНК, снижая фон из-за неспецифического усиления ДНК. Используются два набора праймеров в двух последовательных ПЦР. В первой реакции одна пара праймеров используется для получения продуктов ДНК, которые, помимо целевой, могут все еще со...

Allele specific PCR or The amplification refractory mutation system (ARMS): a diagnostic or cloning technique based on single nucleotide variations (SNVs not to be confused with SNPs) (single base differences in a patient). Any mutation involving single base change can be detected by this system. It requires prior knowledge of a DNA sequence, including differences between alleles, and uses primers whose 3' ends encompass the SNV (base pair buffer around SNV usually incorporated). PCR amplification under stringent conditions is much less efficient in the presence of a mismatch between template and primer, so successful amplification with an SNP specific primer signals presence of the specific SNP or small deletions in a sequence. See SNP genotyping for more information. Assembly PCR or Polymerase Cycling Assembly (PCA): artificial synthesis of long DNA sequences by performing PCR on a pool of long oligonucleotides with short overlapping segments. The oligonucleotides alternate between sense and antisense directions, and the overlapping segments determine the order of the PCR fragments, thereby selectively producing the final long DNA product. Asymmetric PCR: preferentially amplifies one DNA strand in a double stranded DNA template. It is used in sequencing and hybridization probing where amplification of only one of the two complementary strands is required. PCR is carried out as usual, but with a great excess of the primer for the strand targeted for amplification. Because of the slow (arithmetic) amplification later in the reaction after the limiting primer has been used up, extra cycles of PCR are required. A recent modification on this process, known as Linear After The Exponential PCR (LATE PCR), uses a limiting primer with a higher melting temperature (Tm) than the excess primer to maintain reaction efficiency as the limiting primer concentration decreases mid reaction. Convective PCR: a pseudo isothermal way of performing PCR. Instead of repeatedly heating and cooling the PCR mixture, the solution is subjected to a thermal gradient. The resulting thermal instability driven convective flow automatically shuffles the PCR reagents from the hot and cold regions repeatedly enabling PCR. Parameters such as thermal boundary conditions and geometry of the PCR enclosure can be optimized to yield robust and rapid PCR by harnessing the emergence of chaotic flow fields. Such convective flow PCR setup significantly reduces device power requirement and operation time. Dial out PCR: a highly parallel method for retrieving accurate DNA molecules for gene synthesis. A complex library of DNA molecules is modified with unique flanking tags before massively parallel sequencing. Tag directed primers then enable the retrieval of molecules with desired sequences by PCR. Digital PCR (dPCR): used to measure the quantity of a target DNA sequence in a DNA sample. The DNA sample is highly diluted so that after running many PCRs in parallel, some of them do not receive a single molecule of the target DNA. The target DNA concentration is calculated using the proportion of negative outcomes. Hence the name 'digital PCR'. Helicase dependent amplification: similar to traditional PCR, but uses a constant temperature rather than cycling through denaturation and annealing/extension cycles. DNA helicase, an enzyme that unwinds DNA, is used in place of thermal denaturation. Hot start PCR: a technique that reduces non specific amplification during the initial set up stages of the PCR. It may be performed manually by heating the reaction components to the denaturation temperature (e. g., 95 °C) before adding the polymerase. Specialized enzyme systems have been developed that inhibit the polymerase's activity at ambient temperature, either by the binding of an antibody or by the presence of covalently bound inhibitors that dissociate only after a high temperature activation step. Hot start/cold finish PCR is achieved with new hybrid polymerases that are inactive at ambient temperature and are instantly activated at elongation temperature. In silico PCR (digital PCR, virtual PCR, electronic PCR, e PCR) refers to computational tools used to calculate theoretical polymerase chain reaction results using a given set of primers (probes) to amplify DNA sequences from a sequenced genome or transcriptome. In silico PCR was proposed as an educational tool for molecular biology. Intersequence specific PCR (ISSR): a PCR method for DNA fingerprinting that amplifies regions between simple sequence repeats to produce a unique fingerprint of amplified fragment lengths. Inverse PCR: is commonly used to identify the flanking sequences around genomic inserts. It involves a series of DNA digestions and self ligation, resulting in known sequences at either end of the unknown sequence. Ligation mediated PCR: uses small DNA linkers ligated to the DNA of interest and multiple primers annealing to the DNA linkers; it has been used for DNA sequencing, genome walking, and DNA footprinting. Methylation specific PCR (MSP): developed by Stephen Baylin and James G. Herman at the Johns Hopkins School of Medicine, and is used to detect methylation of CpG islands in genomic DNA. DNA is first treated with sodium bisulfite, which converts unmethylated cytosine bases to uracil, which is recognized by PCR primers as thymine. Two PCRs are then carried out on the modified DNA, using primer sets identical except at any CpG islands within the primer sequences. At these points, one primer set recognizes DNA with cytosines to amplify methylated DNA, and one set recognizes DNA with uracil or thymine to amplify unmethylated DNA. MSP using qPCR can also be performed to obtain quantitative rather than qualitative information about methylation. Miniprimer PCR: uses a thermostable polymerase (S Tbr) that can extend from short primers ("smalligos") as short as 9 or 10 nucleotides. This method permits PCR targeting to smaller primer binding regions, and is used to amplify conserved DNA sequences, such as the 16S (or eukaryotic 18S) rRNA gene. Multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA): permits amplifying multiple targets with a single primer pair, thus avoiding the resolution limitations of multiplex PCR (see below). Multiplex PCR: consists of multiple primer sets within a single PCR mixture to produce amplicons of varying sizes that are specific to different DNA sequences. By targeting multiple genes at once, additional information may be gained from a single test run that otherwise would require several times the reagents and more time to perform. Annealing temperatures for each of the primer sets must be optimized to work correctly within a single reaction, and amplicon sizes. That is, their base pair length should be different enough to form distinct bands when visualized by gel electrophoresis. Nanoparticle assisted PCR (nanoPCR): some nanoparticles (NPs) can enhance the efficiency of PCR (thus being called nanoPCR), and some can even outperform the original PCR enhancers. It was reported that quantum dots (QDs) can improve PCR specificity and efficiency. Single walled carbon nanotubes (SWCNTs) and multi walled carbon nanotubes (MWCNTs) are efficient in enhancing the amplification of long PCR. Carbon nanopowder (CNP) can improve the efficiency of repeated PCR and long PCR, while zinc oxide, titanium dioxide and Ag NPs were found to increase the PCR yield. Previous data indicated that non metallic NPs retained acceptable amplification fidelity. Given that many NPs are capable of enhancing PCR efficiency, it is clear that there is likely to be great potential for nanoPCR technology improvements and product development. Nested PCR: increases the specificity of DNA amplification, by reducing background due to non specific amplification of DNA. Two sets of primers are used in two successive PCRs. In the first reaction, one pair of primers is used to generate DNA products, which besides the intended target, may still consist of non specifically amplified DNA fragments. The product(s) are then used in a second PCR with a set of primers whose binding sites are completely or partially different from and located 3' of each of the primers used in the first reaction. Nested PCR is often more successful in specifically amplifying long DNA fragments than conventional PCR, but it requires more detailed knowledge of the target sequences. Overlap extension PCR or Splicing by overlap extension (SOEing) : a genetic engineering technique that is used to splice together two or more DNA fragments that contain complementary sequences. It is used to join DNA pieces containing genes, regulatory sequences, or mutations; the technique enables creation of specific and long DNA constructs. It can also introduce deletions, insertions or point mutations into a DNA sequence. PAN AC: uses isothermal conditions for amplification, and may be used in living cells. PAN PCR: A computational method for designing bacterium typing assays based on whole genome sequence data. Quantitative PCR (qPCR): used to measure the quantity of a target sequence (commonly in real time). It quantitatively measures starting amounts of DNA, cDNA, or RNA. Quantitative PCR is commonly used to determine whether a DNA sequence is present in a sample and the number of its copies in the sample. Quantitative PCR has a very high degree of precision. Quantitative PCR methods use fluorescent dyes, such as Sybr Green, EvaGreen or fluorophore containing DNA probes, such as TaqMan, to measure the amount of amplified product in real time. It is also sometimes abbreviated to RT PCR (real time PCR) but this abbreviation should be used only for reverse transcription PCR. qPCR is the appropriate contractions for quantitative PCR (real time PCR). Reverse Complement PCR (RC PCR): Allows the addition of functional domains or sequences of choice to be appended independently to either end of the generated amplicon in a single closed tube reaction. This method generates target specific primers within the reaction by the interaction of universal primers (which contain the desired sequences or domains to be appended) and RC probes. Reverse Transcription PCR (RT PCR): for amplifying DNA from RNA. Reverse transcriptase reverse transcribes RNA into cDNA, which is then amplified by PCR. RT PCR is widely used in expression profiling, to determine the expression of a gene or to identify the sequence of an RNA transcript, including transcription start and termination sites. If the genomic DNA sequence of a gene is known, RT PCR can be used to map the location of exons and introns in the gene. The 5' end of a gene (corresponding to the transcription start site) is typically identified by RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends). RNase H dependent PCR (rhPCR): a modification of PCR that utilizes primers with a 3' extension block that can be removed by a thermostable RNase HII enzyme. This system reduces primer dimers and allows for multiplexed reactions to be performed with higher numbers of primers. Single specific primer PCR (SSP PCR): allows the amplification of double stranded DNA even when the sequence information is available at one end only. This method permits amplification of genes for which only a partial sequence information is available, and allows unidirectional genome walking from known into unknown regions of the chromosome. Solid Phase PCR: encompasses multiple meanings, including Polony Amplification (where PCR colonies are derived in a gel matrix, for example), Bridge PCR (primers are covalently linked to a solid support surface), conventional Solid Phase PCR (where Asymmetric PCR is applied in the presence of solid support bearing primer with sequence matching one of the aqueous primers) and Enhanced Solid Phase PCR (where conventional Solid Phase PCR can be improved by employing high Tm and nested solid support primer with optional application of a thermal 'step' to favour solid support priming). Suicide PCR: typically used in paleogenetics or other studies where avoiding false positives and ensuring the specificity of the amplified fragment is the highest priority. It was originally described in a study to verify the presence of the microbe Yersinia pestis in dental samples obtained from 14th Century graves of people supposedly killed by the plague during the medieval Black Death epidemic. The method prescribes the use of any primer combination only once in a PCR (hence the term "suicide"), which should never have been used in any positive control PCR reaction, and the primers should always target a genomic region never amplified before in the lab using this or any other set of primers. This ensures that no contaminating DNA from previous PCR reactions is present in the lab, which could otherwise generate false positives. Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL PCR): for isolation of an unknown sequence flanking a known sequence. Within the known sequence, TAIL PCR uses a nested pair of primers with differing annealing temperatures; a degenerate primer is used to amplify in the other direction from the unknown sequence. Touchdown PCR (Step down PCR): a variant of PCR that aims to reduce nonspecific background by gradually lowering the annealing temperature as PCR cycling progresses. The annealing temperature at the initial cycles is usually a few degrees (3–5 °C) above the Tm of the primers used, while at the later cycles, it is a few degrees (3–5 °C) below the primer Tm. The higher temperatures give greater specificity for primer binding, and the lower temperatures permit more efficient amplification from the specific products formed during the initial cycles. Universal Fast Walking: for genome walking and genetic fingerprinting using a more specific 'two sided' PCR than conventional 'one sided' approaches (using only one gene specific primer and one general primer—which can lead to artefactual 'noise') by virtue of a mechanism involving lariat structure formation. Streamlined derivatives of UFW are LaNe RAGE (lariat dependent nested PCR for rapid amplification of genomic DNA ends), 5'RACE LaNe and 3'RACE LaNe.

История

Термостойкие ферменты, являющиеся ключевым компонентом полимеразной цепной реакции, были обнаружены в 1960-х годах как продукт микроорганизма, обитавшего в перегретых водах источника «Грибная роща» в Йеллоустоне. В статье 1971 года в журнале «Molecular Biology» Кьель Клеппе и его коллеги из лаборатории Х. Гобинда Хораны впервые описали метод использования ферментативного анализа для репликации короткого ДНК-шаблона с праймерами in vitro. Однако это раннее проявление базового принципа ПЦР не привлекло особого внимания в то время, и изобретение полимеразной цепной реакции в 1983 году обычно приписывается Кэри Муллису. Когда Муллис разработал ПЦР в 1983 году, он работал в Эмеривилле, штат Калифорния, в компании Cetus Corporation, одной из первых биотехнологических компаний, где отвечал за синтез коротких цепей ДНК. Муллис писал, что идея ПЦР пришла ему в голову во время ночной поездки на автомобиле по шоссе Тихоокеанского побережья. Он размышлял о новом способе анализа изменений (мутаций) в ДНК, когда понял, что вместо этого изобрел метод амплификации любого региона ДНК посредством повторяющихся циклов дупликации, управляемых ДНК-полимеразой. В журнале «Scientific American» Муллис суммировал процедуру следующим образом: «Начиная с одной молекулы генетического материала ДНК, ПЦР может генерировать 100 миллиардов подобных молекул за один день. Реакция проста в исполнении. Для ее проведения требуется лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла». ДНК-идентификация впервые была использована для установления отцовства в 1988 году. Муллис утверждает, что его опыт использования ЛСД был неотъемлемой частью разработки ПЦР: «Сомневаюсь, что я бы изобрел ПЦР, если бы не принимал ЛСД. Я мог сидеть на молекуле ДНК и наблюдать за движением полимеров. Этому я научился отчасти благодаря психоделическим препаратам». Муллис и биохимик Майкл Смит, разработавший другие важные методы манипулирования ДНК, совместно получили Нобелевскую премию по химии в 1993 году, через семь лет после того, как Муллис и его коллеги из Cetus впервые применили его предложение на практике. Работа Муллиса совместно с Р.К. Саики и Х.А. Эрлихом в 1985 году, «Энзимное усиление геномных последовательностей β-глобина и анализ участков рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии» – изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) – была удостоена награды «Citation for Chemical Breakthrough» от Отдела истории химии Американского химического общества в 2017 году, врученной компанией DuPont. Швейцарская фармацевтическая компания Hoffmann La Roche приобрела права на патенты в 1992 году. Последний из коммерческих патентов на ПЦР истек в 2017 году. Связанная с этим патентная борьба за фермент Taq-полимеразу все еще продолжается в нескольких юрисдикциях по всему миру между компаниями Roche и Promega. Юридические аргументы вышли за рамки срока действия первоначальных патентов на ПЦР и Taq-полимеразу, которые истекли 28 марта 2005 года.

The heat resistant enzymes that are a key component in polymerase chain reaction were discovered in the 1960s as a product of a microbial life form that lived in the superheated waters of Yellowstone's Mushroom Spring. A 1971 paper in the Journal of Molecular Biology by Kjell Kleppe and co workers in the laboratory of H. Gobind Khorana first described a method of using an enzymatic assay to replicate a short DNA template with primers in vitro. However, this early manifestation of the basic PCR principle did not receive much attention at the time and the invention of the polymerase chain reaction in 1983 is generally credited to Kary Mullis. When Mullis developed the PCR in 1983, he was working in Emeryville, California for Cetus Corporation, one of the first biotechnology companies, where he was responsible for synthesizing short chains of DNA. Mullis has written that he conceived the idea for PCR while cruising along the Pacific Coast Highway one night in his car. He was playing in his mind with a new way of analyzing changes (mutations) in DNA when he realized that he had instead invented a method of amplifying any DNA region through repeated cycles of duplication driven by DNA polymerase. In Scientific American, Mullis summarized the procedure: "Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents, and a source of heat." DNA fingerprinting was first used for paternity testing in 1988. Mullis has credited his use of LSD as integral to his development of PCR: "Would I have invented PCR if I hadn't taken LSD? I seriously doubt it. I could sit on a DNA molecule and watch the polymers go by. I learnt that partly on psychedelic drugs." Mullis and biochemist Michael Smith, who had developed other essential ways of manipulating DNA, were jointly awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1993, seven years after Mullis and his colleagues at Cetus first put his proposal to practice. Mullis's 1985 paper with R. K. Saiki and H. A. Erlich, "Enzymatic Amplification of β globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia"—the polymerase chain reaction invention (PCR)—was honored by a Citation for Chemical Breakthrough Award from the Division of History of Chemistry of the American Chemical Society in 2017. brought by DuPont. The Swiss pharmaceutical company Hoffmann La Roche purchased the rights to the patents in 1992. The last of the commercial PCR patents expired in 2017. A related patent battle over the Taq polymerase enzyme is still ongoing in several jurisdictions around the world between Roche and Promega. The legal arguments have extended beyond the lives of the original PCR and Taq polymerase patents, which expired on 28 March 2005.