Кездейсоқ ДНК тізбектерін анықтау әдісі

Кіріспе

Генетикада, дробовикпен тізбектеу – кездейсоқ ДНК тізбектерін анықтауға қолданылатын әдіс. Оның атауы, дробовикпен шашырап атылған, құрамында белгілі бір рет жоқ оқтардың жиынтығына ұқсас. ДНК тізбегін аяқтау әдісі ("Сэнгер тізбектеуі") тек 100-ден 1000 негіз жұбына дейінгі қысқа ДНК тізбектері үшін ғана қолданылады. Осы өлшем шектеуіне байланысты, ұзын тізбектер жеке-жеке анықтауға болатын кішірек фрагменттерге бөлінеді, содан кейін осы тізбектер біріктіріліп, толық тізбек құрастырылады. Дробовикпен тізбектеуде ДНК кездейсоқ түрде көптеген кішкентай сегменттерге бөлінеді, олар тізбекті аяқтау әдісі арқылы оқылады. Мақсатты ДНК-ның бірнеше қайталама оқуларын алу үшін осы фрагментация және тізбектеу процесі бірнеше рет қайталанады. Компьютерлік бағдарламалар әртүрлі оқулардың үстіне жабатын бөліктерін пайдаланып, оларды үздіксіз тізбекке жинастырады.

Тарих

Кіші (4000-ден 7000-ға дейінгі негіз жұптары) геномдар үшін толық геномдық кездейсоқ тізбектеу 1979 жылы алғаш ұсынылған.

Жұпталған-соңындағы реттілік

Жұптық ұштарды секвенирлеу, көбінесе «екі түтікшелі дробовикпен секвенирлеу» деп аталатын әдіс, кеңінен қолданылды. ДНК тізбектерін анықтау жобалары ұзақ және күрделі ДНК тізбектерімен айналыса бастағанда, көптеген топтар ДНК фрагментінің екі ұшын секвенирлеу арқылы пайдалы ақпарат алуға болатынын түсінді. Бір фрагменттің екі ұшын секвенирлеу және жұптастырылған деректерді сақтау, екі бөлек фрагменттің бір ұшын секвенирлеуге қарағанда қиын болғанымен, екі тізбектің қарама-қарсы бағытта орналасқандығы және олардың арасындағы қашықтықтың фрагмент ұзындығына шамалас екенін білу, бастапқы нысана фрагментінің тізбегін қайта құру үшін өте құнды болды. Тарих. Жұптық ұштарды қолданудың алғашқы жарияланған мысалы 1990 жылы адамның HGPRT локусын секвенирлеу кезінде болды, бірақ жұптық ұштарды қолдану дәстүрлі дробовикпен секвенирлеу әдісінен кейін саңылауларды жабумен ғана шектелді. Тұрақты ұзындығы бар фрагменттерді ескере отырып, таза жұптық ұштарды секвенирлеу стратегиясының алғашқы теориялық сипаттамасы 1991 жылы жарық көрді. Сол кезде қауымдастық консенсусы бойынша, жұптық ұштарды секвенирлеу үшін оптималды фрагмент ұзындығы секвенирлеу оқу ұзындығынан үш есе артық болуы керек еді. 1995 жылы Roach және әріптестері әртүрлі өлшемдегі фрагменттерді пайдаланудың инновациясын енгізіп, үлкен нысаналарда таза жұптық ұштарды секвенирлеу стратегиясының мүмкін екенін көрсетті. Бұл стратегияны кейіннен 1995 жылы The Institute for Genomic Research (TIGR) Haemophilus influenzae бактериясының геномын, ал 2000 жылы Celera Genomics Drosophila melanogaster (жеміс шыбыны) геномын, содан кейін адам геномын секвенирлеу үшін қабылдады.

Қадамдасу

Стратегияны қолдану үшін жоғары молекулалық салмақты ДНК тізбегі кездейсоқ фрагменттерге бөлінеді, олардың мөлшері таңдалады (әдетте 2, 10, 50 және 150 кб), содан кейін тиісті векторға клондалады. Клондар екі бастан тізбекті тоқтату әдісімен секвенирленеді, нәтижесінде екі қысқа тізбек алынады. Әрбір тізбек "ұшқыш оқылым" немесе 1-оқылым және 2-оқылым деп аталады, ал бір клондан алынған екі оқылым "жұптасқан оқылымдар" деп аталады. Тізбекті тоқтату әдісі көбінесе 500 мен 1000 негіз ұзындығындағы оқылымдарды ғана бере алатындықтан, ең кішкентай клондардан басқа барлық жағдайларда жұптасқан оқылымдардың қабаттасуы сирек кездеседі.

Құрастыру

Түпнұсқа реттілік реттілік құрастыру бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып, оқылымдардан қайта құрастырылады. Алдымен, өзара жапсысқан оқылымдар контигтер деп аталатын ұзын құрастырылған реттіліктерге біріктіріледі. Контигтер жұпталған оқылымдар арасындағы байланыстарды анықтау арқылы скаффолдтарға біріктірілуі мүмкін. Кітапхананың орташа фрагмент ұзындығы белгілі болса және ауытқу диапазоны тар болса, жұпталған оқылымдардың орналасуынан контигтер арасындағы қашықтықты есептеуге болады. Контигтер арасындағы саңылаудың көлеміне қарай, саңылаудағы реттілікті табу үшін әртүрлі әдістер қолданылады. Егер саңылау кішкентай болса (5-20 кб), аймақты күшейту үшін полимераза тізбектік реакциясы (ПТР) жүргізіліп, содан кейін реттіктеледі. Егер саңылау үлкен болса (>20 кб), онда үлкен фрагмент бактериялық жасанды хромосомалар (ЖЖХ) сияқты арнайы векторларға клондаланып, содан кейін вектор реттіктеледі.

Артықшылықтары мен кемшіліктері

Бұл тәсілді жақтаушылар үлкен секвенсерлер массивін пайдаланып, геномды бірден толығымен секвенциялау мүмкін екенін айтады, бұл процесті дәстүрлі әдістерге қарағанда әлдеқайда тиімді етеді. Оған қарсы шығушылар, техника ДНК-ның үлкен бөліктерін жылдам секвенцияласа да, осы бөліктерді дұрыс байланыстыру қабілеті күмәнді екенін, әсіресе қайталанатын аймақтары бар эукариоттық геномдар үшін айтады. Тізбек құрастыру бағдарламалары күрделене түскенде және есептеу қуаты арзандағанда, бұл шектеуді жеңу мүмкін болады.

Қақпақ

Қаптама (оқу тереңдігі немесе тереңдік) – қайта құрастырылған тізбектегі берілген нуклеотидті көрсететін оқулардың орташа саны. Оны бастапқы геномның ұзындығы (G), оқулардың саны (N) және орташа оқу ұзындығы (L) арқылы есептеуге болады. Мысалы, 500 нуклеотид орташа ұзындығы бар 8 оқудан қайта құрастырылған 2000 негіз жұптарынан тұратын гипотетикалық геном 2x қайталануға ие болады. Бұл параметр басқа шамаларды бағалауға да мүмкіндік береді, мысалы, оқулармен қамтылған геномның проценті (кейде оны жабу десе де болады). Shotgun тізбектеуінде жоғары қаптама қажет, себебі ол базаны анықтаудағы және тізбектеудегі қателерді жоюға көмектеседі. ДНҚ тізбектеу теориясы мұндай шамалардың арақатынастарын қарастырады. Кейде тізбек қаптамасы мен физикалық қаптама арасында айырма жасалады. Тізбек қаптамасы – базаның оқылуының орташа саны (жоғарыда сипатталғандай). Физикалық қаптама – базаның оқылуының немесе жұптасқан оқулармен аралықта жатуының орташа саны.

Иерархиялық шабуылдар реті

Теориялық тұрғыдан алғанда, кез келген мөлшердегі геномға тікелей қолдану мүмкін болғанымен, оның ірі геномдарды (мысалы, адам геномын) тізбектеудегі тікелей қолданылуы 1990 жылдардың соңына дейін шектелді. Осы кездегі технологиялық жетістіктер процеске қатысты күрделі деректердің көп көлемін практикалық тұрғыда өңдеуге мүмкіндік берді. Тарихи тұрғыдан алғанда, толық геномдық шұңқыр тізбектеуінің ірі геномдардың өте үлкен көлемімен және ірі геномдардағы қайталанатын ДНҚ-ның жоғары пайызымен (адам геномы үшін 50%-дан астам) күрделенеді деп есептелді. Ірі геномның толық геномдық шұңқыр тізбегінің сенімді деректерді беретіні кеңінен қабылданбады. Осы себептерге байланысты, шұңқыр тізбектеуді жүргізу алдында тізбек құрастырудың есептеулік жүктемесін азайтатын басқа стратегияларды қолдану қажет болды. Осылайша, жоғары өнімді тізбектеу мен құрастырудың ең аз көлемі қамтамасыз етілді. Көбейтілген геном алдымен ірі фрагменттерге (50-200 кб) бөлініп, BAC немесе P1 туынды жасанды хромосомалар (PAC) арқылы бактериялық қабылдаушыға клондалады. Геномның бірнеше көшірмелері кездейсоқ бөлінгендіктен, бұл клондардағы фрагменттердің ұштары әртүрлі болады. Ал жеткілікті жабумен (жоғарыдағы бөлімді қараңыз) бүкіл геномды қамтитын ең кіші BAC контигтерінің эшафолдын табу теориялық тұрғыдан мүмкін. Бұл эшафолд ең төменгі плиткалық жол деп аталады. Плиткалық жол табылғаннан кейін, осы жолды құрайтын BAC-тер кездейсоқ түрде кіші фрагменттерге бөлініп, шұңқыр әдісімен кішкентай масштабта тізбектеуге қолданылады. BAC контигтерінің толық тізбегі белгісіз болғанымен, олардың бір-біріне қатысты бағыттары белгілі. Бұл реттілікті анықтау және плиткалық жолды құрайтын BAC-терді таңдау үшін бірнеше әдістер бар. Жалпы стратегияда клондардың бір-біріне қатысты орналасуын анықтау және содан кейін қызығушылық тудыратын бүкіл аумақты қамтитын үздіксіз эшафолд құру үшін қажетті ең аз клондарды таңдау көзделген. Клондардың реті олардың бір-бірімен қалай жабысатынын анықтау арқылы анықталады. Бір-бірімен жабысқан клондарды бірнеше тәсілмен анықтауға болады. STS (тізбектелген сайтты) қамтитын радиоактивті немесе химиялық түрде белгіленген кішкентай зондты, клондар басылған микромассивке гибридтеуге болады. Бұл жоғары жабуды қамтамасыз етеді, бірақ тізбек құрастыру процесі есептеу жағынан күрделірек. Бұл технологиялар Сангер тізбектеуіне қарағанда әлдеқайда артықшылықты, өйткені деректердің көлемі көп және бүкіл геномды тізбектеу үшін салыстырмалы түрде аз уақыт қажет.

Although shotgun sequencing can in theory be applied to a genome of any size, its direct application to the sequencing of large genomes (for instance, the human genome) was limited until the late 1990s, when technological advances made practical the handling of the vast quantities of complex data involved in the process. Historically, full genome shotgun sequencing was believed to be limited by both the sheer size of large genomes and by the complexity added by the high percentage of repetitive DNA (greater than 50% for the human genome) present in large genomes. It was not widely accepted that a full genome shotgun sequence of a large genome would provide reliable data. For these reasons, other strategies that lowered the computational load of sequence assembly had to be utilized before shotgun sequencing was performed. In this way, the minimum amount of high throughput sequencing and assembly is required. The amplified genome is first sheared into larger pieces (50 200kb) and cloned into a bacterial host using BACs or P1 derived artificial chromosomes (PAC). Because multiple genome copies have been sheared at random, the fragments contained in these clones have different ends, and with enough coverage (see section above) finding the smallest possible scaffold of BAC contigs that covers the entire genome is theoretically possible. This scaffold is called the minimum tiling path. Once a tiling path has been found, the BACs that form this path are sheared at random into smaller fragments and can be sequenced using the shotgun method on a smaller scale. Although the full sequences of the BAC contigs is not known, their orientations relative to one another are known. There are several methods for deducing this order and selecting the BACs that make up a tiling path. The general strategy involves identifying the positions of the clones relative to one another and then selecting the fewest clones required to form a contiguous scaffold that covers the entire area of interest. The order of the clones is deduced by determining the way in which they overlap. Overlapping clones can be identified in several ways. A small radioactively or chemically labeled probe containing a sequence tagged site (STS) can be hybridized onto a microarray upon which the clones are printed. This results in high coverage, but the assembly process is much more computationally intensive. These technologies are vastly superior to Sanger sequencing due to the high volume of data and the relatively short time it takes to sequence a whole genome.

Метагеномдық шұңқыр реттілігі

400-500 негіз жұптары ұзындығындағы оқылымдар, ДНК қай организмнен алынғанын анықтау үшін жеткілікті, егер оның геномы белгілі болса, мысалы, k-мерге негіделген таксономиялық жіктегіш бағдарламалық қамтамасы қолданыла отырып. Қоршаған ортадан алынған үлгінің жаңа буын тізбектеуінен миллиондаған оқылымдар арқылы мыңдаған түрлерді қамтитын кез келген күрделі микробиом туралы толық көрініс алуға болады, мысалы, ішек флорасы. 16S рРНА ампликондық тізбектеуге қарағанда артықшылықтары: бактериялармен ғана шектелмеу; ампликондық тізбектеу тек туыс деңгейін анықтаса, штамдық деңгейде жіктеу; және метагеномның бір бөлігі ретінде толық гендерді бөліп алып, олардың қызметін анықтау мүмкіндігі. Метагеномдық тізбектеудің жоғары сезімталдығы оны клиникалық қолдану үшін тартымды етеді. Дегенмен, бұл үлгінің немесе тізбектеу процесінің ластану мәселесін күшейтеді.