Кіріспе

Бір-біріне жабысатын ДНҚ сегменттерінің жиынтығы, олар бірге ДНҚ-ның консенсус аймағын көрсетеді. ДНҚ тізбектеуде контиг – бұл термин.

Контиг (contiguous сөзінен алынған) – бір-біріне жабысатын ДНҚ сегменттерінің жиынтығы, олар бірге ДНҚ-ның консенсус аймағын көрсетеді. Төменнен жоғары тізбектеу жобаларында контиг – біріне бірі ілеспелі тізбек деректерін (оқылымдарды) білдіреді; ал жоғарыдан төмен тізбектеу жобаларында контиг – біріне бірі ілеспелі клондарды білдіреді, олар тізбектеу мен құрастыруға бағыт беру үшін қолданылатын геномның физикалық картасын құрайды. Сондықтан контигтер контекстке байланысты ДНК-ның бір-біріне жанасатын тізбектеріне де, клондардағы бір-біріне жанасатын физикалық сегменттерге (фрагменттерге) де сілтеме жасай алады.

Контигтің бастапқы анықтамасы

1980 жылы Стаден былай деп жазды: "Шота" әдісімен алынған деректерімізді талқылауды жеңілдету мақсатында біз "контиг" деген сөзді енгіздік. Контиг – бұл тізбектерінің қабаттасуы арқасында бір-бірімен байланысқан гельдік оқылымдардың жиынтығы. Барлық гельдік оқылымдар бір ғана контигке жатады, және әрбір контигте кем дегенде бір гельдік оқылым болады. Контигтегі гельдік оқылымдарды қосып, үзділіссіз консенсус тізбегін құруға болады, ал осы тізбектің ұзындығы контигтің ұзындығымен анықталады.

Тізбелік контигтер

Контигті реттілік – төменнен жоғарыға қарай реттілік стратегиясымен жасалған кішкентай ДНК фрагменттерін қайта құрастыру нәтижесінде пайда болатын үздіксіз (бірімен бірі жалғасқан емес) реттілік. Контигтің осы мағынасы Роджер Стаденнің (1979) бастапқы анықтамасына сәйкес келеді. ДНК-ны төменнен жоғарыға қарай тізбектеу стратегиясы геномдық ДНК-ны көптеген кішкентай фрагменттерге ("төменге") бөлуді, осы фрагменттерді тізбектеп, оларды контигтерге қайта жинап, соңында толық геномды ("жоғарыға") құруды қамтиды. Қазіргі технология ДНК-ның салыстырмалы түрде қысқа (300–1000 нуклеотид) фрагменттерін ғана тікелей тізбектеуге мүмкіндік беретіндіктен, геномдық ДНК-ны тізбектеу алдында кішкентай бөліктерге бөлу қажет. Төменнен жоғарыға қарай тізбектеу жобаларында күшейтілген ДНК кездейсоқ түрде тізбектеуге қолайлы өлшемдегі фрагменттерге бөлінеді. Осы фрагменттердің тізбектерін қамтитын деректер – келесі тізбектелген оқылымдар деректер базасына енгізіледі. Құрастыру бағдарламалық жасақтамасы осы оқылымдардан құрастырылған контигтердің бағыты туралы қосымша ақпаратты ұсынады және оларды эшафолдтар деп аталатын процесте құрастыруға мүмкіндік береді. Эшафолдтар – белгілі ұзындықтағы саңылаулармен бөлінген, бір-бірімен жабысатын контигтерден тұрады. Контигтердің бағытына қойылған жаңа шектеулер геномдағы жоғары қайталанатын тізбектерді орналастыруға мүмкіндік береді. Егер бір оқылымның соңында қайталанатын тізбек болса, оның жұптық серігі контигтің ішінде орналасқан болса, оның орналасуы белгілі болады. Эшафолдтардағы контигтер арасындағы қалған саңылауларды әртүрлі әдістермен, соның ішінде ПТР көбейту арқылы, содан кейін тізбектеу (кішкентай саңылаулар үшін) және BAC клондау әдістері арқылы, содан кейін үлкен саңылаулар үшін тізбектеу арқылы толтыруға болады.

BAC контигтері

Контиг – жоғарыдан төменге немесе иерархиялық тізбектеу стратегиясы қолданылғанда хромосоманың физикалық картасын құрайтын, бірін-бірімен үстіне жабысатын клондарды да білдіре алады. Бұл тізбектеу әдісінде геномның тізбектелген фрагменттерін кейін құрастыруға бағыт беру үшін, тізбектеуден бұрын төмен ажыратымды карта жасалады. Бұл карта тізбектеу үшін қолданылған клондардың салыстырмалы орналасуын және бірін-бірімен жабысуын анықтайды. ДНК-ның үздіксіз бөлігін құрайтын, бірін-бірімен жабысатын клондар жиынтығы контигтер деп аталады; толық хромосоманы қамтитын контигті құрайтын ең аз клондар саны тізбектеу үшін қолданылатын плиткалау жолын құрайды. Плиткалау жолы таңдалғаннан кейін, оның құрамдас бөліктері BAC-тар кішкентай фрагменттерге бөлініп, тізбектеледі. Сондықтан контигтер иерархиялық тізбектеу үшін негіз болып табылады. Контиг картасын құрастыру бірнеше қадамды қамтиды. Біріншіден, ДНҚ үлкен (50–200 кб) фрагменттерге бөлініп, BAC немесе PAC-қа клондалып, BAC кітапханасы құрылады. Бұл клондар геномның/хромосоманың барлық бөлігін қамтуы керек болғандықтан, теориялық тұрғыдан толық хромосоманы қамтитын BAC контигін құрастыру мүмкін. Бірақ шындықта бәрі идеалды бола бермейді. Көбінесе олқылықтар қалады, ал карта аймағын қамтитын контигтер мен олқылықтардан тұратын іргетас көбінесе алғашқы нәтиже болып табылады. Контигтер арасындағы олқылықтар төменде сипатталған әртүрлі әдістермен жабылады.

BAC контигінің құрылысы

BAC контигтері әртүрлі әдістер арқылы белгілі бір жапсарласқан BAC аймақтарын сәйкестендіру арқылы құрастырылады. Бір әдеттегі стратегия – BAC-тер арасындағы ортақ бірегей ДНК сайттарын анықтау үшін тізбектік таңбаланған сайттардың (STS) мазмұнын карталауды пайдалану. Жабысу дәрежесі екі клондағы ортақ STS маркерлерінің санымен шамамен бағаланады, көп маркерлер ортақ болса, жабысу деңгейі жоғары болады. Бұл стратегия жабысуды тек шамамен бағалауға мүмкіндік беретіндіктен, клондардың жабысуын дәлірек өлшеу үшін рестрикциялық ферменттермен кесу фрагменттерін талдау жиі қолданылады. Бұл стратегияда клондар бір немесе екі рестрикциялық ферментпен өңделеді және нәтижеде алынған фрагменттер гельдік электрофорез арқылы бөлінеді. Егер екі клонда ортақ рестрикциялық сайттар болса, олар бірнеше фрагменттерді ортақ пайдаланады. Фрагменттердің саны мен ұзындығы белгілі болғандықтан (ұзындығы өлшем стандартымен салыстыру арқылы анықталады), жабысу дәрежесін жоғары дәлдікпен анықтауға болады.

Контигтер арасындағы саңылаулар

Бастапқы BAC контиг құрастырылғаннан кейін олқылықтар жиі кездеседі. Бұл олқылықтар бактериялық жасанды хромосома (BAC) кітапханасының күрделілігі төмен болғанда, яғни онда жеткілікті STS немесе шектеу ферменттерінің орындары болмаса, немесе кітапханада кейбір аймақтар клондаушы организмдерде тұрақсыздық салдарынан аз өкілдік еткенде пайда болады. STS белгілерін картаға түсіру және шектеу ферменттерінің саусақ іздерін алу процедураларынан кейін контигтер арасындағы олқылықтар қалса, контигтердің шеттерін секвендеу арқылы оларды жабуға болады. Бұл шеттік секвендеу стратегиясы басқа контигтерді тексеру үшін жаңа STS құруға мүмкіндік береді. Балама ретінде, контигтің шеттік секвенциясын олқылықты аралау үшін праймер ретінде қолдануға болады.