Введение

Пробный прибор для выявления биологических молекул – биосенсор – это аналитическое устройство, используемое для обнаружения химического вещества, которое объединяет биологический компонент с физико-химическим детектором. Чувствительный биологический элемент, например, ткань, микроорганизмы, органеллы, клеточные рецепторы, ферменты, антитела, нуклеиновые кислоты и т.д., представляет собой биологически полученный материал или биомиметический компонент, который взаимодействует с анализируемым веществом, связывается с ним или распознает его. Биологически чувствительные элементы также могут быть созданы с помощью биологической инженерии. Преобразователь или детекторный элемент, преобразующий один сигнал в другой, работает физико-химическим способом: оптическим, пьезоэлектрическим, электрохимическим, электрохемилюминесцентным и т.д., в результате взаимодействия аналита с биологическим элементом, что позволяет легко измерять и количественно определять его. Устройство для считывания биосенсора подключается к соответствующей электронике или процессорам сигналов, которые в основном отвечают за отображение результатов в удобном для пользователя формате. Иногда это является самой дорогой частью сенсорного устройства, однако возможно создание удобного для пользователя дисплея, включающего преобразователь и чувствительный элемент (голографический датчик). Устройства считывания обычно разрабатываются и изготавливаются по индивидуальному заказу в соответствии с различными принципами работы биосенсоров.

Система биосенсоров

Биосенсор обычно состоит из биорецептора (фермент/антитело/клетка/нуклеиновая кислота/аптамер), компонента преобразователя (полупроводящий материал/наноматериал) и электронной системы, включающей усилитель сигнала, процессор и дисплей. Преобразователи и электроника могут быть объединены, например, в микросенсорных системах на основе КМОП-технологии. Компонент распознавания, часто называемый биорецептором, использует биомолекулы, полученные из организмов, или рецепторы, созданные по образу биологических систем, для взаимодействия с анализируемым веществом. Это взаимодействие измеряется биотрансдуктором, который выдает измеримый сигнал, пропорциональный концентрации целевого аналита в образце. Основная цель разработки биосенсора – обеспечить быстрое и удобное тестирование непосредственно в месте отбора или анализа образца.

Биорецепторы

В биосенсоре биорецептор разработан для взаимодействия с конкретным аналитом, представляющим интерес, с целью создания эффекта, измеримого преобразователем. Высокая селективность к аналиту в сложной среде других химических или биологических компонентов является ключевым требованием к биорецептору. Тип используемой биомолекулы может значительно варьироваться, однако биосенсоры можно классифицировать по распространенным типам биорецепторных взаимодействий, таким как: антитело/антиген, фермент/лиганд, нуклеиновая кислота/ДНК, клеточные структуры/клетки или биомиметические материалы.

Взаимодействие антитела и антигена

Иммуносенсор использует высокую специфичность связывания антител с конкретным соединением или антигеном. Специфичность взаимодействия антитела и антигена аналогична принципу "ключ-замок": антиген связывается с антителом только при наличии правильной конформации. События связывания приводят к физико-химическим изменениям, которые, в сочетании с трассером – например, флуоресцентными молекулами, ферментами или радиоизотопами – могут генерировать сигнал. Существуют ограничения при использовании антител в сенсорах: 1. Способность антител к связыванию сильно зависит от условий проведения анализа (например, pH и температуры), и 2. взаимодействие антигена и антитела обычно достаточно устойчиво, однако связывание может быть нарушено хаотропными реагентами, органическими растворителями или даже ультразвуковым излучением. Взаимодействие антигенов и антител также может применяться для серологических тестов или обнаружения циркулирующих антител в ответ на конкретное заболевание. Важно отметить, что серологические тесты стали важной частью глобальных мер по борьбе с пандемией COVID-19.

Искусственные связующие белки

Использование антител в качестве биораспознающего компонента биосенсоров имеет ряд недостатков. Они обладают высоким молекулярным весом и ограниченной стабильностью, содержат необходимые дисульфидные связи и дороги в производстве. Для преодоления этих ограничений был разработан подход, основанный на использовании рекомбинантных связывающих фрагментов (Fab, Fv или scFv) или доменов (VH, VHH) антител. Альтернативным подходом является конструирование небольших белковых каркасов с благоприятными биофизическими свойствами для создания искусственных семейств антиген-связывающих белков (АгСБ), способных к специфическому связыванию с различными целевыми белками, сохраняя при этом благоприятные свойства исходной молекулы. Элементы этих семейств, специфически связывающиеся с заданным целевым антигеном, часто отбираются in vitro с использованием методов дисплея: фагового дисплея, рибосомного дисплея, дисплея на дрожжах или дисплея мРНК. Искусственные связывающие белки значительно меньше антител (обычно менее 100 аминокислотных остатков), обладают высокой стабильностью, лишены дисульфидных связей и могут быть экспрессированы с высоким выходом в восстановительных клеточных средах, таких как бактериальная цитоплазма, в отличие от антител и их производных. Таким образом, они особенно подходят для создания биосенсоров.

Энзимные взаимодействия

Специфические связывающие способности и каталитическая активность ферментов делают их популярными биорецепторами. Распознавание аналита обеспечивается несколькими возможными механизмами: 1) фермент преобразует аналит в продукт, который может быть обнаружен сенсором, 2) обнаружение ингибирования или активации фермента аналитом, или 3) мониторинг изменения свойств фермента, вызванного взаимодействием с аналитом. Использование рецепторов аффинного связывания в биосенсорных целях было предложено Шульцем и Симсом в 1979 году и впоследствии реализовано в флуоресцентном анализе для измерения глюкозы в соответствующем физиологическом диапазоне от 4,4 до 6,1 ммоль/л. Преимуществом принципа работы сенсора является то, что он не расходует аналит в химической реакции, как это происходит в ферментативных методах анализа.

Взаимодействие нуклеиновых кислот

Биосенсоры, использующие рецепторы на основе нуклеиновых кислот, могут быть основаны либо на взаимодействиях комплементарных пар оснований, известные как геносенсоры, либо на специфических имитаторах антител на основе нуклеиновых кислот (аптамерах), как аптасенсоры. В первом случае процесс распознавания основан на принципе комплементарного спаривания оснований – аденин:тимин и цитозин:гуанин в ДНК. Если известна целевая последовательность нуклеиновой кислоты, можно синтезировать, пометить и иммобилизовать на сенсоре комплементарные последовательности. Событие гибридизации может быть обнаружено оптически, что позволяет установить наличие целевой ДНК/РНК. Во втором случае аптамеры, созданные к целевому веществу, распознают его посредством комплекса специфических нековалентных взаимодействий и индуцированной конформации. Эти аптамеры можно легко маркировать флуорофором или металлическими наночастицами для оптического детектирования, либо использовать для безмаркерных электрохимических или канстилеверных платформ обнаружения широкого спектра целевых молекул или сложных объектов, таких как клетки и вирусы. Кроме того, аптамеры можно комбинировать с нуклеиновыми кислотными ферментами, такими как ДНК-зимы, расщепляющие РНК, обеспечивая как распознавание цели, так и генерацию сигнала в одной молекуле, что открывает перспективы для разработки мультиплексных биосенсоров.

Эпигенетика

Было предложено, что правильно оптимизированные интегрированные оптические резонаторы могут быть использованы для обнаружения эпигенетических модификаций (например, метилирования ДНК, посттрансляционных модификаций гистонов) в биологических жидкостях пациентов, страдающих раком или другими заболеваниями. В настоящее время на исследовательском уровне разрабатываются фотонные биосенсоры с ультравысокой чувствительностью для простого обнаружения раковых клеток в моче пациента. Различные исследовательские проекты направлены на разработку новых портативных устройств, использующих недорогие, экологически безопасные одноразовые картриджи, требующие простого обращения и не нуждающиеся в дальнейшей обработке, промывке или манипуляциях со стороны квалифицированных специалистов.

Органелы

Органеллы формируют отдельные компартменты внутри клеток и обычно выполняют функции независимо. Различные типы органелл обладают разнообразными метаболическими путями и содержат ферменты для реализации своих функций. К часто используемым органеллам относятся лизосомы, хлоропласты и митохондрии. Пространственно-временное распределение кальция тесно связано с повсеместными сигнальными путями. Митохондрии активно участвуют в метаболизме ионов кальция для контроля функций и модулируют связанные с кальцием сигнальные пути. Эксперименты показали, что митохондрии способны реагировать на высокие концентрации кальция, образующиеся вблизи них, путем открытия кальциевых каналов. Таким образом, митохондрии могут быть использованы для определения концентрации кальция в среде, и такое определение отличается высокой чувствительностью благодаря высокой пространственной разрешающей способности. Другое применение митохондрий – обнаружение загрязнения воды. Токсичность детергентов повреждает клеточную и субклеточную структуру, включая митохондрии. Детергенты вызывают эффект набухания, который можно измерить изменением поглощения. Экспериментальные данные показывают, что скорость изменения пропорциональна концентрации детергента, обеспечивая высокую точность определения.

Клетки

Клетки часто используются в биорецепторах, поскольку они чувствительны к окружающей среде и способны реагировать на различные стимуляторы. Клетки склонны к адгезии к поверхности, что облегчает их иммобилизацию. По сравнению с органеллами, они сохраняют активность в течение более длительного времени, а воспроизводимость результатов позволяет использовать их повторно. Они обычно применяются для определения глобальных параметров, таких как состояние стресса, токсичность и органические соединения. Также их можно использовать для мониторинга эффективности лекарственного лечения. Одно из применений – использование клеток для определения гербицидов, являющихся основными загрязнителями водных экосистем. Микроводоросли заключают в кварцевое микроволокно, а модифицированная гербицидами флуоресценция хлорофилла собирается на конце пучка оптических волокон и передается на флуориметр. Водоросли непрерывно культивируют для оптимизации измерений. Результаты показывают, что предел обнаружения определенных гербицидов может достигать суб-ppb уровня концентрации. Некоторые клетки также могут использоваться для мониторинга микробиологической коррозии. Pseudomonas sp. выделена с поверхности корродированного материала и иммобилизована на ацетилцеллюлозной мембране. Дыхательная активность определяется путем измерения потребления кислорода. Наблюдается линейная зависимость между генерируемым током и концентрацией серной кислоты. Время отклика связано с загрузкой клеток и условиями окружающей среды и может быть ограничено 5 минутами.

Биосенсоры микробов

Микробные биосенсоры используют реакцию бактерий на определенное вещество. Например, мышьяк можно обнаружить, используя оперон *ars*, встречающийся у нескольких таксонов бактерий.

Прикрепление биологических элементов к поверхности

Важной частью биосенсора является прикрепление биологических элементов (малые молекулы/белок/клетки) к поверхности датчика (будь то металл, полимер или стекло). Самый простой способ – функционализировать поверхность для покрытия ее биологическими элементами. Это можно сделать с помощью полилизина, аминосилана, эпоксисилана или нитроцеллюлозы в случае кремниевых чипов/кремниевого стекла. Впоследствии связанный биологический агент также может быть зафиксирован, например, путем послойного осаждения чередующихся полимерных покрытий с разным зарядом. Альтернативно, трехмерные решетки (гидрогель/ксерогель) могут быть использованы для химического или физического захвата этих элементов (при этом под химическим захватом подразумевается удержание биологического элемента на месте прочной связью, а под физическим – удержание, не позволяющее ему проходить через поры гелевой матрицы). Наиболее часто используемым гидрогелем является золь-гель, стекловидный кремнезем, получаемый полимеризацией силикатных мономеров (добавляемых в виде тетраалкилсиликатов, таких как TMOS или TEOS) в присутствии биологических элементов (вместе с другими стабилизирующими полимерами, такими как ПЭГ) в случае физического захвата. Другая группа гидрогелей, которые формируются в условиях, подходящих для клеток или белков, – это акрилатные гидрогели, которые полимеризуются при радикальном инициировании. Один из типов радикальных инициаторов – пероксидный радикал, обычно образующийся при сочетании персульфата с TEMED (полиакриламидный гель также часто используется для электрофореза белков), в качестве альтернативы можно использовать свет в сочетании с фотоинициатором, таким как DMPA (2,2-диметокси-2-фенилацетофенон). Умные материалы, имитирующие биологические компоненты датчика, также могут быть классифицированы как биосенсоры, использующие только активный или каталитический центр, либо аналогичные конфигурации биомолекул.

Электрохимические

Электрохимические биосенсоры обычно основаны на ферментативном катализе реакции, производящей или потребляющей электроны (такие ферменты справедливо называются окислительно-восстановительными ферментами). Подложка датчика обычно содержит три электрода: эталонный, рабочий и встречный. Целевой аналит участвует в реакции, происходящей на поверхности активного электрода, и эта реакция может вызывать либо перенос электронов через двойной слой (создавая ток), либо влиять на потенциал двойного слоя (создавая напряжение). Мы можем измерять ток (скорость потока электронов пропорциональна концентрации аналита) при фиксированном потенциале или потенциал при нулевом токе (что дает логарифмический отклик). Следует отметить, что потенциал рабочего или активного электрода чувствителен к пространственному заряду, и это часто используется. Кроме того, возможно прямое электрическое детектирование малых пептидов и белков по их собственным зарядам с использованием биофункционализированных ионно-чувствительных полевых транзисторов. Другой пример – потенциометрический биосенсор (потенциал, создаваемый при нулевом токе), который дает логарифмический отклик с широким динамическим диапазоном. Такие биосенсоры часто изготавливаются методом трафаретной печати рисунка электродов на пластиковой подложке, покрытой проводящим полимером, к которой затем присоединяется белок (фермент или антитело). Они имеют только два электрода и отличаются высокой чувствительностью и надежностью. Они позволяют обнаруживать аналиты на уровнях, ранее достижимых только с помощью ВЭЖХ и ЖХ-МС, и без сложной подготовки образцов. Обычно все биосенсоры требуют минимальной подготовки образца, поскольку биологический сенсорный компонент обладает высокой селективностью к определяемому аналиту. Сигнал генерируется электрохимическими и физическими изменениями в проводящем полимерном слое, вызванными изменениями на поверхности датчика. Эти изменения могут быть связаны с ионной силой, pH, гидратацией и окислительно-восстановительными реакциями, последняя из которых обусловлена оборотом ферментной метки на субстрате. Полевые транзисторы, в которых область затвора модифицирована ферментом или антителом, также могут обнаруживать очень низкие концентрации различных аналитов, поскольку связывание аналита с областью затвора ПТ вызывает изменение тока сток-исток. Разработка биосенсоров на основе импедансной спектроскопии в последнее время набирает популярность, и многие такие устройства и разработки можно найти в академических кругах и промышленности. Одно из таких устройств, основанное на 4-электродной электрохимической ячейке с использованием нанопористой мембраны из оксида алюминия, показало возможность определения низких концентраций альфа-тромбина человека в присутствии высокого фона сывороточного альбумина. Также в импедансных биосенсорах используются интердигитированные электроды.

Флуоресцентный биосенсор без реагентов

Безреактивный биосенсор способен контролировать целевой аналит в сложной биологической смеси без использования дополнительных реагентов. Следовательно, он может функционировать непрерывно при иммобилизации на твердом носителе. Флуоресцентный биосенсор реагирует на взаимодействие с целевым аналитом изменением своих флуоресцентных свойств. Безреактивный флуоресцентный биосенсор (RF-биосенсор) можно получить, интегрировав биологический рецептор, направленный против целевого аналита, и сольватохромный флюорофор, чьи эмиссионные свойства чувствительны к природе его локального окружения, в единую макромолекулу. Флюорофор преобразует событие распознавания в измеримый оптический сигнал. Использование экзогенных флюорофоров, чьи эмиссионные свойства существенно отличаются от свойств эндогенных флюорофоров белков – триптофана и тирозина – позволяет непосредственно обнаруживать и количественно определять аналит в сложных биологических смесях. Интеграция флюорофора должна осуществляться в участке, чувствительном к связыванию аналита, без нарушения аффинности рецептора. Антитела и искусственные семейства антиген-связывающих белков (AgBP) хорошо подходят для обеспечения распознающего модуля RF-биосенсоров, поскольку они могут быть направлены против любого антигена (см. раздел о биорецепторах). Описан общий подход к интеграции сольватохромного флюорофора в AgBP при известной атомной структуре комплекса с его антигеном, что позволяет преобразовать его в RF-биосенсор. Однако, при отсутствии специфических структурных данных, необходимо применять другие стратегии. Антитела и искусственные семейства AgBP состоят из набора гипервариабельных (или рандомизированных) позиций аминокислотных остатков, расположенных в уникальном субдомене белка и поддерживаемых константным полипептидным каркасом. Остатки, формирующие сайт связывания с данным антигеном, отбираются из числа гипервариабельных остатков. Любой AgBP из этих семейств можно преобразовать в RF-биосенсор, специфичный к целевому антигену, просто ковалентно связав сольватохромный флюорофор с одним из гипервариабельных остатков, не оказывающих существенного влияния на взаимодействие с антигеном, после предварительного превращения этого остатка в цистеин посредством мутагенеза. В частности, стратегия заключается в индивидуальном замещении остатков в гипервариабельных позициях на цистеин на генетическом уровне, химическом конъюгировании сольватохромного флюорофора с мутантным цистеином и последующем отборе полученных конъюгатов с наивысшей чувствительностью (параметр, учитывающий как аффинность, так и изменение флуоресцентного сигнала). Последующие исследования показали, что наилучшие безреактивные флуоресцентные биосенсоры получаются, когда флюорофор не образует нековалентных взаимодействий с поверхностью биорецептора, что приводит к увеличению фонового сигнала, и когда он взаимодействует с карманом связывания на поверхности целевого антигена. RF-биосенсоры, полученные описанными методами, способны функционировать и обнаруживать целевые аналиты внутри живых клеток.

Магнитные биосенсоры

Магнитные биосенсоры используют парамагнитные или сверхпарамагнитные частицы или кристаллы для обнаружения биологических взаимодействий. Примерами могут служить индуктивность катушки, сопротивление или другие магнитные свойства. Обычно используются магнитные нано- или микрочастицы. На поверхности этих частиц располагаются биорецепторы, такие как ДНК (комплементарная последовательности или аптамеры), антитела или другие молекулы. Связывание биорецептора изменяет некоторые магнитные свойства частицы, которые можно измерить с помощью АС-сусцептометрии, датчика эффекта Холла, устройства гигантского магнитосопротивления или других методов.

Другие

Пьезоэлектрические датчики используют кристаллы, которые претерпевают упругую деформацию при приложении к ним электрического потенциала. Переменный потенциал (А.С.) создает стоячую волну в кристалле на характерной частоте. Эта частота сильно зависит от упругих свойств кристалла, поэтому, если кристалл покрыт элементом биологического распознавания, связывание (крупной) целевой молекулы-аналита с рецептором приведет к изменению резонансной частоты, что и является сигналом связывания. В режиме, использующем поверхностные акустические волны (SAW), чувствительность значительно повышается. Это специализированное применение кварцевого микровеса в качестве биосенсора.

Электрохемилюминесценция (ЭХЛ) в настоящее время является передовой техникой в области биосенсоров. Поскольку возбужденные частицы генерируются электрохимическим стимулом, а не источником светового возбуждения, ЭХЛ демонстрирует улучшенное отношение сигнал/шум по сравнению с фотолюминесценцией, с минимальными эффектами рассеяния света и фоновой люминесценции. В частности, ЭХЛ с кореагентами, работающая в буферном водном растворе в области положительных потенциалов (окислительно-восстановительный механизм), значительно усилила возможности ЭХЛ для иммуноанализа, что подтверждается многочисленными исследовательскими приложениями и, что более важно, наличием крупных компаний, разработавших коммерческое оборудование для высокопроизводительного иммуноанализа на рынке, объем которого составляет миллиарды долларов в год. Термометрические биосенсоры встречаются редко.

Биосенсорный MOSFET (BioFET)

MOSFET (транзистор полевого эффекта металл-оксид-полупроводник, или транзистор MOS) был изобретен Мохамедом М. Аталлой и Давоном Кангом в 1959 году и продемонстрирован в 1960 году. Два года спустя, в 1962 году, Лиланд Кларк и Чамп Лайонс изобрели первый биосенсор. Позже были разработаны биосенсорные MOSFET (BioFET), которые с тех пор широко используются для измерения физических, химических, биологических и экологических параметров. Первым BioFET был ионно-чувствительный транзистор полевого эффекта (ISFET), изобретенный Питом Бергвельдом для электрохимических и биологических применений в 1970 году. Адсорбционный FET (ADFET) был запатентован П. Ф. Коксом в 1974 году, а водородно-чувствительный MOSFET был продемонстрирован И. Лундстромом, М. С. Шивараманом, С. Свенсоном и Л. Лундквистом в 1975 году. ISFET широко используется в биомедицинских приложениях, таких как обнаружение гибридизации ДНК, обнаружение биомаркеров в крови, обнаружение антител, измерение глюкозы, определение pH и генетические технологии. Примером последнего является мониторинг лактозы на молочном заводе. Биосенсоры, работающие вне поля (off-line), в отличие от биоаналитических методов, применяются не в полевых условиях, а в лаборатории. Эти методы в основном используются в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и биомедицине. В медицинских приложениях биосенсоры обычно классифицируются как системы in vitro и in vivo. Измерение in vitro с помощью биосенсора проводится в пробирке, чашке Петри, микротитрационной пластине или в другом месте вне живого организма. Датчик использует биорецептор и преобразователь, как описано выше. Примером биосенсора in vitro является ферментный кондуктометрический биосенсор для мониторинга глюкозы в крови. Существует задача создания биосенсора, работающего по принципу тестирования у постели больного (point of care testing), то есть в месте, где тест необходим. Разработка носимых биосенсоров является одним из направлений таких исследований. Отказ от лабораторных исследований может сэкономить время и деньги. Применение биосенсора POCT может заключаться в тестировании на ВИЧ в районах, где пациентам трудно получить доступ к тестированию. Биосенсор может быть отправлен непосредственно на место, и можно использовать быстрый и простой тест. Биосенсор in vivo – это имплантируемое устройство, работающее внутри тела. Разумеется, имплантаты с биосенсорами должны соответствовать строгим требованиям к стерилизации, чтобы избежать первоначальной воспалительной реакции после имплантации. Вторая проблема связана с долгосрочной биосовместимостью, то есть безвредным взаимодействием с окружающей средой организма в течение предполагаемого срока службы. Еще одна проблема – это выход из строя. В случае отказа устройство необходимо удалить и заменить, что потребует дополнительной операции. Примером применения биосенсора in vivo является мониторинг инсулина в организме, который пока недоступен. Наиболее продвинутые имплантаты биосенсоров разработаны для непрерывного мониторинга глюкозы. На рисунке показано устройство, для которого используется Ti-корпус и батарея, как это принято для сердечно-сосудистых имплантатов, таких как кардиостимуляторы и дефибрилляторы.

Мониторинг глюкозы

Коммерчески доступные глюкометры используют амперометрическое определение глюкозы с помощью глюкозооксидазы, которая окисляет глюкозу, образуя перекись водорода, которую обнаруживает электрод. Чтобы преодолеть ограничения амперометрических сенсоров, в настоящее время активно ведутся исследования новых методов определения, таких как флуоресцентные биосенсоры глюкозы.

Интерферометрический датчик отражения

Интерферометрический датчик отражательной визуализации (IRIS) основан на принципах оптической интерференции и состоит из подложки кремний-диоксида кремния, стандартной оптики и когерентных светодиодов малой мощности. Когда свет направляется через объектив с небольшим увеличением на слоистую подложку кремний-диоксида кремния, генерируется интерференционная картина. По мере накопления биомассы, имеющей показатель преломления, близкий к показателю преломления диоксида кремния, на поверхности подложки происходит изменение интерференционной картины, которое можно соотнести с количественной массой. Daaboul и др. использовали IRIS для достижения чувствительности без меток около 19 нг/мл. Ahn и др. повысили чувствительность IRIS с помощью метода массовой метки. С момента первой публикации IRIS был адаптирован для выполнения различных функций. Во-первых, в IRIS была интегрирована возможность флуоресцентной визуализации в интерферометрический инструмент визуализации как потенциальный способ устранения вариабельности микромассивов флуоресцентных белков. Вкратце, вариации в флуоресцентных микромассивах в основном обусловлены непостоянной иммобилизацией белка на поверхностях и могут приводить к неверным диагнозам в аллергических микромассивах. Для коррекции любых изменений в иммобилизации белка данные, полученные в флуоресцентном режиме, нормализуются по данным, полученным в режиме без меток. Этот режим позволяет проводить различие по размеру в сложных биологических образцах человека. Monroe и др. использовали IRIS для количественного определения уровня белка, добавленного в цельную человеческую кровь и сыворотку, и определили аллергическую сенсибилизацию в охарактеризованных образцах человеческой крови без какой-либо подготовки образцов. Другие практические применения этого устройства включают обнаружение вирусов и патогенов.

Анализ пищевых продуктов

Существует несколько областей применения биосенсоров в анализе пищевых продуктов. В пищевой промышленности широко используются оптические системы, покрытые антителами, для обнаружения патогенов и пищевых токсинов. Чаще всего в этих биосенсорах используется флуоресцентная система, поскольку этот тип оптического измерения позволяет значительно усилить сигнал. Для использования в сенсорных системах на основе SPR, часто адаптированных из существующих ELISA или других иммунологических анализов, разработан ряд иммуно- и лиганд-связывающих анализов для обнаружения и измерения малых молекул, таких как водорастворимые витамины и химические загрязнители (остатки лекарственных препаратов), например сульфаниламиды и бета-агонисты. Они получили широкое распространение в пищевой промышленности.

Обнаружение/мониторинг загрязняющих веществ

Биосенсоры могут использоваться для мониторинга загрязнителей воздуха, воды и почвы, таких как пестициды, потенциально канцерогенные, мутагенные и/или токсичные вещества, а также химические вещества, нарушающие эндокринную систему.

Измерение озона

Поскольку озоновый слой фильтрует вредное ультрафиолетовое излучение, открытие озоновых дыр в атмосфере Земли вызвало опасения относительно количества ультрафиолетового света, достигающего поверхности Земли. Особую тревогу вызывают вопросы о том, насколько глубоко ультрафиолетовое излучение проникает в морскую воду и как оно воздействует на морские организмы, особенно на планктон (микроскопические организмы, свободно плавающие в воде) и вирусы, поражающие планктон. Планктон составляет основу морских пищевых цепей и, как считается, влияет на температуру и погоду нашей планеты, поглощая углекислый газ в процессе фотосинтеза. Денеб Каренц, исследователь из Лаборатории радиобиологии и экологического здоровья (Калифорнийский университет, Сан-Франциско), разработала простой метод измерения проникновения и интенсивности ультрафиолетового излучения. Работая в Антарктическом океане, она опускала на разные глубины тонкие пластиковые пакеты, содержащие специальные штаммы кишечной палочки, практически не способные восстанавливать повреждения ДНК, вызванные ультрафиолетовым излучением. Скорость гибели бактерий в этих пакетах сравнивалась с показателями в контрольных пакетах, не подвергавшихся воздействию. Эти бактериальные "биосенсоры" показали постоянное значительное ультрафиолетовое повреждение на глубине 10 метров и часто на 20 и 30 метров. Каренц планирует дальнейшие исследования влияния ультрафиолетового излучения на сезонные вспышки роста планктона в океанах.

Обнаружение метастатических раковых клеток

Метастазирование – это распространение рака из одной части тела в другую через кровеносную или лимфатическую систему. В отличие от радиологических методов визуализации (маммографии), которые направляют различные виды энергии (рентгеновские лучи, магнитные поля и т.д.) внутрь тела для получения изображений, биосенсоры обладают потенциалом для непосредственного определения злокачественной активности опухоли. Сочетание биологического и детектирующего элементов обеспечивает малый объем необходимого образца, компактную конструкцию, быструю генерацию и обработку сигналов, высокую селективность и чувствительность к определяемому аналиту. По сравнению с традиционными радиологическими исследованиями, биосенсоры имеют преимущество не только в определении степени распространения рака и оценке эффективности лечения, но и являются более доступными, эффективными (по времени, стоимости и производительности) способами оценки метастатической активности на ранних стадиях рака. Исследователи в области биологической инженерии разработали онкологические биосенсоры для рака молочной железы. Рак молочной железы является наиболее распространенным видом рака среди женщин во всем мире. Примером может служить кварцевый микровесовой резонатор с трансферрином (QCM). Как биосенсор, кварцевые микровесовые резонаторы генерируют колебания частоты стоячей волны кристалла под воздействием переменного потенциала, что позволяет обнаруживать изменения массы в диапазоне нанограмм. Эти биосенсоры специально разработаны для взаимодействия и обладают высокой селективностью к рецепторам на поверхности клеток (раковых и нормальных). В идеале это обеспечивает количественное определение количества клеток с данным рецептором на единицу площади поверхности, в отличие от качественной визуализации, предоставляемой маммографией. Седа Атай, исследователь в области биотехнологий в Университете Хаджеттепе, экспериментально подтвердила эту специфичность и селективность QCM по отношению к клеткам MDA MB 231 молочной железы, клеткам MCF 7 и клеткам MDA MB 231, лишенным питательных веществ, в условиях in vitro.

Обнаружение патогенов

Биосенсоры могут использоваться для обнаружения патогенных организмов. Разработаны носимые встроенные биосенсоры для выявления патогенных сигнатур, таких как SARS-CoV-2, например, маски для лица со встроенными тестами. См. также: НИОКР в области общественного транспорта в связи с COVID-19.

Новые типы чипов биосенсоров могут позволить разработать новые методы, "например, датчики патогенов, развертываемые с помощью дронов для активного мониторинга воздуха или сточных вод". Аптамеры, связывающие белки, могут использоваться для тестирования на патогены инфекционных заболеваний. Системы электронных шкур (или шкур роботов) со встроенными биосенсорами (или химическими датчиками) и интерфейсами "человек-машина" могут обеспечить носимые, а также дистанционные или роботизированные системы обнаружения патогенов (наряду с несколькими опасными материалами и тактильными ощущениями).

Оптические биосенсоры

Многие оптические биосенсоры основаны на феномене поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Это использует свойство золота и других материалов (металлов); в частности, то, что тонкий слой золота на стеклянной поверхности с высоким показателем преломления способен поглощать лазерный свет, создавая электронные волны (поверхностные плазмоны) на поверхности золота. Это происходит только при определенном угле падения и длине волны света и сильно зависит от состояния поверхности золота, так что связывание целевого аналита с рецептором на поверхности золота приводит к появлению измеримого сигнала. Датчики поверхностного плазмонного резонанса работают с использованием сенсорной микросхемы, состоящей из пластиковой кассеты, поддерживающей стеклянную пластину, одна сторона которой покрыта микроскопическим слоем золота. Эта сторона контактирует с оптическим детектором прибора. Противоположная сторона затем контактирует с микрофлюидной системой. Контакт с системой потока создает каналы, по которым реагенты могут проходить в растворе. Эту сторону стеклянной сенсорной микросхемы можно модифицировать различными способами для облегчения присоединения интересующих молекул. Обычно она покрыта карбоксиметилдекстраном или аналогичным соединением. Показатель преломления на стороне потока поверхности микросхемы напрямую влияет на поведение света, отраженного от золотой стороны. Связывание с поточной стороной микросхемы влияет на показатель преломления, и таким образом биологические взаимодействия могут быть измерены с высокой чувствительностью, регистрируя изменение энергии. Показатель преломления среды вблизи поверхности изменяется при прикреплении к ней биомолекул, а угол SPR меняется в зависимости от этого изменения. Свет с фиксированной длиной волны отражается от золотой стороны микросхемы под углом полного внутреннего отражения и детектируется внутри прибора. Угол падения света изменяется для согласования скорости распространения эванесцентной волны со скоростью распространения поверхностных плазмонных поляритонов. Это заставляет эванесцентную волну проникать через стеклянную пластину и на некоторое расстояние в жидкость, протекающую по поверхности. Другие оптические биосенсоры в основном основаны на изменениях поглощения или флуоресценции соответствующего индикаторного соединения и не требуют геометрии полного внутреннего отражения. Например, был создан полностью рабочий прототип устройства для обнаружения казеина в молоке. Устройство основано на регистрации изменений в поглощении золота. Широко используемый исследовательский инструмент, микрочип (микромассив), также можно рассматривать как биосенсор.

Биологические биосенсоры

Биологические биосенсоры, также известные как оптогенетические датчики, часто включают в себя генетически модифицированную форму природного белка или фермента. Белок сконфигурирован для обнаружения определенного аналита, а последующий сигнал считывается с помощью детектора, такого как флюорометр или люминометр. Примером недавно разработанного биосенсора является датчик для определения цитозольной концентрации аналита cAMP (циклический аденозинмонофосфат), вторичного мессенджера, участвующего в клеточной сигнализации, инициированной лигандами, взаимодействующими с рецепторами на клеточной мембране. Аналогичные системы были созданы для изучения клеточных ответов на нативные лиганды или ксенобиотики (токсины или ингибиторы малых молекул). Такие "анализы" широко используются в разработке лекарственных препаратов фармацевтическими и биотехнологическими компаниями. Большинство используемых в настоящее время анализов cAMP требуют лизиса клеток перед измерением уровня cAMP. Биосенсор для cAMP может быть использован в нелизированных клетках, что дает дополнительное преимущество в виде возможности многократных измерений для изучения кинетики ответа рецептора. Нанобиоссенсоры используют иммобилизованный биорецепторный зонд, селективный к целевым аналитическим молекулам. Наноматериалы являются исключительно чувствительными химическими и биологическими датчиками. Наномасштабные материалы демонстрируют уникальные свойства. Их большая площадь поверхности к объему позволяет проводить быстрые и экономичные реакции, используя различные конструкции. Другие биосенсоры на основе затухающих волн были коммерциализированы с использованием волноводов, где постоянная распространения в волноводе изменяется при поглощении молекул поверхностью волновода. Одним из таких примеров является интерферометрия двойной поляризации, использующая встроенный волновод в качестве опорного для измерения изменения постоянной распространения. Другие конфигурации, такие как Mach–Zehnder, имеют опорные плечи, сформированные литографически на подложке. Более высокая степень интеграции может быть достигнута с использованием резонаторных геометрий, где резонансная частота кольцевого резонатора изменяется при поглощении молекул.

Электронные носовые устройства

Недавно массивы различных молекул-детекторов стали применяться в так называемых электронных носовых устройствах, где схема отклика детекторов используется для идентификации вещества. В обонятельном детекторе Wasp Hound механическим элементом является видеокамера, а биологическим – пять паразитических ос, обученных собираться в рой при обнаружении определенного химического вещества. Однако современные коммерческие электронные носы не используют биологические элементы.

ДНК-биосенсоры

ДНК может выступать в качестве аналита биосенсора, определяемого специфическими методами, но также может использоваться как компонент биосенсора или, теоретически, даже как полноценный биосенсор. Существует множество методов обнаружения ДНК, которые обычно используются для выявления организмов, содержащих данную ДНК. Последовательности ДНК также могут быть применены, как описано выше. Однако существуют и более перспективные подходы, при которых ДНК может быть синтезирована для удержания ферментов в биологически стабильном геле. Другая область применения – разработка аптамеров, последовательностей ДНК, обладающих определенной формой для связывания с целевой молекулой. Наиболее инновационные методы используют ДНК-оригами для создания последовательностей, которые сворачиваются в предсказуемую структуру, полезную для детекции. Ученые создали прототипы сенсоров для обнаружения ДНК животных из воздуха, так называемой "воздушной внеклеточной ДНК". "Наноантенны", изготовленные из ДНК – новый тип оптических антенн на наноуровне, – могут быть присоединены к белкам и генерировать сигнал посредством флуоресценции при выполнении ими биологических функций, особенно при различных конформационных изменениях.

Биосенсор на основе графена

Графен – это двумерное углеродное вещество с превосходными оптическими, электрическими, механическими, тепловыми свойствами. Способность абсорбировать и иммобилизовать различные белки, особенно те, что содержат углеродные кольцевые структуры, делает графен отличным кандидатом на роль биосенсорного преобразователя. В результате, в последнее время активно исследуются и разрабатываются различные биосенсоры на основе графена. Графен применяется в качестве биосенсора в различных форматах, в частности, в электрохимических сенсорах и транзисторах с полевым эффектом. Среди них особый интерес представляют графиновые транзисторы с полевым эффектом (GFET), которые демонстрируют высокую эффективность в качестве быстрых диагностических средств для использования непосредственно у постели больного (PoC), о чем свидетельствует рост числа публикаций, посвященных диагностике COVID-19 с использованием GFET. Сообщается, что они обладают одним из самых низких пределов обнаружения, обеспечивают быстрое получение результатов – всего за несколько секунд – и поддерживают мультиплексный анализ. Эти возможности позволяют оперативно выявлять заболевания, особенно в случаях с перекрывающимися симптомами, которые сложно дифференцировать на ранних стадиях, что способствует улучшению результатов лечения пациентов, особенно в условиях ограниченных ресурсов.