Введение

Антимикробный фермент, продуцируемый животными

Лизозим (мурамидаза, N-ацетилмурамидгликогидролаза; систематическое название – пептидогликан N-ацетилмурамоилгидролаза) – это антимикробный фермент, продуцируемый животными и являющийся частью врожденной иммунной системы. Это гликозидгидролаза, катализирующая следующий процесс:

Гидролиз (1→4)-β-связей между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетил-D-глюкозаминовыми остатками в пептидогликане и между N-ацетил-D-глюкозаминовыми остатками в хитодекстринах.

Пептидогликан является основным компонентом клеточной стенки грамположительных бактерий. Этот гидролиз, в свою очередь, нарушает целостность бактериальных клеточных стенок, вызывая лизис бактерий. Лизозим в изобилии содержится в секретах, включая слезы, слюну, грудное молоко и слизь. Он также присутствует в цитоплазматических гранулах макрофагов и полиморфноядерных нейтрофилов (ПМН). Большое количество лизозима содержится в яичном белке. Лизозимы типа C тесно связаны с α-лактальбумином по последовательности и структуре, что делает их частью одной и той же семьи гликозидгидролаз 22. У человека фермент лизозим типа C кодируется геном LYZ. Лизозим куриного яичного белка термостабилен, температура плавления достигает 72 °C при pH 5,0. Однако лизозим в человеческом молоке очень быстро теряет активность при этой температуре. Лизозим куриного яичного белка сохраняет свою активность в широком диапазоне pH (6–9). Его изоэлектрическая точка составляет 11,35. Изоэлектрическая точка лизозима человеческого молока составляет 10,5–11.

Функция и механизм

Фермент функционирует путем гидролиза гликозидных связей в пептидогликанах. Этот фермент также способен расщеплять гликозидные связи в хитине, хотя и менее эффективно, чем настоящие хитиназы. Активный центр лизоцима связывает молекулу пептидогликана в выраженной щели между двумя его доменами. Он атакует пептидогликаны (содержащиеся в клеточных стенках бактерий, особенно грамположительных бактерий) – свой естественный субстрат – между N-ацетилмурамовой кислотой (NAM) и четвертым атомом углерода N-ацетилглюкозамина (NAG). Более короткие сахара, такие как тетрасахарид, также могут служить субстратами, но через промежуточное соединение с более длинной цепью. Также было показано, что хитин является подходящим субстратом для лизоцима. В исследованиях лизоцима также используются и разработаны искусственные субстраты.

Филипс

Механизм Филипса предполагал, что каталитическая сила фермента обусловлена как стерическим напряжением в связанной подложке, так и электростатической стабилизацией оксокарбениевого иона. На основании данных рентгеноструктурного анализа Филлипс предложил структуру активного центра фермента, в котором связывается гексасахарид. Лизозим искажает четвертый сахар (в D- или 1-подсайте) в гексасахариде, переводя его в конформацию полукресла. В этом напряженном состоянии гликозидная связь легче разрывается. В результате разрыва гликозидной связи образуется ионный интермедиат, содержащий оксокарбениевый ион. Таким образом, искажение, заставляющее молекулу субстрата принимать напряженную конформацию, подобную конформации переходного состояния, снижает энергетический барьер реакции. Арие Варшель в 1978 году предположил, что предлагаемый оксокарбениевый интермедиат электростатически стабилизируется остатками аспартата и глутамата в активном центре. Аргумент об электростатической стабилизации основывался на сравнении с объемной водой, где переориентация диполей воды может нивелировать стабилизирующую энергию взаимодействия зарядов. В модели Варшеля фермент действует как «суперрастворитель», который фиксирует ориентацию ионных пар и обеспечивает «суперсольватацию» (очень хорошую стабилизацию ионных пар), особенно снижая энергию, когда два иона находятся близко друг к другу. Шаг, определяющий скорость (RDS) в этом механизме, связан с образованием оксокарбениевого иона. Существовали противоречивые результаты относительно точного определения RDS. Отслеживая образование продукта (p-нитрофенола), было обнаружено, что RDS может меняться в зависимости от температуры, что и объясняет эти противоречивые результаты. При более высокой температуре RDS – это образование гликозилэнергетического интермедиата, а при более низкой температуре – распад этого интермедиата.

Ковалентный механизм

В начале дискуссии в 1969 году Дальквист предложил ковалентный механизм для лизоцима, основанный на кинетическом изотопном эффекте. Было установлено, что аминокислотные боковые цепи глутаминовая кислота 35 (Glu35) и аспартат 52 (Asp52) критически важны для активности этого фермента. Glu35 выступает в роли донора протона для гликозидной связи, разрывая связь C-O в субстрате, в то время как Asp52 действует как нуклеофил, образуя промежуточное соединение гликозил-фермент. Glu35 реагирует с водой, образуя гидроксид-ион, который является более сильным нуклеофилом, чем вода, и затем атакует промежуточное соединение гликозил-фермент, образуя продукт гидролиза, при этом фермент остается неизменным. Этот тип ковалентного механизма для ферментативного катализа был впервые предложен Кошландом. В последнее время, молекулярно-динамическое моделирование на основе квантовой механики/молекулярной механики (QM/MM) использовало кристаллы HEWL и предсказало существование ковалентного промежуточного соединения. Данные, полученные с помощью ESI MS и рентгеноструктурного анализа, указывают на существование ковалентного промежуточного соединения, но в основном основаны на использовании менее активного мутанта или неестественного субстрата. Таким образом, молекулярно-динамическое моделирование QM/MM предоставляет уникальную возможность непосредственного изучения механизма действия HEWL в диком типе и с использованием естественного субстрата. Расчеты показали, что ковалентное промежуточное соединение ковалентного механизма примерно на 30 ккал/моль стабильнее ионного промежуточного соединения механизма Филлипса. У грамотрицательных бактерий липополисахарид действует как неконкурентный ингибитор, благодаря высокоэффективному связыванию с лизоцимом.

Неферментативное действие

Несмотря на то, что мурамидазная активность лизоцима считалась ключевой для его антибактериальных свойств, также сообщалось о его неферментативном действии. Например, блокирование каталитической активности лизоцима путем мутации критической аминокислоты в активном центре (52 Asp > 52 Ser) не отменяет его антимикробную активность. Лектиноподобная способность лизоцима распознавать бактериальные углеводные антигены без литической активности была описана для тетрасахарида, связанного с липополисахаридом Klebsiella pneumoniae. Кроме того, лизоцим взаимодействует с антителами и Т-клеточными рецепторами.

Изменения конформации ферментов

Лизозим существует в двух конформациях: открытом активном состоянии и закрытом неактивном состоянии. Каталитическая активность была изучена с использованием полевых транзисторов на основе одностенных углеродных нанотрубок (SWCN FET), к которым был присоединен отдельный фермент лизоцим. Электронный мониторинг лизоцима выявил две конформации – открытый активный центр и закрытый неактивный центр. В активном состоянии лизоцим способен процессивно гидролизовать свой субстрат, разрывая в среднем 100 связей со скоростью 15 в секунду. Для связывания нового субстрата и перехода из закрытого неактивного состояния в открытое активное требуется два изменения конформации, тогда как для инактивации достаточно одного изменения.

Сверхсемейство

Обычный лизозим типа С входит в состав более крупной группы структурно и механически связанных ферментов, называемой суперсемейством лизозимов. Эта группа объединяет лизозимы типа C GH22 («куриный»), хитиназы растений GH19, лизозим G-типа («гусиный») GH23, лизозим V-типа («вирусный») GH24 и семейства хитосаназ GH46. Номенклатура типов лизозимов отражает лишь источник, из которого тип был первоначально выделен, и не полностью соответствует таксономическому распространению. Например, у человека и многих других млекопитающих есть два гена лизозима G-типа: LYG1 и LYG2.

Роль в болезни и терапии

Лизозим является частью врожденной иммунной системы. Снижение уровня лизозима связано с бронхолегочной дисплазией у новорожденных. Поросята, получающие молоко, обогащенное человеческим лизозимом, быстрее восстанавливаются от диареи, вызванной E. coli. Концентрация лизозима в человеческом молоке в 1600–3000 раз выше, чем в молоке сельскохозяйственных животных. Человеческий лизозим более активен, чем лизозим куриного яичного белка. Была разработана трансгенная линия коз (с родоначальницей по имени "Артемида") для производства молока с человеческим лизозимом, чтобы защитить детей от диареи в случаях, когда они не могут получить преимущества грудного вскармливания. Поскольку лизозим является естественной защитой от грамположительных патогенов, таких как Bacillus и Streptococcus, он играет важную роль в иммунологии младенцев при кормлении грудным молоком. В то время как кожа является защитным барьером благодаря своей сухости и кислотности, конъюнктива (мембрана, покрывающая глаз) защищена секретируемыми ферментами, главным образом лизозимом и дефенсином. Однако, при нарушении этих защитных барьеров развивается конъюнктивит. При некоторых видах рака (особенно при миеломоноцитарной лейкемии) избыточное производство лизозима раковыми клетками может привести к токсическому уровню лизозима в крови. Высокий уровень лизозима в крови может вызвать почечную недостаточность и гипокалиемию, состояния, которые могут улучшиться или разрешиться при лечении основного злокачественного новообразования. Лизозим сыворотки гораздо менее специфичен для диагностики саркоидоза, чем сывороточный ангиотензинпревращающий фермент; однако, благодаря большей чувствительности, он используется в качестве маркера активности саркоидоза и подходит для мониторинга заболевания в подтвержденных случаях.

Химический синтез

Первая химическая попытка синтеза белка лизоцима была предпринята профессором Джорджем Кеннером и его группой в Ливерпульском университете в Англии. Это было окончательно осуществлено в 2007 году Томасом Дюреком в лаборатории Стива Кента при Чикагском университете, который создал синтетическую функциональную молекулу лизоцима.

Другие применения

Лизозимные кристаллы использовались для выращивания других функциональных материалов для катализа и биомедицинских применений. Лизозим – это широко используемый фермент для лизиса грамположительных бактерий. Благодаря уникальной функции лизозима, заключающейся в его способности разрушать клеточную стенку и вызывать осмотический шок (разрыв клетки из-за резкого изменения концентрации растворенных веществ вокруг клетки и, следовательно, осмотического давления), лизозим обычно применяется в лабораторных условиях для высвобождения белков из периплазмы бактерий, при этом внутренняя мембрана остается неповрежденной в виде везикул, называемых сферопластами. Например, E. coli можно лизировать с помощью лизозима для высвобождения содержимого периплазматического пространства. Это особенно полезно в лаборатории для попыток получения содержимого периплазмы. Следствием использования лизозима при выделении рекомбинантных белков для кристаллизации является возможность загрязнения кристаллов единицами лизозима, что приводит к физиологически нерелевантной комбинации. Некоторые белки просто не кристаллизуются без такого загрязнения. Более того, лизозим может служить инструментом при экспрессии токсичных рекомбинантных белков. Экспрессия рекомбинантных белков в штаммах BL21(DE3) обычно осуществляется с помощью РНК-полимеразы T7. Индукция IPTG приводит к ингибированию UV5 репрессора, что запускает транскрипцию РНК-полимеразы T7 и, следовательно, целевого белка. Однако, даже без индукции наблюдается базовый уровень РНК-полимеразы T7. T7 лизозим действует как ингибитор РНК-полимеразы T7. Новые штаммы, содержащие вспомогательный плазмид (pLysS), конститутивно коэкспрессируют низкие уровни T7 лизозима, обеспечивая высокую специфичность и стабильную экспрессию токсичного рекомбинантного белка.

История

Антибактериальные свойства куриного яичного белка, обусловленные содержащимся в нем лизозимом, впервые были отмечены Лащенко в 1909 году. Бактерицидная активность носовой слизи была продемонстрирована в 1922 году Александром Флемингом, открывшим пенициллин, который и ввел термин "лизозим". Он сообщил: "Поскольку данное вещество обладает свойствами, схожими с ферментами, я назвал его 'лизозимом'". Флеминг далее показал, что ферментативное вещество присутствует в широком спектре секретов и способно быстро лизировать (то есть разрушать) различные бактерии, в частности, желтый "кокк", который он изучал. Лизозим был впервые кристаллизован Эдвардом Абрахамом в 1937 году, что позволило Дэвиду Чилтону Филлипсу в 1965 году описать трехмерную структуру лизозима куриного яичного белка, получив первую модель с разрешением 2 ангстрема (200 пм) методом рентгеновской кристаллографии. Структура была представлена публично на лекции в Королевском институте в 1965 году. Лизозим стал второй структурой белка и первой структурой фермента, определенной методами рентгеновской дифракции, а также первым ферментом, полный аминокислотный состав которого был установлен и включал все двадцать распространенных аминокислот. Благодаря определению Филлипсом структуры лизозима, он также стал первым ферментом, для которого был предложен детальный и специфический механизм каталитического действия. Эта работа позволила Филлипсу объяснить, как ферменты ускоряют химические реакции, исходя из их физической структуры. Первоначальный механизм, предложенный Филлипсом, был впоследствии пересмотрен.