Киназы: ферменты фосфорилирования и их роль в клеточных процессах.

Введение

Фермент, катализирующий перенос фосфатных групп на специфические субстраты – киназы, которые фосфорилируют белки.

В биохимии, киназа (/k aɪ n eɪ s/, /kɪ n eɪ s/, /eɪ z/) – это фермент, катализирующий перенос фосфатных групп от высокоэнергетических донорных молекул фосфата к специфическим субстратам. Этот процесс известен как фосфорилирование, при котором высокоэнергетическая молекула АТФ передает фосфатную группу молекуле субстрата. В результате киназа производит фосфорилированный субстрат и АДФ. Обратный процесс, дефосфорилирование, происходит, когда фосфорилированный субстрат отдает фосфатную группу, а АДФ присоединяет ее (образуя дефосфорилированный субстрат и высокоэнергетическую молекулу АТФ). Эти два процесса – фосфорилирование и дефосфорилирование – происходят четыре раза во время гликолиза. Киназы входят в состав более широкого семейства фосфотрансфераз. Киназы не следует путать с фосфорилазами, которые катализируют присоединение неорганических фосфатных групп к акцептору, и с фосфатазами, которые удаляют фосфатные группы (дефосфорилирование). Фосфорилированное состояние молекулы, будь то белок, липид или углевод, может влиять на ее активность, реакционную способность и способность связываться с другими молекулами. Поэтому киназы играют критическую роль в метаболизме, клеточной сигнализации, регуляции белков, клеточном транспорте, секреторных процессах и многих других клеточных путях, что делает их чрезвычайно важными для физиологии.

Биохимия и функциональная значимость

Киназы опосредуют перенос фосфатной группы от высокоэнергетической молекулы (такой как АТФ) к молекуле своего субстрата, как показано на рисунке ниже. Киназы необходимы для стабилизации этой реакции, поскольку фосфоангидридная связь содержит высокий уровень энергии. Киназы правильно ориентируют свой субстрат и фосфорильную группу в своих активных центрах, что увеличивает скорость реакции. Кроме того, они обычно используют положительно заряженные аминокислотные остатки, которые электростатически стабилизируют переходное состояние, взаимодействуя с отрицательно заряженными фосфатными группами. Альтернативно, некоторые киназы используют связанные металлические кофакторы в своих активных центрах для координации фосфатных групп. Протеинкиназы можно классифицировать как каталитически активные (канонические) или как псевдокиназы, что отражает эволюционную потерю одной или нескольких каталитических аминокислот, позиционирующих или гидролизующих АТФ. Однако, с точки зрения сигнальных выходов и значимости для заболеваний, как киназы, так и псевдокиназы являются важными модуляторами сигнализации в клетках человека, что делает киназы важными мишенями для лекарственных препаратов. Киназы широко используются для передачи сигналов и регуляции сложных процессов в клетках. Фосфорилирование молекул может усиливать или ингибировать их активность и модулировать их способность взаимодействовать с другими молекулами. Добавление и удаление фосфатных групп предоставляет клетке средства контроля, поскольку различные киназы могут реагировать на различные условия или сигналы. Мутации в киназах, приводящие к потере или приобретению функции, могут вызывать рак и заболевания у людей, включая некоторые типы лейкемии и нейробластомы, глиобластому, спиноцеребеллярную атаксию (тип 14), формы агаммаглобулинемии и многие другие.

История и классификация

Первый белок, который был признан катализатором фосфорилирования другого белка с использованием АТФ, был обнаружен в 1954 году Юджином П. Кеннеди, который в то время описал фермент печени, катализирующий фосфорилирование казеина. В 1956 году Эдмонд Х. Фишер и Эдвин Г. Кребс обнаружили, что взаимопревращение между фосфорилизой a и фосфорилизой b опосредовано фосфорилированием и дефосфорилированием. Киназа, которая переносит фосфорильную группу на фосфорилазу b, превращая ее в фосфорилазу a, была названа фосфорилазкиназой. Спустя годы был идентифицирован первый пример каскада киназ, в котором протеинкиназа А (PKA) фосфорилирует фосфорилазкиназу. Одновременно было обнаружено, что PKA ингибирует гликогенсинтазу, что стало первым примером события фосфорилирования, приводящего к ингибированию. В 1969 году Лестер Рид обнаружил, что пируватдегидрогеназа инактивируется фосфорилированием, и это открытие стало первым намеком на то, что фосфорилирование может служить средством регуляции в других метаболических путях, помимо метаболизма гликогена. В том же году Том Ланган обнаружил, что PKA фосфорилирует гистон H1, что позволило предположить, что фосфорилирование может регулировать неферментные белки. 1970-е годы ознаменовались открытием кальмодулин-зависимых протеинкиназ и установлением того, что белки могут быть фосфорилированы более чем на одном аминокислотном остатке. 1990-е годы можно охарактеризовать как "десятилетие каскадов протеинкиназ". В это время были открыты путь MAPK/ERK, киназы JAK (семейство белковых тирозинкиназ) и каскад киназ, зависимый от PIP3. Киназы классифицируются на широкие группы по субстрату, на который они действуют: протеинкиназы, липидные киназы, углеводные киназы. Киназы встречаются у различных видов, от бактерий до плесени, червей и млекопитающих. У человека было идентифицировано более пятисот различных киназ.

Белокожие киназы

Протеинкиназы действуют на белки, фосфорилируя их на остатках серина, треонина, тирозина или гистидина. Фосфорилирование может изменять функцию белка различными способами. Оно может увеличивать или уменьшать активность белка, стабилизировать его или пометить для разрушения, локализовать его в определенном клеточном компартменте, а также инициировать или нарушать его взаимодействие с другими белками. Протеинкиназы составляют большинство всех киназ и широко изучаются. Эти киназы, в сочетании с фосфатазами, играют важную роль в регуляции белков и ферментов, а также в клеточной сигнализации. Часто возникает путаница, когда речь идет о различных способах достижения биологической регуляции клеткой. Существует бесчисленное множество примеров ковалентных модификаций, которым могут подвергаться клеточные белки; однако, фосфорилирование – одна из немногих обратимых ковалентных модификаций. Это послужило основанием для предположения, что фосфорилирование белков является регуляторным механизмом. Потенциал регулирования функции белка огромен, учитывая множество способов ковалентной модификации белка, помимо регуляции, обеспечиваемой аллостерическим контролем. В своей лекции памяти Хопкинса Эдвин Кребс утверждал, что аллостерический контроль эволюционировал для ответа на сигналы, возникающие внутри клетки, в то время как фосфорилирование эволюционировало для ответа на сигналы извне клетки. Эта идея согласуется с тем фактом, что фосфорилирование белков происходит гораздо чаще в эукариотических клетках по сравнению с прокариотическими, поскольку более сложный тип клеток эволюционировал, чтобы реагировать на более широкий спектр сигналов. Различные комбинации специфических CDK и циклинов определяют различные фазы клеточного цикла. Кроме того, степень фосфорилирования CDK также критически важна для их активности, поскольку они подвергаются регуляции другими киназами (такими как CDK-активирующая киназа) и фосфатазами (такими как Cdc25). После активации CDK фосфорилируют другие белки, изменяя их активность, что приводит к событиям, необходимым для следующей фазы клеточного цикла. Хотя CDK наиболее известны своей ролью в контроле клеточного цикла, они также участвуют в транскрипции, метаболизме и других клеточных процессах. Из-за их ключевой роли в контроле клеточного деления мутации в CDK часто встречаются в раковых клетках. Эти мутации приводят к неконтролируемому росту клеток, которые быстро и многократно проходят весь клеточный цикл. Мутации CDK могут быть обнаружены при лимфомах, раке молочной железы, опухолях поджелудочной железы и раке легких. Поэтому ингибиторы CDK разрабатываются в качестве методов лечения некоторых видов рака. Клиническая значимость MAPK-пути обусловлена его канцерогенным потенциалом. Он вовлечен в клеточные процессы, которые могут привести к неконтролируемому росту и последующему образованию опухолей. Мутации в этом пути изменяют его регуляторное влияние на дифференцировку клеток, пролиферацию, выживание и апоптоз, все из которых связаны с различными формами рака. Мутации в этих киназах, таких как PI3K, могут приводить к раку или инсулинорезистентности. Киназные ферменты увеличивают скорость реакций, делая инозитольную гидроксильную группу более нуклеофильной, часто используя боковую цепь аминокислотного остатка в качестве общей основы для депротонирования гидроксила, как показано в механизме ниже.

Protein kinases act on proteins, by phosphorylating them on their serine, threonine, tyrosine, or histidine residues. Phosphorylation can modify the function of a protein in many ways. It can increase or decrease a protein's activity, stabilize it or mark it for destruction, localize it within a specific cellular compartment, and it can initiate or disrupt its interaction with other proteins. The protein kinases make up the majority of all kinases and are widely studied. These kinases, in conjunction with phosphatases, play a major role in protein and enzyme regulation as well as signalling in the cell. A common point of confusion arises when thinking about the different ways a cell achieves biological regulation. There are countless examples of covalent modifications that cellular proteins can undergo; however, phosphorylation is one of the few reversible covalent modifications. This provided the rationale that phosphorylation of proteins is regulatory. The potential to regulate protein function is enormous given that there are many ways to covalently modify a protein in addition to regulation provided by allosteric control. In his Hopkins Memorial Lecture, Edwin Krebs asserted that allosteric control evolved to respond to signals arising from inside the cell, whereas phosphorylation evolved to respond to signals outside of the cell. This idea is consistent with the fact that phosphorylation of proteins occurs much more frequently in eukaryotic cells in comparison to prokaryotic cells because the more complex cell type evolved to respond to a wider array of signals. Different combinations of specific CDKs and cyclins mark different parts of the cell cycle. Additionally, the phosphorylation state of CDKs is also critical to their activity, as they are subject to regulation by other kinases (such as CDK activating kinase) and phosphatases (such as Cdc25). Once the CDKs are active, they phosphorylate other proteins to change their activity, which leads to events necessary for the next stage of the cell cycle. While they are most known for their function in cell cycle control, CDKs also have roles in transcription, metabolism, and other cellular events. Because of their key role in the controlling cell division, mutations in CDKs are often found in cancerous cells. These mutations lead to uncontrolled growth of the cells, where they are rapidly going through the whole cell cycle repeatedly. CDK mutations can be found in lymphomas, breast cancer, pancreatic tumors, and lung cancer. Therefore, inhibitors of CDK have been developed as treatments for some types of cancer. The carcinogenic potential of the MAPK pathway makes it clinically significant. It is implicated in cell processes that can lead to uncontrolled growth and subsequent tumor formation. Mutations within this pathway alter its regulatory effects on cell differentiation, proliferation, survival, and apoptosis, all of which are implicated in various forms of cancer. Mutations in these kinases, such as PI3K, can lead to cancer or insulin resistance. The kinase enzymes increase the rate of the reactions by making the inositol hydroxyl group more nucleophilic, often using the side chain of an amino acid residue to act as a general base and deprotonate the hydroxyl, as seen in the mechanism below.]]

Сфингозинкиназы

Сфингозинкиназа (SK) – это липид-киназа, катализирующая превращение сфингозина в сфингозин-1-фосфат (S1P). Сфинголипиды – это повсеместно распространенные мембранные липиды. После активации сфингозинкиназа мигрирует из цитозоля к плазматической мембране, где она переносит γ-фосфат (последний или терминальный фосфат) из АТФ или ГТФ на сфингозин. Рецептор S1P является GPCR-рецептором, поэтому S1P способен регулировать G-белковый сигнальный путь. Образующийся сигнал может активировать внутриклеточные эффекторы, такие как ERKs, Rho GTPase, Rac GTPase, PLC и AKT/PI3K, а также оказывать влияние на молекулы-мишени внутри клетки. Показано, что S1P напрямую ингибирует гистондезацетилазную активность HDAC. В то же время, дефосфорилированный сфингозин способствует клеточному апоптозу, поэтому понимание регуляции SK имеет решающее значение из-за его роли в определении клеточной судьбы. Предыдущие исследования показали, что SK могут поддерживать рост раковых клеток, стимулируя клеточную пролиферацию, а SK1 (специфический тип SK) присутствует в более высоких концентрациях при определенных типах рака. В клетках млекопитающих присутствуют две киназы – SK1 и SK2. SK1 более специфичен, чем SK2, и их паттерны экспрессии также различаются. SK1 экспрессируется в клетках легких, селезенки и лейкоцитах, в то время как SK2 экспрессируется в клетках почек и печени. Участие этих двух киназ в выживании клеток, пролиферации, дифференцировке и воспалении делает их перспективными кандидатами для химиотерапевтических стратегий.

Углеводокиназы

Углеводы обеспечивают значительную часть суточной калорийности рациона у многих млекопитающих. Для извлечения энергии из олигосахаридов их необходимо сначала расщепить на моносахариды, чтобы они могли быть включены в метаболизм. Киназы играют важную роль практически во всех метаболических путях. На рисунке слева представлена вторая фаза гликолиза, включающая две важные реакции, катализируемые киназами. Ангидридная связь в 1,3-бисфосфоглицерате нестабильна и обладает высокой энергией. 1,3-бисфосфоглицераткиназа требует АДФ для осуществления реакции, в результате которой образуются 3-фосфоглицерат и АТФ. На заключительном этапе гликолиза пируваткиназа переносит фосфорильную группу от фосфоенолпирувата к АДФ, генерируя АТФ и пируват. Гексокиназа – наиболее распространенный фермент, использующий глюкозу при ее первоначальном поступлении в клетку. Она превращает D-глюкозу в глюкозо-6-фосфат, перенося гамма-фосфат АТФ в позицию C6. Это важный этап гликолиза, поскольку он удерживает глюкозу внутри клетки благодаря отрицательному заряду. В дефосфорилированной форме глюкоза может легко перемещаться через мембрану в обоих направлениях. Мутации в гене гексокиназы могут привести к дефициту гексокиназы, который может вызывать несфероцитарную гемолитическую анемию. Фосфофруктокиназа, или PFK, катализирует превращение фруктозо-6-фосфата в фруктозо-1,6-бисфосфат и является важным звеном в регуляции гликолиза. Высокие уровни АТФ, H+ и цитрата ингибируют PFK. Если уровень цитрата высок, это означает, что гликолиз протекает с оптимальной скоростью. Высокие уровни АМФ стимулируют PFK. Болезнь Таруи, гликогеноз, приводящий к непереносимости физических нагрузок, обусловлен мутацией в гене PFK, снижающей его активность.

Другие киназы

Киназы действуют на множество других молекул, помимо белков, липидов и углеводов. Многие из них действуют на нуклеотиды (ДНК и РНК), включая ферменты, участвующие во взаимопревращении нуклеотидов, такие как нуклеозидфосфаткиназы и нуклеозиддифосфаткиназы. Другие небольшие молекулы, являющиеся субстратами киназ, включают креатин, фосфоглицерат, рибофлавин, дигидроксиацетон, шикимат и многие другие.

Рибофлавинкиназа

Рибофлавинкиназа катализирует фосфорилирование рибофлавина с образованием мононуклеотида флавина (ФМН). Она обладает упорядоченным механизмом связывания, при котором рибофлавин должен связаться с киназой до связывания с молекулой АТФ. Дивалентные катионы способствуют координации нуклеотида. Рибофлавинкиназа может способствовать профилактике инсульта и потенциально может быть использована в качестве средства лечения в будущем. Также было показано, что она играет роль при инфекциях в исследованиях на мышах.

Тимидинкиназа

Тимидинкиназа является одной из многих нуклеозидных киназ, отвечающих за фосфорилирование нуклеозидов. Она фосфорилирует тимидин, образуя тимидинмонофосфат (dTMP). Эта киназа использует молекулу АТФ для присоединения фосфатной группы к тимидину, как показано ниже. Этот перенос фосфата от одного нуклеотида к другому тимидинкиназой, а также другими нуклеозидными и нуклеотидными киназами, способствует регулированию уровня различных нуклеотидов. После образования молекулы dTMP другая киназа, тимидилат-киназа, может действовать на dTMP, образуя дифосфатную форму, dTDP. Нуклеозиддифосфаткиназа катализирует образование тимидинтрифосфата (dTTP), который используется в синтезе ДНК. В связи с этим, активность тимидинкиназы тесно связана с клеточным циклом и используется в качестве опухолевого маркера в клинической химии. Следовательно, ее иногда можно использовать для прогнозирования прогноза у пациентов. Пациенты с мутациями в гене тимидинкиназы могут страдать определенным типом синдрома истощения митохондриальной ДНК – заболеванием, приводящим к смерти в раннем детстве.