Аминоацил-тРНК синтетазы: структура, функции и механизмы действия.

Введение

Класс ферментов

Аминоацил-тРНК-синтетаза (aaRS или ARS), также называемая тРНК-лигазой, – это фермент, который присоединяет соответствующую аминокислоту к своей соответствующей тРНК. Она осуществляет это, катализируя переэтерификацию специфической когнитивной аминокислоты или её предшественника к одной из всех совместимых когнитивных тРНК, образуя аминоацил-тРНК. У человека 20 различных типов аминоацил-тРНК синтезируются 20 различными аминоацил-тРНК-синтетазами, по одной для каждой аминокислоты генетического кода. Этот процесс иногда называют "зарядом" или "насыщением" тРНК аминокислотой. После "заряда" тРНК рибосома может переносить аминокислоту из тРНК на растущую пептидную цепь в соответствии с генетическим кодом. Таким образом, аминоацил-тРНК играет важную роль в трансляции РНК, экспрессии генов для синтеза белков.

Структуры

Оба класса аминоацил-тРНК-синтетаз являются мультидоменными белками. В типичном случае aaRS состоит из каталитического домена (где происходят обе вышеуказанные реакции) и антикодон-связывающего домена (который взаимодействует преимущественно с антикодонной областью тРНК). Трансферные РНК для разных аминокислот различаются не только по антикодону, но и в других участках, что придает им несколько иные общие конфигурации. Аминоацил-тРНК-синтетазы распознают правильные тРНК главным образом по их общей конфигурации, а не только по антикодону. Кроме того, некоторые aaRS обладают дополнительными доменами связывания РНК и доменами редактирования, которые расщепляют некорректно спаренные молекулы аминоацил-тРНК. Каталитические домены всех aaRS данного класса гомологичны друг другу, тогда как aaRS класса I и класса II не имеют родства друг к другу. aaRS класса I характеризуются складкой, подобной цитидилилтрансферазе Россмана, встречающейся в белках, таких как глицерин-3-фосфат цитидилилтрансфераза, никотинамиднуклеотид аденилилтрансфераза и археальная FAD-синтаза, в то время как aaRS класса II имеют уникальную складку, связанную с биотиновыми и липоатными лигазами. Альфа-спиральный антикодон-связывающий домен аргинил-, глицил- и цистеинил-тРНК-синтетаз известен как домен DALR по названию характерных консервативных аминокислот. Аминоацил-тРНК-синтетазы были кинетически изучены, что показало активную каталитическую роль ионов Mg2+ и, следовательно, некоторую степень магний-зависимости aaRS. Увеличение концентрации Mg2+ приводит к увеличению констант равновесия для реакций аминоацил-тРНК-синтетаз. Хотя эта тенденция наблюдалась как для синтетаз класса I, так и для синтетаз класса II, магний-зависимость для этих двух классов существенно различается. Синтетазы класса II используют два или (чаще) три иона Mg2+, в то время как класс I требует только один ион Mg2+. Помимо отсутствия общего сходства последовательностей и структур, синтетазы класса I и класса II демонстрируют различные механизмы распознавания АТФ. В то время как класс I связывается посредством взаимодействий, опосредованных водородными связями по основной цепи, класс II использует пару остатков аргинина для установления солевых мостиков со своим лигандом АТФ. Эта противоположная реализация проявляется в двух структурных мотивах – «Костные скобки» и «Аргининовые пинцеты», которые наблюдаются во всех структурах класса I и класса II соответственно. Высокая структурная консервация этих мотивов позволяет предположить, что они существовали с древних времен.

Both classes of aminoacyl tRNA synthetases are multidomain proteins. In a typical scenario, an aaRS consists of a catalytic domain (where both the above reactions take place) and an anticodon binding domain (which interacts mostly with the anticodon region of the tRNA). Transfer RNAs for different amino acids differ not only in their anticodon but also at other points, giving them slightly different overall configurations. The aminoacyl tRNA synthetases recognize the correct tRNAs primarily through their overall configuration, not just through their anticodon. In addition, some aaRSs have additional RNA binding domains and editing domains that cleave incorrectly paired aminoacyl tRNA molecules. The catalytic domains of all the aaRSs of a given class are found to be homologous to one another, whereas class I and class II aaRSs are unrelated to one another. The class I aaRSs feature a cytidylyltransferase like Rossmann fold seen in proteins like glycerol 3 phosphate cytidylyltransferase, nicotinamide nucleotide adenylyltransferase and archaeal FAD synthase, whereas the class II aaRSs have a unique fold related to biotin and lipoate ligases. The alpha helical anticodon binding domain of arginyl , glycyl and cysteinyl tRNA synthetases is known as the DALR domain after characteristic conserved amino acids. Aminoacyl tRNA synthetases have been kinetically studied, showing that Mg2+ ions play an active catalytic role and therefore aaRs have a degree of magnesium dependence. Increasing the Mg2+ concentration leads to an increase in the equilibrium constants for the aminoacyl tRNA synthetases’ reactions. Although this trend was seen in both class I and class II synthetases, the magnesium dependence for the two classes are very distinct. Class II synthetases have two or (more frequently) three Mg2+ ions, while class I only requires one Mg2+ ion. Beside their lack of overall sequence and structure similarity, class I and class II synthetases feature different ATP recognition mechanisms. While class I binds via interactions mediated by backbone hydrogen bonds, class II uses a pair of arginine residues to establish salt bridges to its ATP ligand. This oppositional implementation is manifested in two structural motifs, the Backbone Brackets and Arginine Tweezers, which are observable in all class I and class II structures, respectively. The high structural conservation of these motifs suggest that they must have been present since ancient times.

Эволюция

Большинство aaRS данной специфичности эволюционно ближе друг к другу, чем к aaRS другой специфичности. Однако AsnRS и GlnRS группируются внутри AspRS и GluRS соответственно. Большинство aaRS с данной специфичностью также относятся к одному классу. Однако существуют две различные версии LysRS – одна относится к семейству класса I, а другая – к семейству класса II. Молекулярные филогенезы aaRS часто не соответствуют общепринятым филогенезам организмов. То есть, они нарушают так называемую каноническую филогенетическую картину, демонстрируемую большинством других ферментов для трех доменов жизни – Археи, Бактерий и Эукариот. Кроме того, филогенезы, построенные для aaRS различных аминокислот, часто не согласуются друг с другом. Более того, паралоги aaRS внутри одного и того же вида демонстрируют высокую степень дивергенции. Это явные признаки того, что горизонтальный перенос генов происходил неоднократно в ходе эволюционной истории aaRS. Распространенное убеждение в эволюционной стабильности этого суперсемейства, подразумевающее, что каждый организм обладает всеми aaRS для соответствующих аминокислот, ошибочно. Крупномасштабный геномный анализ примерно 2500 прокариотических геномов показал, что многие из них лишены одного или нескольких генов aaRS, в то время как многие геномы содержат один или несколько паралогов. AlaRS, GlyRS, LeuRS, IleRS и ValRS – наиболее эволюционно стабильные представители семейства. GluRS, LysRS и CysRS часто имеют паралоги, тогда как AsnRS, GlnRS, PylRS и SepRS часто отсутствуют во многих геномах. За исключением AlaRS, было обнаружено, что 19 из 20 человеческих aaRS добавили как минимум один новый домен или мотив. Эти новые домены и мотивы различаются по функциям и встречаются в различных формах жизни. Распространенная новая функция в человеческих aaRS заключается в обеспечении дополнительной регуляции биологических процессов. Существует теория, что увеличение числа aaRS, добавляющих домены, связано с непрерывной эволюцией высших организмов, обладающих более сложными и эффективными строительными блоками и биологическими механизмами. Одним из ключевых доказательств этой теории является то, что после добавления нового домена к aaRS, этот домен полностью интегрируется. Функциональность этого нового домена с этого момента сохраняется. По мере эволюции генетической эффективности у высших организмов было добавлено 13 новых доменов, не имеющих очевидной связи с каталитической активностью генов aaRS.

Most of the aaRSs of a given specificity are evolutionarily closer to one another than to aaRSs of another specificity. However, AsnRS and GlnRS group within AspRS and GluRS, respectively. Most of the aaRSs of a given specificity also belong to a single class. However, there are two distinct versions of the LysRS one belonging to the class I family and the other belonging to the class II family. The molecular phylogenies of aaRSs are often not consistent with accepted organismal phylogenies. That is, they violate the so called canonical phylogenetic pattern shown by most other enzymes for the three domains of life Archaea, Bacteria, and Eukarya. Furthermore, the phylogenies inferred for aaRSs of different amino acids often do not agree with one another. In addition, aaRS paralogs within the same species show a high degree of divergence between them. These are clear indications that horizontal transfer has occurred several times during the evolutionary history of aaRSs. A widespread belief in the evolutionary stability of this superfamily, meaning that every organism has all the aaRSs for their corresponding amino acids, is misconceived. A large scale genomic analysis on ~2500 prokaryotic genomes showed that many of them miss one or more aaRS genes whereas many genomes have 1 or more paralogs. AlaRS, GlyRS, LeuRS, IleRS and ValRS are the most evolutionarily stable members of the family. GluRS, LysRS and CysRS often have paralogs, whereas AsnRS, GlnRS, PylRS and SepRS are often absent from many genomes. With the exception of AlaRS, it has been discovered that 19 out of the 20 human aaRSs have added at least one new domain or motif. These new domains and motifs vary in function and are observed in various forms of life. A common novel function within human aaRSs is providing additional regulation of biological processes. There exists a theory that the increasing number of aaRSs that add domains is due to the continuous evolution of higher organisms with more complex and efficient building blocks and biological mechanisms. One key piece of evidence to this theory is that after a new domain is added to an aaRS, the domain becomes fully integrated. This new domain's functionality is conserved from that point on. As genetic efficiency evolved in higher organisms, 13 new domains with no obvious association with the catalytic activity of aaRSs genes have been added.

Применение в биотехнологии

В некоторых аминоацил-тРНК-синтетазах полость, удерживающая аминокислоту, может быть подвергнута мутациям и модификациям для включения неестественных аминокислот, синтезированных в лаборатории, и присоединения их к специфическим тРНК. Это расширяет генетический код, выходя за рамки двадцати канонических аминокислот, встречающихся в природе, и включает в себя неестественную аминокислоту. Неестественная аминокислота кодируется бессмысленным триплетом (TAG, TGA, TAA), квадроплетным кодоном или, в некоторых случаях, избыточным редким кодоном. Организм, экспрессирующий мутантную синтетазу, может быть затем генетически запрограммирован на включение неестественной аминокислоты в любую желаемую позицию в любом интересующем белке, что позволяет биохимикам и структурным биологам изучать или изменять функцию белка. Например, можно начать с гена белка, связывающего определенную последовательность ДНК, и, направив неестественную аминокислоту с реактивной боковой цепью в сайт связывания, создать новый белок, который разрезает ДНК в целевой последовательности, а не связывает ее. Путем мутирования аминоацил-тРНК-синтетаз химики расширили генетические коды различных организмов, включив в них синтезированные в лаборатории аминокислоты с различными полезными свойствами: фотореактивные, хелатирующие металлы, хелатирующие ксенон, сшивающие, спин-резонансные, флуоресцентные, биотинилированные и обладающие окислительно-восстановительной активностью аминокислоты. Другое применение – введение аминокислот, несущих реактивные функциональные группы для химической модификации целевого белка. Возникновение определенных заболеваний (таких как нейропатологии, рак, нарушения метаболизма и аутоиммунные расстройства) коррелирует со специфическими мутациями аминоацил-тРНК-синтетаз. Болезнь Шарко-Мари-Тута (CMT) – наиболее частое наследственное заболевание периферической нервной системы (нейронное заболевание) и вызвано наследственной мутацией в гликолевой и тирозильной тРНК. Диабет, метаболическое заболевание, индуцирует окислительный стресс, который приводит к накоплению мутаций митохондриальной тРНК. Также было обнаружено, что тРНК-синтетазы могут частично участвовать в этиологии рака. Высокий уровень экспрессии или модификации aaRS наблюдается при различных видах рака. Распространенным последствием мутаций aaRS является нарушение формы/образования димера, что напрямую связано с его функцией. Эти корреляции между aaRS и определенными заболеваниями открыли новые возможности для синтеза терапевтических средств.

In some of the aminoacyl tRNA synthetases, the cavity that holds the amino acid can be mutated and modified to carry unnatural amino acids synthesized in the lab, and to attach them to specific tRNAs. This expands the genetic code, beyond the twenty canonical amino acids found in nature, to include an unnatural amino acid as well. The unnatural amino acid is coded by a nonsense (TAG, TGA, TAA) triplet, a quadruplet codon, or in some cases a redundant rare codon. The organism that expresses the mutant synthetase can then be genetically programmed to incorporate the unnatural amino acid into any desired position in any protein of interest, allowing biochemists or structural biologists to probe or change the protein's function. For instance, one can start with the gene for a protein that binds a certain sequence of DNA, and, by directing an unnatural amino acid with a reactive side chain into the binding site, create a new protein that cuts the DNA at the target sequence, rather than binding it. By mutating aminoacyl tRNA synthetases, chemists have expanded the genetic codes of various organisms to include lab synthesized amino acids with all kinds of useful properties: photoreactive, metal chelating, xenon chelating, crosslinking, spin resonant, fluorescent, biotinylated, and redox active amino acids. Another use is introducing amino acids bearing reactive functional groups for chemically modifying the target protein. Certain diseases’ causation (such as neuronal pathologies, cancer, disturbed metabolic conditions, and autoimmune disorders) have been correlated to specific mutations of aminoacyl tRNA synthetases. Charcot Marie Tooth (CMT) is the most frequent heritable disorder of the peripheral nervous system (a neuronal disease) and is caused by a heritable mutation in glycol tRNA and tyrosyl tRNA. Diabetes, a metabolic disease, induces oxidative stress, which triggers a build up of mitochondrial tRNA mutations. It has also been discovered that tRNA synthetases may be partially involved in the etiology of cancer. A high level of expression or modification of aaRSs has been observed within a range of cancers. A common outcome from mutations of aaRSs is a disturbance of dimer shape/formation which has a direct relationship with its function. These correlations between aaRSs and certain diseases have opened up a new door to synthesizing therapeutics.

Некаталитические области

Добавления новых доменов к генам aaRS носят аккретивный и прогрессивный характер по мере восхождения по Древу Жизни. Сильное эволюционное давление, оказываемое на эти небольшие некаталитические белковые домены, указывало на их значимость. Исследования, начатые в 1999 году и продолженные позднее, выявили ранее не признанный уровень биологической регуляции: эти белки контролируют экспрессию генов в клетке, где они синтезируются, а после высвобождения оказывают гомеостатическое и регуляторное воздействие на развитие в определенных типах клеток человека, тканях и органах в период взрослого или плодового развития, или в обоих, включая пути, связанные с ангиогенезом, воспалением, иммунным ответом, сигнализацией механистической мишени рапамицина (mTOR), апоптозом, опухолегенезом, а также сигнализацией интерферона гамма (IFN) и p53.

Снижение субстрата

В 2022 году было обнаружено, что аминоацил-тРНК-синтетазы могут включать альтернативные аминокислоты при дефиците их предшественников. В частности, триптофанил-тРНК-синтетаза (WARS1) включает фенилаланин при истощении триптофана, фактически вызывая переназначение кодона W>F. Дефицит другого субстрата аминоацил-тРНК-синтетаз, когнитивной тРНК, может иметь отношение к определенным заболеваниям, например, к болезни Шарко-Мари-Тута. Показано, что мутантные варианты глицил-тРНК-синтетазы при болезни Шарко-Мари-Тута все еще способны связывать тРНК-гли, но не могут высвободить ее, что приводит к истощению клеточного пула глицил-тРНК-гли, что, в свою очередь, вызывает остановку рибосомы на кодонах глицина во время трансляции мРНК.

Клинические

Мутации в митохондриальном ферменте ассоциируются с рядом генетических заболеваний, включая синдром Ли, синдром Веста и CAGSSS (катаракта, дефицит гормона роста, сенсорная нейропатия, сенсоневральная потеря слуха и синдром скелетной дисплазии).