Метагеника и производство биотоплива на основе микроорганизмов.

Введение

Слово "метагенетика" использует префикс "мета" и суффикс "ген". Буквально оно означает "создание того, что создает". В контексте биотехнологии метагенетика – это практика конструирования организмов для производства конкретного фермента, белка или других биохимических веществ из более простых исходных материалов. Примером является генетическая инженерия *E. coli* с целью производства инсулина человека из аминокислот. *E. coli* также была сконструирована для переваривания растительной биомассы и использования ее для производства углеводородов с целью синтеза биотоплива. Области применения метагенетики в отношении *E. coli* также включают высшие спирты, химические вещества на основе жирных кислот и терпены.

Биотопливо

Истощение запасов нефти и увеличение выбросов парниковых газов в двадцатом и двадцать первом веках стали определяющим фактором в развитии биотоплива из микроорганизмов. В настоящее время *E. coli* считается наиболее перспективным вариантом для производства биотоплива благодаря объему доступных знаний о его геноме. Этот процесс преобразует биомассу в топливо и успешно применяется в промышленных масштабах: в 2007 году в США было произведено 6,4 миллиарда галлонов биоэтанола. Биоэтанол в настоящее время является лидером в производстве альтернативного топлива и использует *S. cerevisiae* и *Zymomonas mobilis* для получения этанола путем ферментации. Однако максимальная продуктивность ограничена тем, что эти организмы не способны использовать пентозные сахара, что обуславливает интерес к *E. coli* и *Clostridia*. *E. coli* способна производить этанол в анаэробных условиях путем метаболизма глюкозы с образованием двух молей формиата, двух молей ацетата и одного моля этанола. Несмотря на успешное применение биоэтанола в качестве альтернативного топлива в промышленных масштабах, он имеет и недостатки, такие как низкая энергетическая плотность, высокое давление паров и гигроскопичность. К текущим альтернативам биоэтанолу относятся биобутанол, биодизель, пропанол и синтетические углеводороды. Наиболее распространенной формой биодизеля являются метиловые эфиры жирных кислот, а современные стратегии синтеза включают трансэстерификацию триацилглицеролов из растительных масел. Однако доступность растительных масел ограничена из-за конкурентной стоимости масличных культур, что стимулирует интерес к прямому синтезу метиловых эфиров жирных кислот в бактериях. Этот процесс позволяет избежать трансэстерификации, что приводит к более высокой энергетической эффективности и снижению производственных затрат. Одним из основных препятствий для производства жизнеспособного биотоплива является то, что максимальное соотношение биотоплива к нефти составляет от 10% до 20%. Существующие биотоплива несовместимы с высокопроизводительными двигателями с низким уровнем выбросов, и для их использования потребуются дорогостоящие изменения в инфраструктуре и модернизация двигателей. Исследование, проведенное в Университете Эксетера, было направлено на преодоление этого препятствия путем производства биотоплива, способного заменить ископаемое топливо устойчивым способом, а именно, путем производства н-алканов, изоалканов и н-алкенов, поскольку именно эти углеводороды составляют современные розничные транспортные топлива. В ходе исследования были выявлены подходящие субстраты для производства вышеуказанных углеводородов с использованием комплекса редуктазы жирных кислот (FAR) *P. luminescens*. В исследовании, опубликованном в журнале Biotechnology for Biofuels, *S. cerevisiae* использовалась для производства коротко- и разветвленноцепочечных алкилэстеров биодизеля с помощью метаболической инженерии. Для повышения способности *S. cerevisiae* производить эфиры жирных кислот были удалены негативные регуляторы гена *INO1* – Rpd3 и Opi1. Для увеличения производства прекурсоров спиртов было проведено сверхэкспрессирование пяти ферментов изобутанольного пути.

The depletion of petroleum sources and increase in greenhouse gas emissions in the twenty and twenty first centuries has been the driving factor behind the development of biofuels from microorganisms. E. coli is currently regarded as the best option for biofuel production because of the amount of knowledge available about its genome. The process converts biomass into fuels, and has proven successful on an industrial scale, with the United States having produced 6.4 billion gallons of bioethanol in 2007. Bioethenol is currently the front runner for alternative fuel production and uses S. cerevisiae and Zymomonas mobilis to create ethanol through fermentation. However, maximum productivity is limited due to the fact that these organisms cannot use pentose sugars, leading to consideration of E. coli and Clostridia. E. coli is capable of producing ethanol under anaerobic conditions through metabolizing glucose into two moles of formate, two moles of acetate, and one mole of ethanol. While bioethanol has proved to be a successful alternative fuel source on an industrial scale, it also has its shortcomings, namely, its low energy density, high vapor pressure, and hygroscopicity. Current alternatives to bioethanol include biobutanol, biodiesel, propanol, and synthetic hydrocarbons. The most common form of biodiesels is fatty acid methyl esters and current synthesis strategies involve transesterification of triacylglycerols from plant oils. However, plant oils have a major limitation in availability of oil seed supplies at competitive prices, leading to an interest in direct synthesis of fatty acid methyl esters in bacteria. This process bypasses transesterification, leading to higher energy yields and lower production cost. One of the principal obstacles in production of viable biofuels is that the maximum blend ratio of biofuel to petroleum is between 10% and 20%, Current biofuels are not compatible with high performance, low emission engines and costly changes in infrastructure and engine remodeling would be required. A University of Exeter study sought to overcome this obstacle through production of biofuels that can replace current fossil fuels through sustainable means, namely, the production of n alkanes, iso alkanes, and n alkenes, as these are the hydrocarbons that compose current retail transport fuels. The study found suitable substrates for production of the aforementioned hydrocarbons by means of the P. luminescens fatty acid reductase (FAR) complex. A study published in Biotechnology for Biofuels used S. cerevisiae to produce short and branched chain alkyl esters biodiesel through metabolic engineering. Negative regulators for the INO1 gene, Rpd3 and Opi1 were deleted to boost S. cerevisiae's ability to produce fatty acid esters. To increase the production of alcohol precursors, five isobutanol pathway enzymes were overexpressed.

Производство инсулина

Увеличение спроса на рекомбинантный инсулин можно объяснить ростом числа пациентов с диабетом во всем мире, а также альтернативными способами введения, такими как ингаляционный и пероральный, которые требуют более высоких доз. С помощью технологии рекомбинантной ДНК бактерии *E. coli* могут использоваться для производства инсулина человека. Биосинтез инсулина в организме человека имеет значительное преимущество по сравнению с синтезом у крупного рогатого скота или свиней, которые часто вызывают иммуногенный ответ у пациентов с диабетом. Для этого синтетические гены инсулина человека сливаются с геном β-галактозидазы *E. coli*, где они подвергаются транскрипции и, в конечном итоге, трансляции в белки. Ограничивающим фактором при использовании микроорганизмов, таких как *E. coli*, для биосинтеза генных продуктов, таких как инсулин, является время, однако благодаря достижениям в синтезе олигонуклеотидов и жидкостной хроматографии время, необходимое для получения фрагментов ДНК, значительно сократилось. Рекомбинантный человеческий инсулин впервые был одобрен для клинических испытаний в 1980 году. В то время цепи А и В инсулина производились отдельно, а затем химически соединялись. Соединение двух цепей часто осуществлялось путем окисления на воздухе с низкой эффективностью. Исследование 1978 года, проведенное Goedell и соавторами, успешно продемонстрировало правильное соединение цепей А и В с использованием S-сульфонированных производных и избытка цепи А, что привело к правильному соединению в 50–80% случаев. Недавние достижения позволили синтезировать цепи вместе, введя ген проинсулина человека в клетки *E. coli*, которые производят проинсулин путем ферментации.