Молекулярная биология: изучение жизни на молекулярном уровне

Введение

Молекулярная биология /m//ə/'/l//ɛ//k//j//ʊ//l//ər/ – это раздел биологии, изучающий биологические системы на молекулярном уровне.

Молекулярная биология стремится понять молекулярные основы биологической активности в клетках и между ними, включая биомолекулярный синтез, модификацию, механизмы и взаимодействия. Хотя клетки и другие микроскопические структуры наблюдались в живых организмах еще в XVIII веке, детальное понимание механизмов и взаимодействий, определяющих их поведение, появилось лишь в XX веке, когда технологии, используемые в физике и химии, достигли достаточного развития для применения в биологических науках. Термин «молекулярная биология» впервые был использован в 1945 году английским физиком Уильямом Астбери, который определил ее как подход, направленный на выяснение основ биологических явлений, то есть на раскрытие физических и химических структур и свойств биологических молекул, а также их взаимодействий с другими молекулами и объяснение на этой основе наблюдений, сделанных в классической биологии, которая изучает биологические процессы в больших масштабах и на более высоких уровнях организации. В 1953 году Фрэнсис Крик, Джеймс Уотсон, Розалинд Франклин и их коллеги из подразделения Медицинского исследовательского совета при Лаборатории Кавендиша впервые описали модель двойной спирали для химической структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), что часто рассматривается как знаковое событие для зарождающейся области, поскольку это предоставило физико-химическую основу для понимания ранее расплывчатой идеи о нуклеиновых кислотах как основном веществе биологического наследования. Они предложили эту структуру на основе предыдущих исследований, проведенных Франклин, результаты которых были переданы им Морисом Уилкинсом и Максом Перуцем. Их работа привела к обнаружению ДНК в других микроорганизмах, растениях и животных. В сферу молекулярной биологии входят методы, позволяющие ученым изучать молекулярные процессы. Эти методы используются для разработки новых лекарственных препаратов, диагностики заболеваний и более глубокого понимания физиологии клеток. Некоторые клинические исследования и медицинские терапии, основанные на молекулярной биологии, относятся к генной терапии, а применение молекулярной биологии или молекулярной клеточной биологии в медицине теперь называется молекулярной медициной.

Molecular biology /m//ə/'/l//ɛ//k//j//ʊ//l//ər/ is a branch of biology that seeks to understand the molecular basis of biological activity in and between cells, including biomolecular synthesis, modification, mechanisms, and interactions. Though cells and other microscopic structures had been observed in living organisms as early as the 18th century, a detailed understanding of the mechanisms and interactions governing their behavior did not emerge until the 20th century, when technologies used in physics and chemistry had advanced sufficiently to permit their application in the biological sciences. The term 'molecular biology' was first used in 1945 by the English physicist William Astbury, who described it as an approach focused on discerning the underpinnings of biological phenomena—i. e. uncovering the physical and chemical structures and properties of biological molecules, as well as their interactions with other molecules and how these interactions explain observations of so called classical biology, which instead studies biological processes at larger scales and higher levels of organization. In 1953 Francis Crick, James Watson, Rosalind Franklin, and their colleagues at the Medical Research Council Unit, Cavendish Laboratory, were the first to describe the double helix model for the chemical structure of deoxyribonucleic acid (DNA), which is often considered a landmark event for the nascent field because it provided a physico chemical basis by which to understand the previously nebulous idea of nucleic acids as the primary substance of biological inheritance. They proposed this structure based on previous research done by Franklin, which was conveyed to them by Maurice Wilkins and Max Perutz. Their work led to the discovery of DNA in other microorganisms, plants, and animals. The field of molecular biology includes techniques which enable scientists to learn about molecular processes. These techniques are used to efficiently target new drugs, diagnose disease, and better understand cell physiology. Some clinical research and medical therapies arising from molecular biology are covered under gene therapy, whereas the use of molecular biology or molecular cell biology in medicine is now referred to as molecular medicine.

История молекулярной биологии

Молекулярная биология находится на стыке биохимии и генетики; по мере развития этих научных дисциплин в 20 веке стало очевидно, что обе они стремились установить молекулярные механизмы, лежащие в основе жизненно важных клеточных функций. Достижения в молекулярной биологии тесно связаны с разработкой и оптимизацией новых технологий. Молекулярная биология была прояснена благодаря работам многих ученых, и поэтому история этой области зависит от понимания вклада этих ученых и их экспериментов. Генетика возникла из попыток понять закономерности, лежащие в основе размножения и наследственности, и природу гипотетических единиц наследственности, известных как гены. Грегор Мендель стал пионером в этой области в 1866 году, когда впервые описал законы наследования, которые он наблюдал при скрещивании гороха. Одним из таких законов генетического наследования является закон расщепления, который гласит, что диплоидные организмы с двумя аллелями для определенного гена передают одну из этих аллелей своему потомству. Благодаря его основополагающим работам, изучение генетического наследования обычно называют менделевской генетикой. Важным этапом в молекулярной биологии стало открытие структуры ДНК. Эта работа началась в 1869 году с Фридриха Мишера, швейцарского биохимика, который впервые предложил структуру, названную «нуклеином», которую мы теперь знаем как (дезоксирибонуклеиновая кислота), или ДНК. Он обнаружил это уникальное вещество, изучая компоненты гнойных повязок и отмечая уникальные свойства «веществ, содержащих фосфор». Еще одним значительным участником в создании модели ДНК был Фибус Левен, который в 1919 году предложил «полинуклеотидную модель» ДНК, основываясь на своих биохимических экспериментах с дрожжами. В 1950 году Эрвин Чаргафф развил работы Левена и установил несколько важных свойств нуклеиновых кислот: во-первых, последовательность нуклеиновых кислот различается у разных видов. Во-вторых, общая концентрация пуринов (аденина и гуанина) всегда равна общей концентрации пиримидинов (цитозина и тимина). Это было основано на данных рентгенокристаллографии, полученных Розалинд Франклин и переданных ей Морисом Уилкинсом и Максом Перуцем. Таким образом, генетический код является триплетным, где каждый триплет (называемый кодоном) определяет определенную аминокислоту. Кроме того, было показано, что кодоны не перекрываются в последовательности ДНК, кодирующей белок, и что каждая последовательность считывается с фиксированной точки начала. В период с 1962 по 1964 год, с использованием условно-летальных мутантов бактериального вируса, были достигнуты фундаментальные успехи в понимании функций и взаимодействий белков, участвующих в механизмах репликации ДНК, репарации ДНК, рекомбинации ДНК и сборке молекулярных структур.

Molecular biology sits at the intersection of biochemistry and genetics; as these scientific disciplines emerged and evolved in the 20th century, it became clear that they both sought to determine the molecular mechanisms which underlie vital cellular functions. Advances in molecular biology have been closely related to the development of new technologies and their optimization. Molecular biology has been elucidated by the work of many scientists, and thus the history of the field depends on an understanding of these scientists and their experiments. The field of genetics arose from attempts to understand the set of rules underlying reproduction and heredity, and the nature of the hypothetical units of heredity known as genes. Gregor Mendel pioneered this work in 1866, when he first described the laws of inheritance he observed in his studies of mating crosses in pea plants. One such law of genetic inheritance is the law of segregation, which states that diploid individuals with two alleles for a particular gene will pass one of these alleles to their offspring. Because of his critical work, the study of genetic inheritance is commonly referred to as Mendelian genetics. A major milestone in molecular biology was the discovery of the structure of DNA. This work began in 1869 by Friedrich Miescher, a Swiss biochemist who first proposed a structure called nuclein, which we now know to be (deoxyribonucleic acid), or DNA. He discovered this unique substance by studying the components of pus filled bandages, and noting the unique properties of the "phosphorus containing substances". Another notable contributor to the DNA model was Phoebus Levene, who proposed the "polynucleotide model" of DNA in 1919 as a result of his biochemical experiments on yeast. In 1950, Erwin Chargaff expanded on the work of Levene and elucidated a few critical properties of nucleic acids: first, the sequence of nucleic acids varies across species. Second, the total concentration of purines (adenine and guanine) is always equal to the total concentration of pyrimidines (cysteine and thymine). based on the X ray crystallography work done by Rosalind Franklin which was conveyed to them by Maurice Wilkins and Max Perutz. Thus the genetic code is a triplet code, where each triplet (called a codon) specifies a particular amino acid. Furthermore, it was shown that the codons do not overlap with each other in the DNA sequence encoding a protein, and that each sequence is read from a fixed starting point. During 1962–1964, through the use of conditional lethal mutants of a bacterial virus, fundamental advances were made in our understanding of the functions and interactions of the proteins employed in the machinery of DNA replication, DNA repair, DNA recombination, and in the assembly of molecular structures.

Эксперимент Гриффита

В 1928 году Фредерик Гриффит обнаружил свойство вирулентности у бактерий пневмококка, вызывающее гибель лабораторных крыс. Согласно преобладавшим в то время представлениям Менделя, передача генов могла осуществляться только от родительских клеток к дочерним. Гриффит выдвинул альтернативную теорию, согласно которой передача генов между особями одного поколения известна как горизонтальный перенос генов (HGT). Это явление теперь называется генетической трансформацией. Эксперимент Гриффита был посвящен изучению бактерий пневмококка, существовавших в двух различных штаммах: вирулентном, гладком, и авирулентном, грубом. Гладкий штамм обладал блестящим внешним видом благодаря наличию специфического полисахарида – полимера глюкозы и глюкуроновой кислоты, формирующего капсулу. Благодаря этому полисахаридному слою иммунная система хозяина не распознает бактерию, что приводит к гибели хозяина. Другой, авирулентный, грубый штамм лишен этой полисахаридной капсулы и имеет матовый, шероховатый вид. Наличие или отсутствие капсулы в штамме генетически обусловлено. Гладкие и грубые штаммы представлены несколькими различными типами, такими как S I, S II, S III и т.д. и R I, R II, R III и т.д. соответственно. Все эти подтипы бактерий S и R различаются по типу производимых ими антигенов. Современные молекулярные биологи имеют доступ к все более доступным данным секвенирования, получаемым на все большей глубине, что способствует разработке новых методов генетической манипуляции в немодельных организмах. В свою очередь, специалисты в области синтетической биологии будут стимулировать промышленное производство малых и макромолекул путем введения экзогенных метаболических путей в различные прокариотические и эукариотические клеточные линии. Горизонтальный перенос генов, данные секвенирования становятся все более доступными и широко используются в различных научных областях. Это будет способствовать развитию промышленности в развивающихся странах и расширит возможности для отдельных исследователей. Кроме того, эксперименты по редактированию генов с использованием CRISPR-Cas9 теперь могут быть спланированы и реализованы отдельными исследователями менее чем за 10 000 долларов в новых организмах, что будет стимулировать развитие промышленных и медицинских приложений.

In 1928, Frederick Griffith, encountered a virulence property in pneumococcus bacteria, which was killing lab rats. According to Mendel, prevalent at that time, gene transfer could occur only from parent to daughter cells only. Griffith advanced another theory, stating that gene transfer occurring in member of same generation is known as horizontal gene transfer (HGT). This phenomenon is now referred to as genetic transformation. Griffith's experiment addressed the pneumococcus bacteria, which had two different strains, one virulent and smooth and one avirulent and rough. The smooth strain had glistering appearance owing to the presence of a type of specific polysaccharide – a polymer of glucose and glucuronic acid capsule. Due to this polysaccharide layer of bacteria, a host's immune system cannot recognize the bacteria and it kills the host. The other, avirulent, rough strain lacks this polysaccharide capsule and has a dull, rough appearance. Presence or absence of capsule in the strain, is known to be genetically determined. Smooth and rough strains occur in several different type such as S I, S II, S III, etc. and R I, R II, R III, etc. respectively. All this subtypes of S and R bacteria differ with each other in antigen type they produce. Molecular biologists today have access to increasingly affordable sequencing data at increasingly higher depths, facilitating the development of novel genetic manipulation methods in new non model organisms. Likewise, synthetic molecular biologists will drive the industrial production of small and macro molecules through the introduction of exogenous metabolic pathways in various prokaryotic and eukaryotic cell lines. Horizontally, sequencing data is becoming more affordable and used in many different scientific fields. This will drive the development of industries in developing nations and increase accessibility to individual researchers. Likewise, CRISPR Cas9 gene editing experiments can now be conceived and implemented by individuals for under $10,000 in novel organisms, which will drive the development of industrial and medical applications.

Связь с другими биологическими науками

В следующем списке описывается взгляд на междисциплинарные взаимосвязи между молекулярной биологией и другими смежными областями. Молекулярная биология – это изучение молекулярных основ биологических явлений, с акцентом на молекулярный синтез, модификацию, механизмы и взаимодействия. Биохимия – это наука о химических веществах и жизненно важных процессах, происходящих в живых организмах. Биохимики уделяют большое внимание роли, функции и структуре биомолекул, таких как белки, липиды, углеводы и нуклеиновые кислоты. Генетика – это изучение того, как генетические различия влияют на организмы. Генетика стремится предсказать, как мутации, отдельные гены и генетические взаимодействия могут влиять на проявление фенотипа.

Хотя исследователи используют методы, специфичные для молекулярной биологии, их часто комбинируют с методами генетики и биохимии. Большая часть молекулярной биологии носит количественный характер, и в последнее время значительный объем работы выполняется с использованием методов компьютерных наук, таких как биоинформатика и вычислительная биология. Молекулярная генетика, изучающая структуру и функцию генов, является одной из наиболее значимых областей молекулярной биологии с начала 2000-х годов. Другие отрасли биологии обогащаются молекулярной биологией, либо непосредственно изучая взаимодействия молекул как таковые, например, в клеточной биологии и биологии развития, либо косвенно, когда молекулярные методы используются для установления исторических характеристик популяций или видов, как в областях эволюционной биологии, таких как популяционная генетика и филогенетика. В биофизике также существует давняя традиция изучения биомолекул «с основ» или на молекулярном уровне.

Молекулярное клонирование

Молекулярное клонирование используется для выделения и последующего переноса интересующей последовательности ДНК в плазмидный вектор. Эта технология рекомбинантной ДНК была впервые разработана в 1960-х годах. В этой технике последовательность ДНК, кодирующая интересующий белок, клонируется с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или рестрикционных ферментов в плазмиду (вектор экспрессии). Плазмидный вектор обычно обладает как минимум тремя отличительными особенностями: началом репликации, множественным сайтом клонирования (МСК) и селективным маркером (обычно устойчивостью к антибиотикам). Кроме того, выше по течению от МСК расположены промоторные области и сайт начала транскрипции, которые регулируют экспрессию клонированного гена. Эта плазмида может быть введена в бактериальные или животные клетки. Введение ДНК в бактериальные клетки может осуществляться посредством трансформации путем поглощения свободной ДНК, конъюгации через контакт клеток или трансдукции с использованием вирусного вектора. Введение ДНК в эукариотические клетки, такие как клетки животных, физическими или химическими методами называется трансфекцией. Доступно несколько различных методов трансфекции, таких как трансфекция с использованием фосфата кальция, электропорация, микроинъекция и липосомная трансфекция. Плазмида может быть интегрирована в геном, что приводит к стабильной трансфекции, или может оставаться независимой от генома и временно экспрессироваться, что называется транзиторной трансфекцией. ДНК, кодирующая интересующий белок, теперь находится внутри клетки, и белок может быть экспрессирован. Существует множество систем, таких как индуцируемые промоторы и специфические факторы клеточной сигнализации, для обеспечения экспрессии интересующего белка на высоком уровне. Затем большое количество белка можно извлечь из бактериальной или эукариотической клетки. Белок можно проверить на ферментативную активность в различных условиях, белок можно кристаллизовать для изучения его третичной структуры или, в фармацевтической промышленности, изучить активность новых лекарственных препаратов в отношении белка.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – чрезвычайно универсальный метод копирования ДНК. Вкратце, ПЦР позволяет копировать или модифицировать определенную последовательность ДНК заданным образом. Реакция обладает высокой эффективностью и в идеальных условиях способна амплифицировать одну молекулу ДНК до 1,07 миллиарда молекул менее чем за два часа. ПЦР имеет множество применений, включая изучение экспрессии генов, обнаружение патогенных микроорганизмов, выявление генетических мутаций и внесение мутаций в ДНК. С помощью метода ПЦР можно вводить сайты рестрикционных ферментов в концы молекул ДНК или мутировать отдельные основания ДНК; последний метод известен как сайт-направленный мутагенез. ПЦР также может использоваться для определения наличия определенного фрагмента ДНК в библиотеке кДНК. Существует множество вариантов ПЦР, таких как обратная транскрипция ПЦР (ОТ-ПЦР) для амплификации РНК и, более недавно, количественная ПЦР, позволяющая проводить количественное измерение молекул ДНК или РНК.

Гелевой электрофорез

Гелевый электрофорез — это метод разделения молекул по размеру с использованием геля агарозы или полиакриламида. Этот метод является одним из основных инструментов молекулярной биологии. Основной принцип заключается в том, что фрагменты ДНК можно разделить, пропуская электрический ток через гель: поскольку в составе цепи ДНК содержатся отрицательно заряженные фосфатные группы, ДНК будет мигрировать через гель агарозы к положительному полюсу.

Бредфордский анализ белка

Брэдфордский анализ — это метод молекулярной биологии, позволяющий быстро и точно количественно определять белковые молекулы, используя уникальные свойства красителя под названием Coomassie Brilliant Blue G 250. При связывании с белком краситель Coomassie Blue претерпевает видимое изменение цвета от красновато-коричневого до ярко-синего. Когда Coomassie Blue связывается с белком в кислой среде, длина волны поглощения смещается до 595 нм, и краситель приобретает ярко-синий цвет.

Южный блот

Названный в честь его изобретателя, биолога Эдвина Саузерна, метод Саузерн-блоттинга (или южный блот) – это метод для выявления наличия определенной последовательности ДНК в образце ДНК. Образцы ДНК до или после обработки рестрикционным ферментом (рестрикционной эндонуклеазой) разделяют с помощью гелевого электрофореза, а затем переносят на мембрану методом блоттинга, основанном на капиллярном действии. Затем мембрану подвергают воздействию меченого ДНК-зонда, комплементарного последовательности ДНК, которую необходимо обнаружить. В лабораторных исследованиях метод Саузерн-блоттинга используется реже, чем другие методы, такие как ПЦР, позволяющие выявлять специфические последовательности ДНК в образцах ДНК. Тем не менее, он все еще применяется в некоторых случаях, например, для определения количества копий трансгена у трансгенных мышей или при создании линий эмбриональных стволовых клеток с нокаутированными генами.

Западный блот

Вестерн-блот – это метод, позволяющий обнаруживать специфические белки в смеси белков. В вестерн-блоттинге белки сначала разделяют по размеру в тонком геле, помещенном между двумя стеклянными пластинами с использованием метода, известного как SDS-PAGE. Затем белки из геля переносят на поливинилиденфторид (PVDF), нитроцеллюлозу, нейлон или другую поддерживающую мембрану. Эту мембрану затем обрабатывают растворами антител. Антитела, специфически связывающиеся с интересующим белком, могут быть визуализированы различными методами, включая окрашенные продукты, хемилюминесценцию или авторадиографию. Часто антитела мечены ферментами. При воздействии хемилюминесцентного субстрата на фермент становится возможным его обнаружение. Методы вестерн-блоттинга позволяют не только обнаруживать, но и проводить количественный анализ. Аналогичные методы могут быть использованы для непосредственного окрашивания специфических белков в живых клетках или срезах тканей.

Восточная блоттировка

Метод вестерн-блоттинга используется для обнаружения посттрансляционных модификаций белков. Белки, перенесенные на ПВДФ- или нитроцеллюлозную мембрану, исследуются на наличие модификаций с помощью специфических субстратов.

Микромассивы

Микромассив ДНК представляет собой набор зон, закрепленных на твердой подложке, такой как предметное стекло микроскопа, где каждая зона содержит один или несколько одноцепочечных олигонуклеотидных фрагментов ДНК. Массивы позволяют наносить большое количество очень маленьких зон (диаметром 100 микрометров) на одно предметное стекло. Каждая зона содержит молекулу ДНК-фрагмента, комплементарную определенной последовательности ДНК. Разновидность этой методики позволяет оценить экспрессию генов организма на конкретной стадии развития (профилирование экспрессии). В этой методике РНК из ткани изолируется и преобразуется в меченую комплементарную ДНК (кДНК). Затем эта кДНК гибридизуется с фрагментами на массиве, и визуализация гибридизации становится возможной. Поскольку можно изготовить множество массивов с абсолютно идентичным расположением фрагментов, они особенно полезны для сравнения экспрессии генов в двух различных тканях, например, здоровой и раковой. Кроме того, можно определить, какие гены экспрессируются и как меняется их экспрессия со временем или под воздействием других факторов. Существует множество различных способов создания микромассивов; наиболее распространенными являются кремниевые чипы, предметные стекла микроскопа с зонами диаметром около 100 микрометров, индивидуальные массивы и массивы с более крупными зонами на пористых мембранах (макромассивы). Количество зон на одном массиве может варьироваться от 100 до более чем 10 000. Массивы также могут быть созданы с использованием молекул, отличных от ДНК.

Аллелоспецифический олигонуклеотид

Аллелеспецифический олигонуклеотид (АСО) – это методика, позволяющая обнаруживать мутации в одном нуклеотиде без использования ПЦР или гелевого электрофореза. Короткие (длиной 20–25 нуклеотидов), меченые зонды подвергаются воздействию нефрагментированной целевой ДНК, гибридизация происходит с высокой специфичностью благодаря короткой длине зондов, и даже однонуклеотидная замена препятствует гибридизации. Затем целевую ДНК промывают, удаляя меченые зонды, которые не гибридизовались. После этого целевую ДНК анализируют на наличие зонда с помощью радиоактивности или флуоресценции. В этом эксперименте, как и в большинстве методов молекулярной биологии, необходимо использовать контрольную выборку для обеспечения достоверности результатов. В молекулярной биологии процедуры и технологии постоянно развиваются, а устаревшие методы отходят в прошлое. Например, до появления электрофореза ДНК в геле (агарозном или полиакриламидном) размер молекул ДНК обычно определяли по скорости седиментации в градиентах сахарозы – медленной и трудоемкой методике, требующей дорогостоящего оборудования; ранее градиентов сахарозы использовалась вискометрия. Помимо исторической ценности, знание устаревших технологий может быть полезным для решения новых задач, для которых современные методы не подходят.