Введение
Органический краситель, используемый в биохимии Акридин оранжевый - это органическое соединение, которое служит селективным флуоресцентным красителем нуклеиновой кислоты с катионными свойствами, полезными для определения клеточного цикла. Акридин оранжевый проницаем клеток, что позволяет красителю взаимодействовать с ДНК путем интеркалации или РНК через электростатические притяжения. Когда акридин оранжевый связывается с ДНК, он очень похож по спектральности на органическое соединение, известное как флуоресцеин. Максимальное возбуждение акридина оранжевого цвета и флуоресцеина достигается при 502 и 525 нм (зеленый). Когда акридин оранжевый ассоциируется с РНК, флуоресцентный краситель испытывает максимальное смещение возбуждения от 525 нм (зеленый) до 460 нм (синий). Сдвиг в максимальном возбуждении также производит максимальное излучение 650 нм (красный). Акридин оранжевый способен выдерживать низкие pH, что позволяет флуоресцентному красителю проникать в кислотные органеллы, такие как лизосомы и фаголизосомы, которые являются мембранными органеллами, необходимыми для кислотного гидролиза или для получения продуктов фагоцитоза апоптотических клеток. Акридин апельсин используется в эпифлюоресцентной микроскопии и поточной цитометрии. Способность проникать в клеточные мембраны кислотных органелл и катионовые свойства акридина позволяют красителю различать различные типы клеток (например, бактериальные клетки и белые кровяные клетки). Сдвиг в максимальной длине волны возбуждения и излучения обеспечивает основу для прогнозирования длины волны, при которой клетки будут окрашиваться.
Acridine orange is an organic compound that serves as a nucleic acid selective fluorescent dye with cationic properties useful for cell cycle determination. Acridine orange is cell permeable, which allows the dye to interact with DNA by intercalation, or RNA via electrostatic attractions. When bound to DNA, acridine orange is very similar spectrally to an organic compound known as fluorescein. Acridine orange and fluorescein have a maximum excitation at 502nm and 525 nm (green). When acridine orange associates with RNA, the fluorescent dye experiences a maximum excitation shift from 525 nm (green) to 460 nm (blue). The shift in maximum excitation also produces a maximum emission of 650 nm (red). Acridine orange is able to withstand low pH environments, allowing the fluorescent dye to penetrate acidic organelles such as lysosomes and phagolysosomes that are membrane bound organelles essential for acid hydrolysis or for producing products of phagocytosis of apoptotic cells. Acridine orange is used in epifluorescence microscopy and flow cytometry. The ability to penetrate the cell membranes of acidic organelles and cationic properties of acridine orange allows the dye to differentiate between various types of cells (i. e., bacterial cells and white blood cells). The shift in maximum excitation and emission wavelengths provides a foundation to predict the wavelength at which the cells will stain.
Оптические свойства
Когда рН окружающей среды равен 3,5, акридин оранжевый возбуждается синим светом (460 нм). Когда акридин оранжевый возбуждается синим светом, флуоресцентный краситель может дифференциально окрашивать клетки человека в зеленый цвет и клетки прокариотов в оранжевый (600 нм), что позволяет быстро обнаружить их с помощью флуоресцентного микроскопа. Дифференциальная способность окрашивания акридинового оранжевого цвета обеспечивает быстрое сканирование мазков образцов при более низких увеличениях 400x по сравнению с грамовыми пятнами, которые работают при увеличении в 1000x. Дифференциации клеток способствует темный фон, который позволяет легко обнаружить цветные организмы. Резкий контраст обеспечивает механизм подсчета количества организмов, присутствующих в образце. Когда акридин оранжевый связывается с ДНК, краситель проявляет максимальное возбуждение при 502 нм, производя максимальное излучение 525 нм. При связке с РНК акридин оранжевый показывает максимальное значение эмиссии 650 нм и максимальное значение возбуждения 460 нм. Максимальное возбуждение и значение эмиссии, которые возникают, когда акридин апельсин связывается с РНК, являются результатом электростатических взаимодействий и интеркалации между молекулой акридина и базовыми парами нуклеиновых кислот, присутствующими в РНК и ДНК.
Подготовка
Акридиновые красители получают путем конденсации 1,3 диаминобензола с подходящими бензальдегидами. Акридин апельсин получают из диметиламинобензальдегида и N,N диметил-1,3-диаминобензола. Он также может быть получен реакцией Эшвейлера-Кларка 3,6 акридидидиамина.
История
Акридин апельсин происходит от органической молекулы акридина, которая была впервые обнаружена Карлом Грабе и Генрихом Каро, которые изолировали акридин путем кипения угля в Германии в конце девятнадцатого века. Акридин обладает антимикробными факторами, полезными для устойчивых к лекарственным средствам бактерий и изоляции бактерий в различных средах. Акридин апельсин в середине двадцатого века использовался для изучения содержания микробов, обнаруженных в почве и прямых подсчетов водных бактерий. Кроме того, метод прямого подсчета акридина оранжевого цвета (AODC) оказался полезным при перечислении бактерий, обнаруженных на свалках. Метод прямого эпифлюоресцентного фильтра (DEFT) с использованием акридинового оранжевого цвета является известным методом исследования содержания микробов в пищевых продуктах и воде. Использование акридин-оранжевого в клинических приложениях стало широко распространенным, в основном с акцентом на выделение бактерий в культурах крови. Прошлые и нынешние исследования, сравнивающие окрашивание акридиновым оранжевым цветом с слепыми субкультурами для обнаружения положительных кровяных культур, показали, что окрашивание акридиновым оранжевым цветом является простой, недорогой, быстрой процедурой окрашивания, которая, по-видимому, более чувствительна, чем окрашивание граммовым цветом для обнаружения микроорганизмов в спинномозговой жидкости и других клинических и неклинических материалах. и клеточного содержания ДНК против РНК в отдельных клетках, или обнаружить повреждение ДНК в бесплодных клетках спермы. Acridine orange рекомендуется для использования для флуоресцентного микроскопического обнаружения микроорганизмов в мазках, подготовленных из клинических и неклинических материалов. Окрашивание акридиновым оранжевым цветом должно производиться при кислом pH для получения дифференциального окрашивания, которое позволяет бактериальным клеткам окрашивать оранжевым цветом, а компонентам тканей - желтым или зеленым. Акридин также используется для окрашивания кислотных вакуолов (лизосомы, эндосомы и аутофагосомы), РНК и ДНК в живых клетках. Этот метод является дешевым и простым способом изучения лизосомной вакуоляции, аутофагии и апоптоза. Цвет выброса акридина оранжевый меняется от желтого, оранжевого, до красного по мере снижения рН в кислотной вакуоле живой клетки. При определенных условиях ионной прочности и концентрации акридин оранжевый излучает красную флуоресценцию, когда связывается с РНК путем взаимодействия склеивания, и зеленую флуоресценцию, когда связывается с ДНК путем интеркалации. В зависимости от концентрации акридина оранжевого цвета, ядра могут излучать желтовато-зеленую флуоресценцию в необработанных клетках, а также зеленую флуоресценцию, когда синтез РНК ингибируется соединениями, такими как хлорохин. Акридин апельсин может использоваться в сочетании с бромидом этидия или йодидом пропидия для дифференцирования жизнеспособных, апоптотических и некротических клеток. Кроме того, акридин апельсин может использоваться для образцов крови, вызывающих флуоресценцию бактериальной ДНК, что помогает в клинической диагностике бактериальных инфекций, таких как менингит.