Электрофизиологиядағы патч-кламп әдісі – жеке жасушалардағы иондық тоқтарды зерттеуге арналған зертханалық техника. Нейрондар, жүрек бұлшықтары үшін өте пайдалы.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Электрофизиологиядағы зертханалық техника
Laboratory technique in electrophysiology
Пэтч-кламп техникасы – электрофизиологиядағы зертханалық техника, жеке оқшауланған тірі жасушалардағы, тіндер кесінділеріндегі немесе жасуша мембранасының бөліктеріндегі иондық тоқтарды зерттеу үшін қолданылады. Бұл техника, әсіресе, нейрондар, кардиомиоциттер, бұлшық ет талшықтары және панкреатикалық бета-жасушалар сияқты қозуға қабілетті жасушаларды зерттеуде өте пайдалы, сондай-ақ, арнайы дайындалған алып сферопластардағы бактериялық иондық каналдарды зерттеуге де қолданылуы мүмкін. Пэтч-клампты кернеуді ұстау (voltage clamp) техникасымен жүргізуге болады. Бұл жағдайда жасуша мембранасының кернеуін тәжірибеші басқарады және нәтижесіндегі тоқтар тіркеледі. Балама ретінде, ток ұстау (current clamp) техникасын қолдануға болады. Бұл жағдайда мембрана арқылы өтетін тоқ тәжірибеші бақылайды және кернеудегі болатын өзгерістер, әдетте, әрекет потенциалы түрінде тіркеледі. Эрвин Нехер мен Берт Сакманн пэтч-клампты 1970 жылдардың соңы мен 1980 жылдардың басында жасады. Бұл жаңалық алғаш рет жеке иондық канал молекулаларының тоғын тіркеуге мүмкіндік берді, бұл әрекет потенциалы және жүйке белсенділігі сияқты жасушаның негізгі процестеріне каналдардың қатысуын жақсырақ түсінуге көмектесті. Нехер мен Сакманн осы еңбегі үшін 1991 жылы физиология және медицина саласындағы Нобель сыйлығын алды.
The patch clamp technique is a laboratory technique in electrophysiology used to study ionic currents in individual isolated living cells, tissue sections, or patches of cell membrane. The technique is especially useful in the study of excitable cells such as neurons, cardiomyocytes, muscle fibers, and pancreatic beta cells, and can also be applied to the study of bacterial ion channels in specially prepared giant spheroplasts. Patch clamping can be performed using the voltage clamp technique. In this case, the voltage across the cell membrane is controlled by the experimenter and the resulting currents are recorded. Alternatively, the current clamp technique can be used. In this case, the current passing across the membrane is controlled by the experimenter and the resulting changes in voltage are recorded, generally in the form of action potentials. Erwin Neher and Bert Sakmann developed the patch clamp in the late 1970s and early 1980s. This discovery made it possible to record the currents of single ion channel molecules for the first time, which improved understanding of the involvement of channels in fundamental cell processes such as action potentials and nerve activity. Neher and Sakmann received the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1991 for this work.
Құрастыру
Патч-кламп жазу кезінде электролит ерітіндісімен толтырылған, микропипетка немесе патч-пипетка деп аталатын қуыс шыны түтік және күшейткішке қосылған жазу электроды, оқшауланған жасушаның мембранасымен жанасады. Тағы бір электрод жасуша немесе тінді қоршаған ваннаға, салыстырмалы жерге қойылады. Жазу және салыстырмалы электродтар арасында, олардың арасында зерттелетін жасуша орналасқанда, электрлік тізбек құрылуы мүмкін. Патч-пипетканы толтырған ерітінді, жасушаға тікелей қосылған жазу кезінде ванна ерітіндісінің иондық құрамымен немесе, толық жасуша жазу кезінде цитоплазмамен сәйкес болуы мүмкін. Ванна ерітіндісі физиологиялық жасушадан тыс ерітіндіге, цитоплазмаға сәйкес келуі немесе жүргізілетін экспериментке байланысты мүлдем физиологиялық емес болуы мүмкін. Зерттеуші ванна ерітіндісінің (немесе сирек жағдайларда пипетка ерітіндісінің) құрамын иондар немесе дәрілер қосу арқылы өзгерте алады, бұл иондық каналдарды әртүрлі жағдайларда зерттеуге мүмкіндік береді. Зерттеушінің өлшеуге тырысатын нәрсесіне байланысты, қолданылатын пипетка ұшының диаметрі өзгеруі мүмкін, бірақ әдетте ол микрометр диапазонында болады. Бұл кішкентай өлшем жасуша мембранасының бетін немесе "жапсырманы" жабу үшін қолданылады, онда көбінесе бір немесе бірнеше иондық канал молекулалары болады. Бұл электрод түрі дәстүрлі ішкі жасушалық жазбаларда жасушаларды тесу үшін қолданылатын "ұштас микроэлектродтан" өзгеше, себебі ол жасуша мембранасының бетіне жабысады, оған енгізілмейді. Кейбір эксперименттерде микропипетка ұшы микроқосқышта қыздырылып, жасуша мембранасымен жоғары кедергілі байланыс құруға көмектесетін тегіс бетке ие болады. Бұл жоғары кедергілі байланысты алу үшін микропипетка жасуша мембранасына қысылады және сору қолданылады. Жасуша мембранасының бір бөлігі пипеткаға сорылып кіреді, дұрыс қалыптасқан жағдайда 10–100 гигаом диапазонында кедергі тудыратын омега пішіндес мембраналық аймақ пайда болады, бұл "гигаомдық мөр" немесе "гигазеал" деп аталады.
During a patch clamp recording, a hollow glass tube known as a micropipette or patch pipette filled with an electrolyte solution and a recording electrode connected to an amplifier is brought into contact with the membrane of an isolated cell. Another electrode is placed in a bath surrounding the cell or tissue as a reference ground electrode. An electrical circuit can be formed between the recording and reference electrode with the cell of interest in between. The solution filling the patch pipette might match the ionic composition of the bath solution, as in the case of cell attached recording, or match the cytoplasm, for whole cell recording. The solution in the bath solution may match the physiological extracellular solution, the cytoplasm, or be entirely non physiological, depending on the experiment to be performed. The researcher can also change the content of the bath solution (or less commonly the pipette solution) by adding ions or drugs to study the ion channels under different conditions. Depending on what the researcher is trying to measure, the diameter of the pipette tip used may vary, but it is usually in the micrometer range. This small size is used to enclose a cell membrane surface area or "patch" that often contains just one or a few ion channel molecules. This type of electrode is distinct from the "sharp microelectrode" used to puncture cells in traditional intracellular recordings, in that it is sealed onto the surface of the cell membrane, rather than inserted through it. In some experiments, the micropipette tip is heated in a microforge to produce a smooth surface that assists in forming a high resistance seal with the cell membrane. To obtain this high resistance seal, the micropipette is pressed against a cell membrane and suction is applied. A portion of the cell membrane is suctioned into the pipette, creating an omega shaped area of membrane which, if formed properly, creates a resistance in the 10–100 gigaohms range, called a "gigaohm seal" or "gigaseal".
Жазу
Көптеген патч-жапсырмалы күшейткіштер нақты кернеуді ұстау тізбектерін қолданбайды, бірақ олар дифференциалдық күшейткіштер болып табылады, олар ванна электродын нөлдік ток (жер) деңгейін орнату үшін пайдаланады. Бұл зерттеушіге токтың өзгеруін бақылап, кернеуді тұрақты ұстауға мүмкіндік береді. Мұндай жазбалар жасау үшін, патч пипеткасы жерге қосылған электродпен салыстырылады. Содан кейін жүйеге тұрақты, белгіленген кернеуді сақтау үшін ток жіберіледі. Кернеуді ұстап тұруға қажетті ток, мембрана арқылы өтетін токқа қарама-қарсы және оның шамасына тең болады.
Many patch clamp amplifiers do not use true voltage clamp circuitry, but instead are differential amplifiers that use the bath electrode to set the zero current (ground) level. This allows a researcher to keep the voltage constant while observing changes in current. To make these recordings, the patch pipette is compared to the ground electrode. Current is then injected into the system to maintain a constant, set voltage. The current that is needed to clamp the voltage is opposite in sign and equal in magnitude to the current through the membrane.
Вариациялар
Зерттеушінің не зерттеуге ниеттенгеніне байланысты негізгі техниканың бірнеше нұсқасын қолдануға болады. Іштен сыртқа және сырттан ішке қарайтын техникалар "қырқылған жапсырма" техникалары деп аталады, себебі жапсырма жасушаның негізгі бөлігінен қырқылып алынады (жойылады). Электродқа жабысқан мембрана бөлігіндегі жеке иондық каналдардың қызметін зерттеу үшін жасушаға тіркеу және қырқылған жапсырма техникалары қолданылады. Бүкіл жасушалық жапсырма және тесілген жапсырма зерттеушіге жеке каналдық тоқтардың орнына бүкіл жасушаның электрлік қасиеттерін зерттеуге мүмкіндік береді. Жасушаның ішкі жағына төмен кедергілі электрлік қолжетімділікті қамтамасыз ететін бүкіл жасушалық жапсырма қазір бүкіл жасуша мембранасы арқылы тоқтарды тіркеу үшін жоғары кедергілі микроэлектродты тіркеу техникаларын көбінесе алмастырды.
Several variations of the basic technique can be applied, depending on what the researcher wants to study. The inside out and outside out techniques are called "excised patch" techniques, because the patch is excised (removed) from the main body of the cell. Cell attached and both excised patch techniques are used to study the behavior of individual ion channels in the section of membrane attached to the electrode. Whole cell patch and perforated patch allow the researcher to study the electrical behavior of the entire cell, instead of single channel currents. The whole cell patch, which enables low resistance electrical access to the inside of a cell, has now largely replaced high resistance microelectrode recording techniques to record currents across the entire cell membrane.
Ұяшыққа бекітілген жапсырма
Бұл әдіс үшін пипетка жасуша мембранасына гигазея (гигаомдық электрлік кедергісі бар мөр) алу үшін тығыздалады, сонымен бірге жасуша мембранасының бұзылмауын қамтамасыз етеді. Бұл пипеткамен ұсталған мембрана бөлігінде орналасқан бір немесе бірнеше иондық арналар арқылы токтарды тіркеуге мүмкіндік береді. Жасуша мембранасының сыртқы бетіне ғана жабысу арқасында жасуша құрылымына минималды әсер етеді. Бұл әдіс дұрыс конфигурацияны оңай алуға және алғаннан кейін оның тұрақты болуына мүмкіндік береді. Лигандтармен ашылатын иондық арналар немесе метаботроптық рецепторлармен модуляцияланатын арналар үшін зертене жатқан нейротрансмиттер немесе препарат әдетте пипетка ерітіндісіне қосылады, онда ол мембрананың бұрынғы сыртқы бетімен өзара әрекеттесе алады. Пайда болған арна белсенділігі қолданылған препараттың нәтижесі болуы мүмкін, бірақ пипетка ішіндегі препараттың концентрациясын өзгерту мүмкін емес. Сондықтан, бұл әдіс әрбір жапсырма үшін доза-жауап қисығының тек бір нүктесімен ғана шектеледі. Дозаға жауапты анықтау үшін бірнеше жасушалар мен жапсырмалар қолданылады. Дегенмен, кернеуге сезімтал иондық арналарды бір жапсырмада әртүрлі мембраналық потенциалдарда тізбектей бекітуге болады. Бұл кернеуге байланысты арнаның белсенділігіне әкеледі және толық I-V (ток-кернеу) қисығын тек бір жапсырмада құруға болады. Бұл әдістің тағы бір кемшілігі – жасушаның ішкі жолдары бұзылмағандықтан, оларды тікелей өзгертуге де болмайды. Бұл әдістің артықшылығы – тәжірибеші ванна арқылы мембрананың жасушаішілік бетіне қол жеткізе алады және мембрананың ішкі бетіне әсер ететін химиялық құрамды өзгерте алады. Бұл тәжірибеші бір иондық арналардың жасушаішілік ортасын өзгертуді қалағанда пайдалы. Мысалы, жасушаішілік лигандтармен белсендірілетін арналарды лиганд концентрациясының әртүрлі диапазонында зерттеуге болады. Ішкі-сыртқа конфигурацияны алу үшін пипетка жасуша мембранасына жасушаға бекітілген режимдегідей, гигазея құрып, содан кейін мембрананың қалған бөлігінен жапсырманы жұлып алу үшін кері тартылады. Мембраналық жапсырманы жұлып алу көбінесе пипетка ұшында мембраналық көпіршік пайда болуына себеп болады, өйткені жапсырма мембранасының шеттері экзициядан кейін жылдам бірігеді. Сыртқы бетін ашу үшін ваннадағы ерітінді/ауа интерфейсі арқылы қысқа уақытқа өткізу, төмен Ca2+ ерітіндісіне ұшырату немесе парафин тамшысымен немесе емделген силикон полимерінің бөлігімен уақытша жанасу арқылы ішкі-сыртқа режимге енуге болады.
For this method, the pipette is sealed onto the cell membrane to obtain a gigaseal (a seal with electrical resistance on the order of a gigaohm), while ensuring that the cell membrane remains intact. This allows the recording of currents through single, or a few, ion channels contained in the patch of membrane captured by the pipette. By only attaching to the exterior of the cell membrane, there is very little disturbance of the cell structure. Using this method it is also relatively easy to obtain the right configuration, and once obtained it is fairly stable. For ligand gated ion channels or channels that are modulated by metabotropic receptors, the neurotransmitter or drug being studied is usually included in the pipette solution, where it can interact with what used to be the external surface of the membrane. The resulting channel activity can be attributed to the drug being used, although it is usually not possible to then change the drug concentration inside the pipette. The technique is thus limited to one point in a dose response curve per patch. Therefore, the dose response is accomplished using several cells and patches. However, voltage gated ion channels can be clamped successively at different membrane potentials in a single patch. This results in channel activation as a function of voltage, and a complete I V (current voltage) curve can be established in only one patch. Another potential drawback of this technique is that, just as the intracellular pathways of the cell are not disturbed, they cannot be directly modified either. One advantage of this method is that the experimenter has access to the intracellular surface of the membrane via the bath and can change the chemical composition of what the inside surface of the membrane is exposed to. This is useful when an experimenter wishes to manipulate the environment at the intracellular surface of single ion channels. For example, channels that are activated by intracellular ligands can then be studied through a range of ligand concentrations. To achieve the inside out configuration, the pipette is attached to the cell membrane as in the cell attached mode, forming a gigaseal, and is then retracted to break off a patch of membrane from the rest of the cell. Pulling off a membrane patch often results initially in the formation of a vesicle of membrane in the pipette tip, because the ends of the patch membrane fuse together quickly after excision. The outer face of the vesicle must then be broken open to enter into inside out mode; this may be done by briefly taking the membrane through the bath solution/air interface, by exposure to a low Ca2+ solution, or by momentarily making contact with a droplet of paraffin or a piece of cured silicone polymer.
Бүкіл жасушалық жазу немесе бүкіл жасушалық жапсырма
Толық жасушалық жазулар жасушалық мембрананың кең аумағында бірнеше арналар арқылы токты бір мезгілде жазуды қамтиды. Электрод жасушаға тіркелген жазулардағыдай жасушада қалады, бірақ мембраналық жапсырманы жырту үшін күштірек сору қолданылады, осылайша пипетка ішіндегі ортадан жасушаның ішкі кеңістігіне қол жеткізіледі. Бұл емдеулердің (мысалы, дәрілердің) жасушаларға нақты уақытта қалай әсер ететінін зерттеуге мүмкіндік береді. Пипетка жасуша мембранасына бекітілгеннен кейін жапсырманы бұзудың екі тәсілі бар. Біріншісі – күштірек сору. Бұл сорудың мөлшері мен ұзақтығы жасуша түріне және пипетканың өлшеміне байланысты. Екінші тәсіл пипетка арқылы үлкен ток импульсын жіберуді қажет етеді. Қолданылатын ток мөлшері мен импульстың ұзақтығы да жасуша түріне байланысты. Сыртқы жапсырма экспериментшіге иондық арнаның қасиеттерін жасушадан оқшауланғанда және мембрананың жасушадан тыс бетіндегі әртүрлі ерітінділерге кезегі түрде ұшыратылғанда зерттеу мүмкіндігін береді. Экспериментші салыстырмалы түрде қысқа уақытта бір жапсырманы әртүрлі ерітінділермен шаюы мүмкін, ал егер арна жасушадан тыс беттен нейротрансмиттер немесе дәрімен белсендірілсе, доза-жауап қисығын алуға болады. Мембрананың дәл бір бөлігі арқылы әртүрлі ерітінділерде токты өлшеу мүмкіндігі – сыртқы жапсырманың жасушаға тіркелген әдіске қарағанда айқын артықшылығы. Дегенмен, оны жүзеге асыру қиын. Ұзаққа созылған қалыптасу процесі сәтсіз аяқталуы мүмкін қадамдарды қамтиды және пайдалануға жарамды жапсырмалардың жиілігін төмендетеді.
Whole cell recordings involve recording currents through multiple channels simultaneously, over a large region of the cell membrane. The electrode is left in place on the cell, as in cell attached recordings, but more suction is applied to rupture the membrane patch, thus providing access from the interior of the pipette to the intracellular space of the cell. This provides a means to administer and study how treatments (e. g. drugs) can affect cells in real time. Once the pipette is attached to the cell membrane, there are two methods of breaking the patch. The first is by applying more suction. The amount and duration of this suction depends on the type of cell and size of the pipette. The other method requires a large current pulse to be sent through the pipette. How much current is applied and the duration of the pulse also depend on the type of cell. Outside out patching gives the experimenter the opportunity to examine the properties of an ion channel when it is isolated from the cell and exposed successively to different solutions on the extracellular surface of the membrane. The experimenter can perfuse the same patch with a variety of solutions in a relatively short amount of time, and if the channel is activated by a neurotransmitter or drug from the extracellular face, a dose response curve can then be obtained. This ability to measure current through exactly the same piece of membrane in different solutions is the distinct advantage of the outside out patch relative to the cell attached method. On the other hand, it is more difficult to accomplish. The longer formation process involves more steps that could fail and results in a lower frequency of usable patches.
Перфорацияланған пластырь
Бұл патч-кламп әдісінің нұсқасы бүкіл жасуша конфигурациясына өте ұқсас. Басты айырмашылық сол жерде, тәжірибеші гигаомдық тығыздықты қалыптастырған кезде, патч-мембрананы жару үшін сору қолданылмайды. Оның орнына электрод ерітіндісінде амфотерицин B, нистатин немесе грамицидин сияқты антифунгальдық немесе антибиотиктердің шағын мөлшері болады, олар мембраналық патчке таралып, мембранада кішкентай тесіктер жасайды, бұл жасушаның ішкі бөлігіне электрлік қол жеткізуді қамтамасыз етеді. Кемшіліктерінің бірі – электрод ұшын жабатын мембрананың ішінара болуына байланысты, бүкіл жасушаға қарағанда кіру кедергісінің жоғары болуы. Бұл ток ажыратымдылығын төмендетіп, жазу шуын арттыруы мүмкін. Сондай-ақ, антибиотик мембрананы тесуіне едәуір уақыт кетіп, амфотерицин B үшін шамамен 15 минут, ал грамицидин мен нистатин үшін одан да көп уақыт қажет болуы мүмкін. Антибиотик жасаған тесіктерден электрод ұшының астындағы мембрана әлсіреп, жарылуы мүмкін. Егер патч жарылса, жазу бүкіл жасуша режимінде болады, соның салдарынан антибиотик жасушаның ішін ластауы мүмкін. Бұл әдіс 1982 жылы Алмерс, Стэнфилд және Стюмерлер қайта қарап, атау бергенге дейін көп назар алмады. Басты кемшілігі – пипетка мен мембрана арасындағы кедергінің күрт төмендеуі, бұл ток тығыздықтың өтуіне және кішкентай токтардың ажыратымдылығын айтарлықтай төмендетуіне мүмкіндік береді. Алайда, бұл кемшілікті ішінара түзетуге болады, бұл қызығушылық жасушаның әртүрлі аймақтарынан алынған жазбаларды салыстыруға және қарама-қарсы қоюға мүмкіндік береді. Осыған байланысты, еркін патч техникасы 1 мА/см2-ден кіші токтарды анықтай алады деп есептеледі.
This variation of the patch clamp method is very similar to the whole cell configuration. The main difference lies in the fact that when the experimenter forms the gigaohm seal, suction is not used to rupture the patch membrane. Instead, the electrode solution contains small amounts of an antifungal or antibiotic agent, such as amphothericin B, nystatin, or gramicidin, which diffuses into the membrane patch and forms small pores in the membrane, providing electrical access to the cell interior. Disadvantages include a higher access resistance, relative to whole cell, due to the partial membrane occupying the tip of the electrode. This may decrease current resolution and increase recording noise. It can also take a significant amount of time for the antibiotic to perforate the membrane (about 15 minutes for amphothericin B, and even longer for gramicidin and nystatin). The membrane under the electrode tip is weakened by the perforations formed by the antibiotic and can rupture. If the patch ruptures, the recording is then in whole cell mode, with antibiotic contaminating the inside of the cell. but received little attention until being brought up again and given a name by Almers, Stanfield, and Stühmer in 1982, A major disadvantage is that the resistance between the pipette and the membrane is greatly reduced, allowing current to leak through the seal, and significantly reducing the resolution of small currents. This leakage can be partially corrected for, however, which offers the opportunity to compare and contrast recordings made from different areas on the cell of interest. Given this, it has been estimated that the loose patch technique can resolve currents smaller than 1 mA/cm2.
Patch-Seq
Бұл әдіс жасушалық бейнелеу, РНК тізбектеу және патч-клемптің үйлесімі арқылы нейрондарды бірнеше тәсілмен толық сипаттауға мүмкіндік береді. Нейрондық тіндер – транскриптомдық тұрғыдан ең әртүрлі клеткалардың бірі болғандықтан, нейрондарды олар құрайтын тізбектерді түсіну үшін клетка түрлеріне жіктеу нейробиологтар үшін маңызды міндет болып табылады. Классикалық жіктеу әдістерін бір клеткалық РНК тізбектеу деректерімен біріктіру қиын және уақытты көп алады. Электрофизиология, тізбектеу және микроскопия сияқты әртүрлі деректерді біріктіру арқылы Patch-seq нейрондарды бір уақытта бірнеше жолмен сипаттауға мүмкіндік береді. Қазіргі уақытта бұл әдіс, негізінен нейронға сәтті патч-клемп қою үшін қолмен жұмыс істеу қажет болғандықтан, басқа тізбектеу әдістерімен салыстырғанда төмен өнімділікке ие. Патч-клемп технологиясын автоматтандыру жөніндегі зерттеулер жүргізілуде, бұл Patch-seq өнімділігін де арттырады.
A combination of cellular imaging, RNA sequencing and patch clamp this method is used to fully characterize neurons across multiple modalities. As neural tissues are one of the most transcriptomically diverse populations of cells, classifying neurons into cell types in order to understand the circuits they form is a major challenge for neuroscientists. Combining classical classification methods with single cell RNA sequencing post hoc has proved to be difficult and slow. By combining multiple data modalities such as electrophysiology, sequencing and microscopy, Patch seq allows for neurons to be characterized in multiple ways simultaneously. It currently suffers from low throughput relative to other sequencing methods mainly due to the manual labor involved in achieving a successful patch clamp recording on a neuron. Investigations are currently underway to automate patch clamp technology which will improve the throughput of patch seq as well.