Метод патч-клэмпа в электрофизиологии

Введение

Лабораторная техника в электрофизиологии

Метод патч-клампа – это лабораторная техника в электрофизиологии, используемая для изучения ионных токов в отдельных изолированных живых клетках, срезах тканей или участках клеточной мембраны. Метод особенно полезен при изучении возбудимых клеток, таких как нейроны, кардиомиоциты, мышечные волокна и бета-клетки поджелудочной железы, и также может применяться для изучения бактериальных ионных каналов в специально подготовленных гигантских сферопластах. Патч-клампинг может выполняться с использованием техники фиксации напряжения. В этом случае напряжение на клеточной мембране контролируется экспериментатором, а возникающие токи регистрируются. Альтернативно, может использоваться техника фиксации тока. В этом случае ток, проходящий через мембрану, контролируется экспериментатором, а возникающие изменения напряжения регистрируются, как правило, в виде потенциалов действия. Эрвин Неер и Берт Сакманн разработали метод патч-клампа в конце 1970-х – начале 1980-х годов. Это открытие позволило впервые зарегистрировать токи отдельных молекул ионных каналов, что углубило понимание роли каналов в фундаментальных клеточных процессах, таких как потенциалы действия и нервная активность. За эту работу Неер и Сакманн получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1991 году.

Настройка

Во время записи с помощью патч-клампа полые стеклянные трубки, известные как микропипеты или патч-пипеты, заполненные электролитным раствором и записывающим электродом, подключенным к усилителю, вводятся в контакт с мембраной изолированной клетки. Другой электрод помещается в ванночку, окружающую клетку или ткань, в качестве опорного заземляющего электрода. Между записывающим и опорным электродами формируется электрическая цепь, между которыми находится исследуемая клетка. Раствор, заполняющий патч-пипетку, может соответствовать ионному составу раствора в ванночке, как в случае записи с прикрепленной клеткой, или соответствовать цитоплазме при записи всего клеточного содержимого. Раствор в ванночке может соответствовать физиологическому внеклеточному раствору, цитоплазме или быть полностью нефизиологичным, в зависимости от проводимого эксперимента. Исследователь также может изменять состав раствора в ванночке (реже – раствора в пипетке), добавляя ионы или лекарственные препараты для изучения ионных каналов в различных условиях. Диаметр кончика пипетки может варьироваться в зависимости от того, что исследователь пытается измерить, но обычно он составляет несколько микрометров. Такой небольшой размер позволяет охватить участок клеточной мембраны или "пластырь", который часто содержит всего один или несколько молекул ионных каналов. Этот тип электрода отличается от "острого микроэлектрода", используемого для прокола клеток при традиционных внутриклеточных записях, тем, что он герметично прилегает к поверхности клеточной мембраны, а не проникает сквозь нее. В некоторых экспериментах кончик микропипеты нагревают в микрофорже для получения гладкой поверхности, способствующей формированию высокоомного уплотнения с клеточной мембраной. Для получения такого высокоомного уплотнения микропипетку прижимают к клеточной мембране и создают разрежение. Часть клеточной мембраны всасывается в пипетку, образуя область мембраны в форме омеги, которая при правильном формировании создает сопротивление в диапазоне 10–100 гигаом, называемое "гигаомным уплотнением" или "гигазеалом".

During a patch clamp recording, a hollow glass tube known as a micropipette or patch pipette filled with an electrolyte solution and a recording electrode connected to an amplifier is brought into contact with the membrane of an isolated cell. Another electrode is placed in a bath surrounding the cell or tissue as a reference ground electrode. An electrical circuit can be formed between the recording and reference electrode with the cell of interest in between. The solution filling the patch pipette might match the ionic composition of the bath solution, as in the case of cell attached recording, or match the cytoplasm, for whole cell recording. The solution in the bath solution may match the physiological extracellular solution, the cytoplasm, or be entirely non physiological, depending on the experiment to be performed. The researcher can also change the content of the bath solution (or less commonly the pipette solution) by adding ions or drugs to study the ion channels under different conditions. Depending on what the researcher is trying to measure, the diameter of the pipette tip used may vary, but it is usually in the micrometer range. This small size is used to enclose a cell membrane surface area or "patch" that often contains just one or a few ion channel molecules. This type of electrode is distinct from the "sharp microelectrode" used to puncture cells in traditional intracellular recordings, in that it is sealed onto the surface of the cell membrane, rather than inserted through it. In some experiments, the micropipette tip is heated in a microforge to produce a smooth surface that assists in forming a high resistance seal with the cell membrane. To obtain this high resistance seal, the micropipette is pressed against a cell membrane and suction is applied. A portion of the cell membrane is suctioned into the pipette, creating an omega shaped area of membrane which, if formed properly, creates a resistance in the 10–100 gigaohms range, called a "gigaohm seal" or "gigaseal".

Запись

Многие усилители с патч-клампом не используют настоящие схемы удержания напряжения, а вместо этого являются дифференциальными усилителями, использующими электрод ванны для установки нулевого уровня тока (земли). Это позволяет исследователю поддерживать постоянное напряжение, наблюдая за изменениями тока. Для проведения таких измерений патч-пипетка сравнивается с заземляющим электродом. Затем в систему вводится ток для поддержания постоянного заданного напряжения. Ток, необходимый для удержания напряжения, имеет противоположный знак и равен по величине току, протекающему через мембрану.

Вариации

В зависимости от того, что исследователь хочет изучить, можно применить несколько вариантов базовой техники. Методы "внутри-наружу" и "наружу-наружу" называются методами "вырезанного участка", поскольку участок вырезается (удаляется) из основной части клетки. Методы прикрепления к клетке и оба метода вырезанного участка используются для изучения поведения отдельных ионных каналов в участке мембраны, прикрепленном к электроду. Методы "целой клетки" и "перфорированного участка" позволяют исследователю изучать электрическое поведение всей клетки, а не токи отдельных каналов. Метод "целой клетки", обеспечивающий доступ с низким электрическим сопротивлением внутрь клетки, в настоящее время во многом заменил методы записи с помощью микроэлектродов с высоким сопротивлением для регистрации токов через всю клеточную мембрану.

Пластырь с клетками

Для этого метода пипетку герметично прикрепляют к клеточной мембране, чтобы сформировать гигаомное уплотнение (герметичность с электрическим сопротивлением порядка гигаома), при этом обеспечивая сохранность клеточной мембраны. Это позволяет регистрировать токи через отдельные или несколько ионных каналов, находящихся в участке мембраны, захваченном пипеткой. Прикрепление только к внешней стороне клеточной мембраны минимально нарушает структуру клетки. С помощью этого метода относительно легко добиться нужной конфигурации, и после ее получения она достаточно стабильна. Для лиганд-зависимых ионных каналов или каналов, модулируемых метаботропными рецепторами, изучаемый нейромедиатор или препарат обычно добавляют в раствор в пипетке, где он может взаимодействовать с тем, что ранее было внешней поверхностью мембраны. Полученная активность канала может быть отнесена к используемому препарату, хотя обычно невозможно изменить концентрацию препарата внутри пипетки. Таким образом, метод ограничивается одной точкой на кривой «доза-ответ» для каждого участка мембраны. Поэтому кривую «доза-ответ» получают, используя несколько клеток и участков мембраны. Однако, потенциал-зависимые ионные каналы можно последовательно фиксировать при различных потенциалах мембраны в одном участке мембраны. Это приводит к активации каналов в зависимости от напряжения, и полную вольт-амперную (I-V) кривую можно построить только на одном участке. Еще одним потенциальным недостатком этого метода является то, что, подобно внутриклеточным путям клетки, они не нарушаются и не могут быть напрямую изменены. Одним из преимуществ этого метода является то, что экспериментатор имеет доступ к внутриклеточной поверхности мембраны через раствор в ванночке и может изменять химический состав среды, с которой контактирует внутренняя поверхность мембраны. Это полезно, когда экспериментатор хочет манипулировать средой на внутриклеточной поверхности отдельных ионных каналов. Например, каналы, активируемые внутриклеточными лигандами, можно изучать в диапазоне концентраций лигандов. Для достижения конфигурации «внутри-наружу» пипетку прикрепляют к клеточной мембране, как в режиме прикрепления к клетке, формируя гигаомное уплотнение, а затем оттягивают, чтобы отделить участок мембраны от остальной части клетки. Отрыв участка мембраны часто приводит к первоначальному образованию везикулы из мембраны в кончике пипетки, поскольку края участка мембраны быстро сливаются после отсечения. Затем необходимо разорвать наружную поверхность везикулы, чтобы перейти в конфигурацию «внутри-наружу»; это можно сделать, кратковременно пропустив мембрану через границу раздела раствор/воздух в ванночке, воздействием раствора с низкой концентрацией Ca2+ или кратковременным контактом с каплей парафина или кусочком отвержденного силиконового полимера.

For this method, the pipette is sealed onto the cell membrane to obtain a gigaseal (a seal with electrical resistance on the order of a gigaohm), while ensuring that the cell membrane remains intact. This allows the recording of currents through single, or a few, ion channels contained in the patch of membrane captured by the pipette. By only attaching to the exterior of the cell membrane, there is very little disturbance of the cell structure. Using this method it is also relatively easy to obtain the right configuration, and once obtained it is fairly stable. For ligand gated ion channels or channels that are modulated by metabotropic receptors, the neurotransmitter or drug being studied is usually included in the pipette solution, where it can interact with what used to be the external surface of the membrane. The resulting channel activity can be attributed to the drug being used, although it is usually not possible to then change the drug concentration inside the pipette. The technique is thus limited to one point in a dose response curve per patch. Therefore, the dose response is accomplished using several cells and patches. However, voltage gated ion channels can be clamped successively at different membrane potentials in a single patch. This results in channel activation as a function of voltage, and a complete I V (current voltage) curve can be established in only one patch. Another potential drawback of this technique is that, just as the intracellular pathways of the cell are not disturbed, they cannot be directly modified either. One advantage of this method is that the experimenter has access to the intracellular surface of the membrane via the bath and can change the chemical composition of what the inside surface of the membrane is exposed to. This is useful when an experimenter wishes to manipulate the environment at the intracellular surface of single ion channels. For example, channels that are activated by intracellular ligands can then be studied through a range of ligand concentrations. To achieve the inside out configuration, the pipette is attached to the cell membrane as in the cell attached mode, forming a gigaseal, and is then retracted to break off a patch of membrane from the rest of the cell. Pulling off a membrane patch often results initially in the formation of a vesicle of membrane in the pipette tip, because the ends of the patch membrane fuse together quickly after excision. The outer face of the vesicle must then be broken open to enter into inside out mode; this may be done by briefly taking the membrane through the bath solution/air interface, by exposure to a low Ca2+ solution, or by momentarily making contact with a droplet of paraffin or a piece of cured silicone polymer.

Запись на всю клетку или пластырь на всю клетку

Запись с целой клетки включает в себя регистрацию токов через множество каналов одновременно, на большой области клеточной мембраны. Электрод остается на месте на клетке, как и при записи с прикрепленной клеткой, но для разрыва мембранного участка применяется большее всасывание, обеспечивая доступ из внутреннего пространства пипетки во внутриклеточное пространство клетки. Это позволяет в режиме реального времени вводить вещества и изучать, как различные воздействия (например, лекарственные препараты) влияют на клетки. После прикрепления пипетки к клеточной мембране существует два способа разрушить мембранный участок. Первый – путем усиления всасывания. Величина и продолжительность всасывания зависят от типа клетки и размера пипетки. Второй метод требует подачи через пипетку мощного импульса тока. Величина тока и продолжительность импульса также зависят от типа клетки. Метод внешней патч-экструзии (outside-out patching) дает экспериментатору возможность изучать свойства ионного канала, когда он изолирован от клетки и последовательно подвергается воздействию различных растворов на внеклеточной поверхности мембраны. Экспериментатор может перфузировать один и тот же участок мембраны различными растворами за относительно короткое время, и если канал активируется нейротрансмиттером или лекарственным препаратом со стороны внеклеточной поверхности, можно получить кривую «доза-ответ». Эта возможность измерять ток через один и тот же участок мембраны в разных растворах является существенным преимуществом метода внешней патч-экструзии по сравнению с методом записи с прикрепленной клеткой. С другой стороны, этот метод более сложен в исполнении. Более длительный процесс формирования включает больше этапов, которые могут оказаться неудачными, что приводит к снижению количества пригодных для использования мембранных участков.

Перфорированный пластырь

Эта вариация метода патч-клэмпа очень похожа на конфигурацию "целой клетки". Основное отличие заключается в том, что при формировании гигаомного уплотнения экспериментатор не использует вакуум для разрыва мембраны патча. Вместо этого раствор электрода содержит небольшое количество противогрибкового или антибактериального агента, такого как амфотерицин В, нистатин или грамицидин, который диффундирует в мембранный патч и формирует в мембране небольшие поры, обеспечивая электрический доступ во внутреннюю часть клетки. Недостатки включают более высокое сопротивление доступа по сравнению с конфигурацией "целой клетки" из-за частичной мембраны, занимающей кончик электрода. Это может снизить разрешение тока и увеличить шум записи. Также может потребоваться значительное время для перфорации мембраны антибиотиком (около 15 минут для амфотерицина В и еще больше для грамицидина и нистатина). Мембрана под кончиком электрода ослабляется перфорациями, созданными антибиотиком, и может разорваться. Если патч разрывается, запись переходит в режим "целой клетки", при этом антибиотик попадает внутрь клетки. Основным недостатком является значительное снижение сопротивления между пипеткой и мембраной, что приводит к утечке тока через уплотнение и значительному снижению разрешения малых токов. Однако эту утечку можно частично скорректировать, что позволяет сравнивать и сопоставлять записи, полученные из разных областей интересующей клетки. Учитывая это, было установлено, что метод "свободного патча" способен регистрировать токи величиной менее 1 мА/см².

Патч-сек

Комбинация клеточной визуализации, секвенирования РНК и патч-клампа позволяет полностью характеризовать нейроны, используя несколько модальностей. Поскольку нервная ткань представляет собой одну из наиболее транскриптомно разнообразных популяций клеток, классификация нейронов по типам для понимания формируемых ими нейронных цепей является серьезной задачей для нейробиологов. Сочетание классических методов классификации с пост-hoc секвенированием РНК отдельных клеток оказалось сложным и медленным процессом. Объединяя различные модальности данных, такие как электрофизиология, секвенирование и микроскопия, Patch-seq позволяет характеризовать нейроны одновременно по нескольким параметрам. В настоящее время метод ограничен низкой пропускной способностью по сравнению с другими методами секвенирования, главным образом из-за трудоемкости получения успешной записи патч-клампа с нейрона. В настоящее время проводятся исследования по автоматизации технологии патч-клампа, что также должно повысить пропускную способность Patch-seq.