Космид: Гибридтік плазмаида және геномдық кітапханалар құрудағы қолданылуы
Cosmid
Космид - гибридтік плазмида, геномдық кітапханалар құруға қолданылады. 37-52 кб ДНК сыйымдылығы, бактериофаг қаптамасының өлшеміне байланысты. Гендік инженерияда маңызды.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Гибридті плазмидтің түрі
Type of hybrid plasmid
Космид – Ламбда фагының cos тізбегін қамтитын гибридті плазмидтің бір түрі. Көбінесе гендік инженерияда клондау векторлары ретінде қолданылатын космоидтар геномдық кітапханалар құруға мүмкіндік береді. Олар алғаш рет 1978 жылы Коллинз және Хон есімді ғалымдар тарапынан сипатталған. Космидтер 37-ден 52 (әдетте 45) кб-ға дейін ДНК-ны қамти алады, бұл шектеулер бактериофагтың қалыпты қаптама өлшемдеріне байланысты. Егер оларда репликацияның тиісті шығу тегі (ori) болса, олар плазмидтер ретінде көбейе алады: мысалы, сүтқоректілер жасушаларында SV40 ori, екі тізбекті ДНК репликациясы үшін ColE1 ori немесе прокариоттарда бір тізбекті ДНК репликациясы үшін f1 ori. Олар жиі антибиотикке төзімділік сияқты таңдауға қатысты генді де қамтиды, бұл трансформацияланған жасушаларды антибиотик қосылған ортаға егу арқылы анықтауға мүмкіндік береді. Космидті қабылдамаған жасушалар өсе алмайды. Плазмидтерден айырмашылығы, оларды in vitro жағдайында фаг капсидтеріне қаптауға болады, бұл процеске біріктірілген ұштар қажет, бұл cos сайттары деп те аталады және ламбда фагын вектор ретінде клондауда да қолданылады, бірақ кос тізбегінен басқа барлық ламбда гендері жойылған. Капсидтердегі гибридтік космоид ДНК-сы трансдукция арқылы бактериялық жасушаларға беріледі. Cos сайттары арасында кем дегенде 38 кб ДНК қажет болатындықтан, in vitro қаптама талаптарына сәйкес, инсерт ДНК-сы жоқ вектор қапталмайды (жаңа енгізілген ДНК-да көптеген тікелей қайталаулар немесе палиндромдық (кері қайталаулар) ДНК болса, плазмидтердің тұрақсыздығы артады). Бұл тұрақсыздық көбінесе ДНК рекомбинациясына әсер ететін нақты мутациялары бар қоныс бактериясын пайдалану арқылы азайтылуы мүмкін (Ескерту: жоғарыда аталған алғашқы Hohn & Collins жарияланымдарында кері қайталаулардың болмауы көрсетілген; сонымен қатар қараңыз).
A cosmid is a type of hybrid plasmid that contains a Lambda phage cos sequence. Often used as cloning vectors in genetic engineering, cosmids can be used to build genomic libraries. They were first described by Collins and Hohn in 1978. Cosmids can contain 37 to 52 (normally 45) kb of DNA, limits based on the normal bacteriophage packaging size. They can replicate as plasmids if they have a suitable origin of replication (ori): for example SV40 ori in mammalian cells, ColE1 ori for double stranded DNA replication, or f1 ori for single stranded DNA replication in prokaryotes. They frequently also contain a gene for selection such as antibiotic resistance, so that the transformed cells can be identified by plating on a medium containing the antibiotic. Those cells which did not take up the cosmid would be unable to grow. Unlike plasmids, they can also be packaged in vitro into phage capsids, a step which requires cohesive ends, also known as cos sites also used in cloning with a lambda phage as a vector, however nearly all the lambda genes have been deleted with the exception of the cos sequence. The hybrid cosmid DNA in the capsids can then be transferred into bacterial cells by transduction. Since there is a requirement for in vitro packaging whereby at least 38 kb of DNA is required between the cos sites, the vector without insert DNA will not be packaged (plasmids instability is increased if the novel inserted DNA contains many direct repeats or palindromic (inverted repeats) DNA. This instability can largely be counteracted by using a host bacterium with specific mutations affecting DNA recombination (N. B. Absence of inverted repeats was noted in the first Hohn & Collins publication cited above; see also).
Кос-тізбектер
Кос-тізбектер ~200 негіз жұп ұзындығында болады және қаптау үшін өте маңызды. Олардың құрамында терминаза ферментінің әрекетімен әр тізбекте 12 бп қашықтықта ДНК-ның шабуы жасалатын cosN орны бар. Бұл дөңгелек космоидты 12 бп ұзындығындағы екі "үйлесімді" немесе "жабысқақ" ұштары бар сызықтық түріне келтіреді. (ДНК фагтың басына сыюы үшін сызықтық болуы тиіс.) CosB орны терминазаны ұстап тұрып, тізбектердің бөліну процесін жүзеге асырады. Алдыңғы космоид қапталғаннан кейін келесі космоидтың cosQ орны (айналмалы шеңбер репликациясы көбінесе сызықтық конкатемерлерге алып келеді) терминазамен ұсталып, жасушалық DNases ферменттерінің ыдыратуына жол бермейді.
Cos sequences are ~200 base pairs long and essential for packaging. They contain a cosN site where DNA is nicked at each strand, 12 bp apart, by terminase. This causes linearization of the circular cosmid with two "cohesive" or "sticky ends" of 12bp. (The DNA must be linear to fit into a phage head.) The cosB site holds the terminase while it is nicking and separating the strands. The cosQ site of next cosmid (as rolling circle replication often results in linear concatemers) is held by the terminase after the previous cosmid has been packaged, to prevent degradation by cellular DNases.
Космидтің ерекшеліктері мен қолданылуы
Космидтер негізінен бактериялық oriV, антибиотик таңдау маркері және клондау орны бар плазмидтер, бірақ олар бактериофаг ламбдадан алынған бір немесе, жақында, екі cos сайты бар. Эксперименттің нақты мақсатына байланысты, кең қонақ иесі диапазонына ие космоидтар, шаттл космоидтар немесе «сүтқоректік» космоидтар (SV40 oriV және сүтқоректілерді таңдау маркерімен байланысты) қолжетімді. Космоидтардың жүктеме сыйымдылығы вектордың өзінің мөлшеріне байланысты өзгереді, бірақ әдетте 40–45 кб шамасында болады. Клондау процедурасы екі векторлық «қолды» жасауды қамтиды, содан кейін олар шетелдік ДНК-ға қосылады. Жабайы типтегі космоид ДНК-сына қарсы іріктеу қарапайым түрде мөлшері бойынша сүзу арқылы жүзеге асырылады. Сондықтан космоидтар әрқашан колониялар құрайды, ал емес плактар. Клонның тығыздығы да шамамен 105–106 CFU/мкг лигацияланған ДНК-ға қарағанда әлдеқайда төмен. Рекомбинантты ламбда немесе космоид кітапханаларын құрғаннан кейін, барлық ДНК ин витро қаптама деп аталатын техника арқылы тиісті E. coli қабылдаушысына беріледі. Қажетті қаптама экстракттары E. coli cI857 лизогендерінен алынады (қызыл гамма, Sam және Dam (бас жиналымы) және Eam (құйрық жиналымы) тиісінше). Бұл экстракттар рекомбинантты молекулаларды in vitro таниды және қаптайды, нәтижесінде жетілген фаг бөлшектері (ламбда негізіндегі векторлар) немесе фаг қабықшаларындағы рекомбинантты плазмидтер (космоидтар) пайда болады. Бұл айырмашылықтар ламбда алмастыру векторларының пайдасына инфекция жиілігінің өзгешелігінде көрінеді. Бұл олардың сәл төмен жүктеме сыйымдылығын өтеуге көмектеседі. Фаг кітапханаларын космоид кітапханаларына қарағанда сақтау және тексеру оңай. Мақсатты ДНК: клондалатын геномдық ДНК тиісті мөлшердегі шектеу фрагменттеріне кесілуі керек. Бұл әдетте жартылай шектеу арқылы жүзеге асырылады, содан кейін өлшемді фракциялау немесе дефосфорилирлеу (сиыр ішегінің фосфатазасын қолдану) жүргізіледі, хромосомалық шатасуды болдырмау үшін, яғни физикалық байланысы жоқ фрагменттердің лигациялануын болдырмау үшін.
Cosmids are predominantly plasmids with a bacterial oriV, an antibiotic selection marker and a cloning site, but they carry one, or more recently two, cos sites derived from bacteriophage lambda. Depending on the particular aim of the experiment, broad host range cosmids, shuttle cosmids or 'mammalian' cosmids (linked to SV40 oriV and mammalian selection markers) are available. The loading capacity of cosmids varies depending on the size of the vector itself but usually lies around 40–45 kb. The cloning procedure involves the generation of two vector arms which are then joined to the foreign DNA. Selection against wild type cosmid DNA is simply done via size exclusion. Cosmids, therefore, always form colonies and not plaques. Also the clone density is much lower with around 105 – 106 CFU per μg of ligated DNA. After the construction of recombinant lambda or cosmid libraries the total DNA is transferred into an appropriate E. coli host via a technique called in vitro packaging. The necessary packaging extracts are derived from E. coli cI857 lysogens (red gam Sam and Dam (head assembly) and Eam (tail assembly) respectively). These extracts will recognize and package the recombinant molecules in vitro, generating either mature phage particles (lambda based vectors) or recombinant plasmids contained in phage shells (cosmids). These differences are reflected in the different infection frequencies seen in favour of lambda replacement vectors. This compensates for their slightly lower loading capacity. Phage libraries are also stored and screened more easily than cosmid libraries. Target DNA: the genomic DNA to be cloned has to be cut into the appropriate size range of restriction fragments. This is usually done by partial restriction followed by either size fractionation or dephosphorylation (using calf intestine phosphatase) to avoid chromosome scrambling, i. e. the ligation of physically unlinked fragments.