Клондау векторы: ДНК фрагментін тұрақтандыру және көшіру құралы
Cloning vector
Клондау векторы: ДНК фрагментін енгізуге арналған кішкентай ДНК бөліктері. Құрамы, қолданылуы, рестрикциялық ферменттермен жұмыс және клондау процесі туралы біліңіз.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Тұрақты сақталанатын ДНК-ның шағын бөлігі
Small piece of maintainable DNA
Клондау векторы – организмде тұрақты сақталанатын және клондау мақсатында оған бөгде ДНК фрагментін енгізуге болатын ДНК-ның шағын бөлігі. Клондау векторы вирустан алынған ДНК, жоғары организм жасушасы немесе бактерия плазмиді болуы мүмкін. Векторда ДНК фрагментін векторға қолайлы түрде енгізуге немесе одан шығаруға мүмкіндік беретін ерекшеліктер бар, мысалы, рестрикциялық сайттардың болуы арқылы. Вектор мен бөгде ДНК-ны ДНК-ны кесетін рестрикциялық ферменттермен өңдеуге болады, нәтижесінде пайда болған ДНК фрагменттерінде тегіс ұштар немесе жабысқақ ұштар деп аталатын ілгектік ұштар болады, ал үйлесімді ұштары бар вектор ДНК-сы мен бөгде ДНК-ны молекулалық лигация арқылы біріктіруге болады. ДНК фрагменті клондау векторына клондалғаннан кейін, оны одан әрі арнайы мақсаттарға арналған басқа векторға субклондауға болады. Клондау векторларының көптеген түрлері бар, бірақ ең көп қолданылатындары – генетикалық түрлендірілген плазмидтер. Клондау әдетте бірінші рет Escherichia coli арқылы жүргізіледі, ал E. coli-дегі клондау векторларына плазмидтер, бактериофагтар (мысалы, фаг λ), космоидтар және бактериялық жасанды хромосомалар (BAC) жатады. Дегенмен, кейбір ДНК-ны E. coli-да тұрақты сақтау мүмкін емес, мысалы, өте үлкен ДНК фрагменттері, сондықтан ашытқы сияқты басқа организмдер қолданылуы мүмкін. Ашытқыдағы клондау векторларына ашытқының жасанды хромосомалары (YAC) жатады.
A cloning vector is a small piece of DNA that can be stably maintained in an organism, and into which a foreign DNA fragment can be inserted for cloning purposes. The cloning vector may be DNA taken from a virus, the cell of a higher organism, or it may be the plasmid of a bacterium. The vector contains features that allow for the convenient insertion of a DNA fragment into the vector or its removal from the vector, for example through the presence of restriction sites. The vector and the foreign DNA may be treated with a restriction enzyme that cuts the DNA, and DNA fragments thus generated contain either blunt ends or overhangs known as sticky ends, and vector DNA and foreign DNA with compatible ends can then be joined by molecular ligation. After a DNA fragment has been cloned into a cloning vector, it may be further subcloned into another vector designed for more specific use. There are many types of cloning vectors, but the most commonly used ones are genetically engineered plasmids. Cloning is generally first performed using Escherichia coli, and cloning vectors in E. coli include plasmids, bacteriophages (such as phage λ), cosmids, and bacterial artificial chromosomes (BACs). Some DNA, however, cannot be stably maintained in E. coli, for example very large DNA fragments, and other organisms such as yeast may be used. Cloning vectors in yeast include yeast artificial chromosomes (YACs).
Клондау векторының ерекшеліктері
Молекулалық биологияда жиі қолданылатын клондау векторларының барлығы олардың функциясы үшін қажетті маңызды белгілерге ие, мысалы, тиімді клондау орны және таңдамалы маркер. Басқалары қолданылу мақсатына қарай қосымша белгілерге ие болуы мүмкін. Қолайлылық және ыңғайлылық үшін клондау көбінесе E. coli бактериясын пайдалану арқылы жүзеге асырылады. Сондықтан, қолданылатын клондау векторлары көбінесе E. coli-де көбейіп, сақталуы үшін қажетті элементтерге ие, мысалы, функционалды репликация бастамасы (ori). Көптеген плазмидтерде ColE1 репликация бастамасы табылады. Кейбір векторлар E. coli-ден басқа да организмде сақталуына мүмкіндік беретін элементтерді қамтиды, мұндай векторлар шаттл-векторлар деп аталады.
All commonly used cloning vectors in molecular biology have key features necessary for their function, such as a suitable cloning site and selectable marker. Others may have additional features specific to their use. For reason of ease and convenience, cloning is often performed using E. coli. Thus, the cloning vectors used often have elements necessary for their propagation and maintenance in E. coli, such as a functional origin of replication (ori). The ColE1 origin of replication is found in many plasmids. Some vectors also include elements that allow them to be maintained in another organism in addition to E. coli, and these vectors are called shuttle vector.
Клондау орны
Клондау векторларының барлығы генді векторға қолайлы түрде енгізуге немесе одан алып тастауға мүмкіндік беретін ерекшеліктерге ие. Бұл көп клондау орны (МКО) немесе көптеген ерекше шектеу ферменттері бар полилинкер болуы мүмкін. МКО-дағы шектеу ферменттері алдымен шектеу ферменттерімен кесіледі, содан кейін сол ферменттермен өңделген ПТР арқылы күшейтілген мақсатты ген ДНК лигазасын қолдана отырып, векторларға қосылады. Егер қажет болса, мақсатты ДНҚ тізбегін векторға белгілі бір бағытта енгізуге болады. Қажет болған жағдайда шектеу ферменттері басқа векторға субклондау үшін пайдаланылуы мүмкін. Басқа клондау векторлары лигазаның орнына топоизомеразаны қолдануы мүмкін, және клондау вектордың немесе инсерттің шектеу ферменттерімен кесілуін қажет етпей, жылдамдатылуы мүмкін. Бұл TOPO клондау әдісінде сызықтық вектор I топоизомеразаның ұштарына бекітілу арқылы белсендіріледі, ал бұл "TOPO белсендірілген" вектор ПТР өнімінің екі 5' ұшын қосып, ПТР өнімін қабылдауы мүмкін, нәтижесінде топоизомераза босатылып, дөңгелек вектор пайда болады. ДНК-ны кесіп, лигазаны пайдаланбай клондаудың тағы бір әдісі – ДНК рекомбинациясы, мысалы, Gateway клондау жүйесінде қолданылатындай. Клондау векторына клонталған ген (осы әдісте "кіру клоны" деп аталады) рекомбинация арқылы әртүрлі экспрессия векторларына қолайлы түрде енгізілуі мүмкін.
All cloning vectors have features that allow a gene to be conveniently inserted into the vector or removed from it. This may be a multiple cloning site (MCS) or polylinker, which contains many unique restriction sites. The restriction sites in the MCS are first cleaved by restriction enzymes, then a PCR amplified target gene also digested with the same enzymes is ligated into the vectors using DNA ligase. The target DNA sequence can be inserted into the vector in a specific direction if so desired. The restriction sites may be further used for sub cloning into another vector if necessary. Other cloning vectors may use topoisomerase instead of ligase and cloning may be done more rapidly without the need for restriction digest of the vector or insert. In this TOPO cloning method a linearized vector is activated by attaching topoisomerase I to its ends, and this "TOPO activated" vector may then accept a PCR product by ligating both the 5' ends of the PCR product, releasing the topoisomerase and forming a circular vector in the process. Another method of cloning without the use of DNA digest and ligase is by DNA recombination, for example as used in the Gateway cloning system. The gene, once cloned into the cloning vector (called entry clone in this method), may be conveniently introduced into a variety of expression vectors by recombination.
Таңдауға болатын маркер
Векторда оң түрлендірілген жасушаларды іріктеу үшін таңдауға болатын маркер болады. Антибиотиктерге төзімділік көбінесе маркер ретінде қолданылады, мысалы, бета-лактамаза гені бета-лактама антибиотиктерінің пенициллиндік тобына, мысалы, ампициллинге төзімділік береді. Кейбір векторларда екі таңдауға болатын маркер болады, мысалы, pACYC177 плазмиді ампициллинге және канамицинге қарсы гендерді қамтиды. Екі түрлі организмде сақталуы үшін жасалған шатл векторы екі таңдауға болатын маркерді қажет етуі мүмкін, бірақ цеоцин мен гигромицин B-ға төзімділік сияқты кейбір таңдауға болатын маркерлер әртүрлі жасуша типтерінде тиімді. Минималды ортада өсуге мүмкіндік беретін ауксотрофты іріктеу маркерлері де қолданылуы мүмкін; мысал ретінде LEU2 және URA3 гендері, тиісті ауксотрофты ашытқы штамдарымен бірге қолданылады. Таңдауға болатын маркердің тағы бір түрі клондалған гені бар плазмидтің оң іріктеуін қамтамасыз етеді. Бұл үшін иесі жасушаларға қауіпті гендерді, мысалы, барназа, Ccda және parD/parE токсиндерін пайдалану қажет болуы мүмкін. Әдетте, бұл клондау процесінде қауіпті генді жою немесе бұзу арқылы жұмыс істейді, ал қауіпті гені әлі де сақталған сәтсіз клондар иесі жасушаларды өлтіреді, сондықтан тек сәтті клондар ғана іріктеледі.
A selectable marker is carried by the vector to allow the selection of positively transformed cells. Antibiotic resistance is often used as marker, an example being the beta lactamase gene, which confers resistance to the penicillin group of beta lactam antibiotics like ampicillin. Some vectors contain two selectable markers, for example the plasmid pACYC177 has both ampicillin and kanamycin resistance gene. Shuttle vector which is designed to be maintained in two different organisms may also require two selectable markers, although some selectable markers such as resistance to zeocin and hygromycin B are effective in different cell types. Auxotrophic selection markers that allow an auxotrophic organism to grow in minimal growth medium may also be used; examples of these are LEU2 and URA3 which are used with their corresponding auxotrophic strains of yeast. Another kind of selectable marker allows for the positive selection of plasmid with cloned gene. This may involve the use of a gene lethal to the host cells, such as barnase, Ccda, and the parD/parE toxins. This typically works by disrupting or removing the lethal gene during the cloning process, and unsuccessful clones where the lethal gene still remains intact would kill the host cells, therefore only successful clones are selected.
Репортерлік ген
Репортерлік гендер кейбір клондау векторларында сәтті клондарды оңай анықтауға мүмкіндік беретін, осы гендердің ерекшеліктерін пайдалану арқылы сәтті клондарды іріктеуді жеңілдету үшін қолданылады. Клондау векторларындағы мұндай мүмкіндіктер көк-ақ іріктеуде α-комплементация үшін lacZα фрагменті және/немесе көп көшірмелі сайт (МКС) құрамында және оның шекарасында орналасқан маркерлік гендер немесе репортерлік гендер болуы мүмкін, бұл қосымша ақуыздардың өндірісін жеңілдетуге арналған. Іріктеу үшін қолданылатын қосымша серіктестердің мысалдары – жасыл флуоресцентті ақуыз (GFP) және люцифераза.
Reporter genes are used in some cloning vectors to facilitate the screening of successful clones by using features of these genes that allow successful clone to be easily identified. Such features present in cloning vectors may be the lacZα fragment for α complementation in blue white selection, and/or marker gene or reporter genes in frame with and flanking the MCS to facilitate the production of fusion proteins. Examples of fusion partners that may be used for screening are the green fluorescent protein (GFP) and luciferase.
Көрсеткіш элементтері
Клондау векторына клондалған мақсатты геннің экспрессиясына қажетті элементтер, мысалы, промотор және рибосомалық байланысу орны (РБС) міндетті түрде болуы керек емес, бірақ көптеген векторларда олар бар, және олар экспрессия векторы ретінде жұмыс істей алады. Мақсатты ДНК таңдалған қабылдаушы организмде геннің экспрессиясы үшін қажетті нақты промотордың бақылауындағы орынға енгізілуі мүмкін. Егер промотор болса, геннің экспрессиясы қатаң түрде бақыланып, индукцияланатын болуы керек, сондықтан ақуыздар қажет болған кезде ғана өндіріледі. T7 және lac промоторлары жиі қолданылатын промоторлардың мысалдары. Көк-ақ таңдау сияқты скринингтік әдістерді қолданғанда промотордың болуы қажет. Клондалған ДНК тізбегі үшін промотор мен РБС жоқ клондау векторлары кейде қолданылады, мысалы, E. coli жасушалары үшін уытты өнімдерді кодтайтын гендерді клондау кезінде. Клондалған ДНК тізбегі үшін промотор мен РБС сондай-ақ геномдық немесе кДНК кітапханасын жасау кезінде қажет емес, себебі клондалған гендер әдетте экспрессиясы қажет болса, одан да ыңғайлы экспрессиялық векторға субклондалады. Кейбір векторлар тек транскрипция үшін жасалған, гетерологты ақуыздар экспрессияланбайды, мысалы, in vitro мРНК өндірісі үшін. Мұндай векторлар транскрипциялық векторлар деп аталады. Оларда полиаденилдену және терминацияға қажетті тізбектер болмауы мүмкін, сондықтан оларды ақуыз өндірісі үшін қолдануға болмайды.
A cloning vector need not contain suitable elements for the expression of a cloned target gene, such as a promoter and ribosomal binding site (RBS), many however do, and may then work as an expression vector. The target DNA may be inserted into a site that is under the control of a particular promoter necessary for the expression of the target gene in the chosen host. Where the promoter is present, the expression of the gene is preferably tightly controlled and inducible so that proteins are only produced when required. Some commonly used promoters are the T7 and lac promoters. The presence of a promoter is necessary when screening techniques such as blue white selection are used. Cloning vectors without promoter and RBS for the cloned DNA sequence are sometimes used, for example when cloning genes whose products are toxic to E. coli cells. Promoter and RBS for the cloned DNA sequence are also unnecessary when first making a genomic or cDNA library of clones since the cloned genes are normally subcloned into a more appropriate expression vector if their expression is required. Some vectors are designed for transcription only with no heterologous protein expressed, for example for in vitro mRNA production. These vectors are called transcription vectors. They may lack the sequences necessary for polyadenylation and termination, therefore may not be used for protein production.
Клондау векторларының түрлері
Клондау векторларының көптеген түрлері бар, және векторды таңдау бірнеше факторларға байланысты болуы мүмкін, мысалы, кірістірудің мөлшері, көшірме саны және клондау әдісі. Үлкен кірістіру жалпы клондау векторында тұрақты сақталмауы мүмкін, әсіресе жоғары көшірме саны бар векторлар үшін, сондықтан үлкен фрагменттерді клондау үшін арнайы клондау векторы қажет болуы мүмкін. Кейбір плазмидтер M13 бактериофагының репликация басталу тегін қамтиды және оларды бір тізбекті ДНК жасау үшін пайдалануға болады. Бұлар фагемидтер деп аталады, мысалы, pBluescript клондау векторларының сериясы.
A large number of cloning vectors are available, and choosing the vector may depend upon a number of factors, such as the size of the insert, copy number and cloning method. Large insert may not be stably maintained in a general cloning vector, especially for those with a high copy number, therefore cloning large fragments may require more specialised cloning vector. Some plasmids contain an M13 bacteriophage origin of replication and may be used to generate single stranded DNA. These are called phagemids, and examples are the pBluescript series of cloning vectors.
Бактериофаг
Клондау үшін қолданылатын бактериофагтар – λ фаг және M13 фаг. Фагқа салынатын ДНҚ мөлшерінің жоғарғы шегі бар (максимум 53 кб), сондықтан фагтың ДНҚ-сына бөгде ДНҚ-ны енгізуге мүмкіндік беру үшін фагты клонирлеу векторларынан кейбір қажетсіз гендерді жою қажет болуы мүмкін, мысалы, лизогенияға қатысты гендер, себебі фаг λ-ны клонирлеу векторы ретінде пайдалануда тек литикалық цикл ғана қолданылады. λ фаг векторларының екі түрі бар: енгізу векторы және ауыстыру векторы. Енгізу векторларында 5–11 кб өлшемдегі бөгде ДНҚ енгізілуі мүмкін бірегей кесу орны бар. Ал ауыстыру векторларында кесу орындары литикалық цикл үшін қажетсіз гендерді қамтитын аймақты шеңберлейді, бұл аймақты жойып, оның орнына клондау процесінде ДНҚ енгізуге болады, сондай-ақ 8–24 кб көлемдегі үлкен ДНҚ енгізуге мүмкіндік бар.
The bacteriophages used for cloning are the λ phage and M13 phage. There is an upper limit on the amount of DNA that can be packed into a phage (a maximum of 53 kb), therefore to allow foreign DNA to be inserted into phage DNA, phage cloning vectors may need to have some non essential genes deleted, for example the genes for lysogeny since using phage λ as a cloning vector involves only the lytic cycle. There are two kinds of λ phage vectors insertion vector and replacement vector. Insertion vectors contain a unique cleavage site whereby foreign DNA with size of 5–11 kb may be inserted. In replacement vectors, the cleavage sites flank a region containing genes not essential for the lytic cycle, and this region may be deleted and replaced by the DNA insert in the cloning process, and a larger sized DNA of 8–24 kb may be inserted.
Космид
Космидтер – бактериофаг λ ДНК-сының сегментін қамтитын плазмидтер, оның ішінде ДНК-ны λ бөлшектеріне қаптау үшін қажетті элементтері бар когезивті ұшқыш аймақ (cos) орналасқан. Тиімді көбею бастамасы (ori) болған жағдайда, ол плазмид ретінде көбейе алады. Әдетте, 28-ден 45 кб-ға дейінгі үлкен ДНК фрагменттерін клондау үшін қолданылады.
Cosmids are plasmids that incorporate a segment of bacteriophage λ DNA that has the cohesive end site (cos) which contains elements required for packaging DNA into λ particles. Under apt origin of replication (ori), it can replicate as a plasmid It is normally used to clone large DNA fragments between 28 and 45 Kb.
Жануарлар мен өсімдіктердегі вирустық векторлар
Өсімдіктер мен жануарлар жасушаларын жұқтыратын вирустар да өсімдіктер мен жануарлар жасушаларына шетелдік гендерді енгізу үшін қолданылды. Вирустардың жасушаларға сіңіру, ДНК-сын енгізу және көбейту қабілеттері оларды еукариоттық жасушаларға мәдениетте шетелдік ДНК-ны жеткізу үшін өте қолайлы құралға айналдырды. Сүтқоректілер жасушаларын алғаш клондау экспериментінде маймыл вирусы 40 (SV40) негізіндегі вектор пайдаланылды. Сүтқоректілерде гендерді клондау үшін аденовирустар және папиллома вирусы сияқты басқа да вирустарға негізделген бірнеше векторлар қолданылды. Қазіргі таңда ретровирустық векторлар сүтқоректілер жасушаларында гендерді клондау үшін жиі қолданылады. Өсімдіктерде, мысалы, гүлдесін мозаика вирусы, темекі мозаика вирусы және Егіздер вирусы қолданылған, бірақ нәтижелері шектеулі болды.
Viruses that infect plant and animal cells have also been manipulated to introduce foreign genes into plant and animal cells. The natural ability of viruses to adsorb to cells, introduce their DNA and replicate have made them ideal vehicles to transfer foreign DNA into eukaryotic cells in culture. A vector based on Simian virus 40 (SV40) was used in first cloning experiment involving mammalian cells. A number of vectors based on other type of viruses like Adenoviruses and Papilloma virus have been used to clone genes in mammals. At present, retroviral vectors are popular for cloning genes in mammalian cells. In case of plants like Cauliflower mosaic virus, Tobacco mosaic virus and Gemini viruses have been used with limited success.
Скрининг: көк/ақ экранның үлгісі
Көптеген жалпы мақсаттағы векторлар, мысалы pUC19, көбінесе клондалған ДНҚ фрагментінің болуын анықтау жүйесін қамтиды, бұл жүйе оңай бағаланатын фенотиптің жоғалуына негізделген. Ең көп қолданылатыны – *E. coli* β-галактозидазасын кодтайтын ген, оның қызметін осы ферменттің ерігіш, түссіз X-гал (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозид) субстратын ерімейтін, көк түсті өнімге (5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго) гидролиздеу қабілеті арқылы оңай анықтауға болады. β-галактозидазаның векторлық *lacZα* тізбегіне ДНҚ фрагментін клондау белсенді ферменттің өндірілуіне кедерес жасайды. Егер X-гал селективті агар пластиналарына қосылса, трансформацияланған колониялар көбінесе ДНҚ енгізілмеген векторлар үшін көк, ал клондалған ДНҚ фрагменті бар векторлар үшін ақ болады.
Many general purpose vectors such as pUC19 usually include a system for detecting the presence of a cloned DNA fragment, based on the loss of an easily scored phenotype. The most widely used is the gene coding for E. coli β galactosidase, whose activity can easily be detected by the ability of the enzyme it encodes to hydrolyze the soluble, colourless substrate X gal (5 bromo 4 chloro 3 indolyl beta d galactoside) into an insoluble, blue product (5,5' dibromo 4,4' dichloro indigo). Cloning a fragment of DNA within the vector based lacZα sequence of the β galactosidase prevents the production of an active enzyme. If X gal is included in the selective agar plates, transformant colonies are generally blue in the case of a vector with no inserted DNA and white in the case of a vector containing a fragment of cloned DNA.