ДНҚ-ны талдауға дайындау үшін қолданылатын рестрикциялық қорыту әдісі туралы біліңіз. ДНҚ фрагментациясы, ферменттер, ПТР, электрофорез, гендік талдау.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Рестрикциялық диджест – молекулалық биологияда ДНК-ны талдау немесе басқа өңдеуге дайындау үшін қолданылатын процедура. Ол кейде ДНК фрагментациясы деп те аталады, бірақ бұл термин басқа процедуралар үшін де қолданылады. Рестрикциялық диджестте ДНК молекулалары 4-ден 12 нуклеотидке дейінгі ұзындықтағы нақты рестрикциялық орындарда рестрикциялық ферменттерді пайдалану арқылы кесіледі. Соның нәтижесінде алынған диджесттелген ДНК көбінесе полимераза тізбектік реакциясы (ПТР) арқылы таңдап күшейтіледі, бұл оны агароздық гель электрофорезі және хроматография сияқты талдау техникаларына ыңғайлырақ жасайды. Ол генетикалық саусақ іздерін анықтау, плазмидтің субклондау және RFLP талдауында қолданылады.
A restriction digest is a procedure used in molecular biology to prepare DNA for analysis or other processing. It is sometimes termed DNA fragmentation, though this term is used for other procedures as well. In a restriction digest, DNA molecules are cleaved at specific restriction sites of 4 12 nucleotides in length by use of restriction enzymes which recognize these sequences. The resulting digested DNA is very often selectively amplified using polymerase chain reaction (PCR), making it more suitable for analytical techniques such as agarose gel electrophoresis, and chromatography. It is used in genetic fingerprinting, plasmid subcloning, and RFLP analysis.
Шектеу орны
Берілген шектеу ферменті белгілі бір нуклеотидтік тізбектегі ДНК сегменттерін, шектеу орны деп аталатын жерде кесіп тастайды. Бұл тану тізбектері әдетте төрт, алты, сегіз, он немесе он екі нуклеотидтен тұрады және көбінесе палиндромды болады (яғни 5'–3' бағытындағы нуклеотидтік тізбек бірдей). ДНК құрамындағы төрт нуклеотидтің (аденин, тимин, гуанин және цитозин) төрттен он екі нуклеотидтік тізбекке орналасуының көптеген мүмкіндіктері болғандықтан, тану тізбектері кез келген ұзын тізбекте кездейсоқ түрде кездеседі. Жүздеген түрлі тізбектерге тән шектеу ферменттері анықталып, зертханаларға сату үшін синтезделген. Соның салдарынан, кез келген хромосомадағы кез келген генде немесе қызығушылық тудыратын локуста бірнеше потенциалды "шектеу орындары" пайда болады. Бұдан өзге, жасанды плазмидтердің барлығында (көбінесе толық синтетикалық) полилинкер (немесе "көптік клондау орны") болады, ол ДНК-ның өте қысқа сегментінде ондаған шектеу ферментінің тану тізбектерін қамтиды. Бұл плазмидтік векторларға ДНК-ның кез келген нақты фрагментін енгізуге мүмкіндік береді, оны репликацияланатын бактериялық жасушаларға енгізу арқылы тиімді "клондауға" болады. Шешілімнен кейін ДНК агароза гельдік электрофорез арқылы талдауға жарамды. Гельдік электрофорез кезінде ДНК үлгісі алдымен агароза геліне "жүктелген" (әдетте, гельдің бір шетіндегі кішкентай ұңғымаларға пипеткамен салынады). Гель электр өрісіне ұшыратылады, ол теріс зарядталған ДНК-ны өзіне қарай тартады. Молекулалар өздерінің таза зарядына (құрамындағы заряд мөлшері жоғары бөлшектер одан әрі жүреді) және мөлшеріне (кішкентай бөлшектер одан әрі жүреді) байланысты әртүрлі жылдамдықпен қозғалады (соның салдарынан олар әртүрлі қашықтықта тоқтайды). Төрт нуклеотидтік базаның ешқайсысы зарядталмағандықтан, таза зарядтың маңызы жоқ, ал мөлшері гель арқылы диффузия жылдамдығына әсер ететін басты фактор болып табылады. ДНК-дағы таза заряд қант-фосфат тірекшесі арқылы пайда болады. Бұл ақуыздардан өзгеше, онда "тірекше" болмайды және таза заряд зарядталған аминқышқылдарының әртүрлі комбинациялары мен санынан туындайды.
A given restriction enzyme cuts DNA segments within a specific nucleotide sequence, at what is called a restriction site. These recognition sequences are typically four, six, eight, ten, or twelve nucleotides long and generally palindromic (i. e. the same nucleotide sequence in the 5' – 3' direction). Because there are only so many ways to arrange the four nucleotides that compose DNA (Adenine, Thymine, Guanine and Cytosine) into a four to twelve nucleotide sequence, recognition sequences tend to occur by chance in any long sequence. Restriction enzymes specific to hundreds of distinct sequences have been identified and synthesized for sale to laboratories, and as a result, several potential "restriction sites" appear in almost any gene or locus of interest on any chromosome. Furthermore, almost all artificial plasmids include a (often entirely synthetic) polylinker (also called "multiple cloning site") that contains dozens of restriction enzyme recognition sequences within a very short segment of DNA. This allows the insertion of almost any specific fragment of DNA into plasmid vectors, which can be efficiently "cloned" by insertion into replicating bacterial cells. After restriction digest, DNA can then be analysed using agarose gel electrophoresis. In gel electrophoresis, a sample of DNA is first "loaded" onto a slab of agarose gel (literally pipetted into small wells at one end of the slab). The gel is then subjected to an electric field, which draws the negatively charged DNA across it. The molecules travel at different rates (and therefore end up at different distances) depending on their net charge (more highly charged particles travel further), and size (smaller particles travel further). Since none of the four nucleotide bases carry any charge, net charge becomes insignificant and size is the main factor affecting rate of diffusion through the gel. Net charge in DNA is produced by the sugar phosphate backbone. This is in contrast to proteins, in which there is no "backbone", and net charge is generated by different combinations and numbers of charged amino acids.
Әртүрлі рестрикциялық ферменттер
Рестрикциялық ферменттердің көптеген түрлері бар, олардың әрқайсысы ДНК-ны әртүрлі кеседі. Көбінесе қолданылатын рестрикциялық ферменттер – II типті рестрикциялық эндонуклеазалар (мысалы, рестрикциялық ферменттер туралы мақаланы қараңыз). Кейбіреулері үш базалық жұп тізбегін кессе, ал басқалары төрт, алты, тіпті сегізін кесуі мүмкін. Әрбір ферменттің өзіне тән қасиеттері бар, олар оның қандай жағдайда және қаншалықты тиімді кесуін анықтайды. Мұндай ферменттерді өндіретін көптеген өндірушілер көбінесе ферменттің мүмкіндігінше тиімді кесуіне көмектесетін катиондар мен басқа компоненттердің бірегей қоспасын қамтитын арнайы буферлік ерітінді ұсынады. Әртүрлі рестрикциялық ферменттердің жұмыс істейтін оңтайлы температуралары да әр түрлі болуы мүмкін. ДНК-ны тиімді қорыту үшін рестрикциялық орын ДНК фрагментінің өте соңында орналаспауы керек. Рестрикциялық ферменттердің тиімді жұмыс істеуі үшін рестрикциялық орын мен ДНК соңы арасындағы базалық жұптардың белгілі бір ең аз саны болуы керек. Бұл сан ферменттер арасында өзгеше болуы мүмкін, бірақ көбінесе қолданылатын рестрикциялық ферменттер үшін шамамен 6–10 базалық жұп жеткілікті.
There are numerous types of restriction enzymes, each of which will cut DNA differently. Most commonly used restriction enzymes are Type II restriction endonuclease (See article on Restriction enzymes for examples). There are some that cut a three base pair sequence while others can cut four, six, and even eight. Each enzyme has distinct properties that determine how efficiently it can cut and under what conditions. Most manufacturers that produce such enzymes will often provide a specific buffer solution that contains the unique mix of cations and other components that aid the enzyme in cutting as efficiently as possible. Different restriction enzymes may also have different optimal temperatures under which they function. Note that for efficient digest of DNA, the restriction site should not be located at the very end of a DNA fragment. The restriction enzymes may require a minimum number of base pairs between the restriction site and the end of the DNA for the enzyme to work efficiently. This number may vary between enzymes, but for most commonly used restriction enzymes around 6–10 base pair is sufficient.