Кіріспе
Фотохимиялық энергияны беру механизмі
Фёрстер резонанстық энергияны беру (FRET), флуоресценттік резонанстық энергияны беру, резонанстық энергияны беру (RET) немесе электрондық энергияны беру (EET) – екі жарыққа сезімтал молекула (хромофорлар) арасындағы энергияны беруді сипаттайтын механизм. Электронды қозған күйдегі донорлық хромофор, радиациялық емес диполь-дипольді байланыс арқылы энергияны акцепторлық хромофорға беруі мүмкін. Бұл энергияны беру тиімділігі донор мен акцептор арасындағы қашықтықтың алтыншы дәрежесіне кері пропорционал, бұл FRET-ті қашықтықтағы ең кішкентай өзгерістерге де өте сезімтал етеді. FRET тиімділігінің өлшемі екі флюорофордың бір-біріне белгілі бір қашықтықта орналасқандығын анықтау үшін қолданылуы мүмкін. Мұндай өлшемдер биология және химия сияқты салаларда зерттеу құралы ретінде пайдаланылады. FRET, жақын өріс байланысына ұқсас, себебі өзара әрекеттесу радиусы шығарылатын жарық толқынының ұзындығынан әлдеқайда кіші. Жақын өріс аймағында, қозған хромофор виртуалды фотондарды шығарады, оларды қабылдаушы хромофорлар дереу сіңіріп алады. Бұл виртуалды фотондарды байқау мүмкін емес, өйткені олардың болуы энергия мен импульстің сақталу заңын бұзады, сондықтан FRET сәуле шығармайтын механизм ретінде танымал. Кванттық электродинамикалық есептеулер, сәуле шығармайтын (FRET) және сәулелі энергияны берудің, бір бірыңғай механизмнің қысқа және ұзақ аралық асимптоталары екенін анықтауға қолданылды.
FRET теориясының эксперименттік расталуы
Форстер резонанстық энергиясының кері алтыншы дәрежеге қашықтыққа тәуелділігі Уилчек, Эдельхох және Брандтың триптофил пептидтерін пайдалану арқылы тәжірибелік түрде расталды. Stryer, Haugland және Yguerabide.
FRET тиімділігін өлшеу әдістері
Флуоресценттік микроскопияда, флуоресценттік конфокалды лазерлік сканерлеу микроскопиясында, сондай-ақ молекулалық биологияда FRET биофизика және биохимиядағы молекулалық динамиканы, мысалы, ақуыз-ақуыз өзара әрекеттесуі, ақуыз-ДНК өзара әрекеттесуі және ақуыздың конформациялық өзгерістерін сандық бағалау үшін пайдалы құрал болып табылады. Екі молекула арасындағы кешеннің қалыптасуын бақылау үшін олардың біреуі донормен, екіншісі акцептормен белгіленеді. FRET тиімділігі өлшеніп, белгіленген кешендер арасындағы өзара әрекеттесуді анықтау үшін қолданылады. Донор немесе акцептордың шығаратын флуоресценциясының өзгеруін бақылау арқылы FRET тиімділігін өлшеудің бірнеше тәсілі бар.
Сезімталданған эмиссия
FRET тиімділігін өлшеудің бір әдісі – акцептордың эмиссиялық қарқындылығының өзгеруін өлшеу болып табылады. Уақыт константаларын алу үшін нүктелердің толық қисығын пайдалану, оған басқа әдістерге қарағанда жоғары дәлдік беруі мүмкін. Сонымен қатар, уақыт өлшемдері наносекундтар емес, секундтарда жүргізілетіндіктен, флуоресценцияның өмір сүру ұзақтығын өлшеуге қарағанда оңайырақ, және фотоағартудың ыдырау жылдамдығы, әдетте, донор концентрациясына тәуелді емес (егер акцептор қанығуы болмаса), сондықтан интенсивтілік өлшемдері үшін қажетті концентрацияны қатаң бақылау қажеттілігі туындамайды. Дегенмен, акцепторлы және акцепторсыз өлшемдер үшін жарықтандыру шамасын бірдей ұстау маңызды, себебі фотоағарту күшті жарық әсерінен айтарлықтай күшейеді.
Өмір бойына өлшеу
FRET тиімділігін донордың флуоресценция ұзақтығының өзгеруі арқылы да анықтауға болады. Екеуі де жасыл флуоресцентті ақуыздың (GFP) түсті варианттары. Органикалық флуоресцентті бояулармен белгілеу тазарту, химиялық өзгерту және қабылдаушы ақуызды жасуша ішіне енгізуді қажет етеді. GFP варианттарын генетикалық инженерия арқылы қабылдаушы ақуызға қосу ыңғайлырақ болуы мүмкін. Сонымен қатар, протеазамен кесілетін тізбек арқылы байланысқан CFP және YFP ("тандемді димер") қосылысын кесу сынағы ретінде қолдануға болады.
BRET
Флюорофор донорларымен жүзеге асырылатын FRET-тің шектеулерінің бірі – флюоресценция беруді бастау үшін сыртқы жарықтандыру қажеттілігі болып табылады, бұл акцептордың тікелей қоздырылуынан немесе фотоағартудан туындаған нәтижелерде фондық шуға алып келуі мүмкін. Бұл кемшіліктің алдын алу үшін биолюминесценттік резонанстық энергия беру (немесе BRET) әзірленді. Бұл техника YFP-мен үйлесімді бастапқы фотон шығарылымын жасау үшін CFP орнына биолюминесцентті люциферазаны (әдетте Renilla reniformis люциферазасы) пайдаланады. BRET сондай-ақ терең теңіз креветкасы Oplophorus gracilirostris-тен алынған, өзге люцифераза ферментін қолдану арқылы іске асырылды. Бұл люцифераза кішірек (19 кД) және Renilla reniformis-тен алынған, көбірек қолданылатын люциферазадан жарқырап тұрады, сондықтан оны NanoLuc немесе NanoKAZ деп атады. Promega компаниясы NanoLuc үшін патенттелген фуримазин деп аталатын субстратты әзірледі. Promega компаниясы әзірлеген NanoLuc-тың бөлінген нұсқасы да ақуыз-ақуыз өзара әрекеттесуін өлшейтін тәжірибелерде BRET доноры ретінде қолданылды.
Хомо-ФРЭТ
Жалпы алғанда, "FRET" донор және акцептор ақуыздарының (немесе "флюорофорлардың") екі түрлі типте болған жағдайларды білдіреді. Алайда, көптеген биологиялық жағдайларда зерттеушілерге бір типтегі екі немесе одан да көп ақуыздың өзара әрекеттесуін, немесе тіпті бір ақуыздың өзімен-өзінің әрекеттесуін зерттеу қажет болуы мүмкін – мысалы, егер ақуыз бүктеліп, немесе ақуыз полимерлік тізбектің бір бөлігін құраса, немесе биологиялық жасушаларда немесе in vitro эксперименттерде сандық мәліметтерді алу үшін. Әрине, акцептор және донор ақуыздары бірдей толқын ұзындығында жарық шығаратындықтан, спектральдік айырмашылықтар FRET-ті анықтау және өлшеу үшін қолданылмайды. Дегенмен, зерттеушілер флюорофорларды қоздыратын жарық пен сәуле шығару арасындағы поляризацияның өзгешелігін FRET анизотропиялық бейнелеу деп аталатын әдіс арқылы анықтай алады; сандық анизотропия деңгейі (қоздыру және эмиссия сәулелерінің поляризациясы арасындағы айырмашылық) FRET оқиғаларының санына қатысты маңызды мәліметтер береді. Нанофотоника саласында FRET экситондық энергияны ақаулы жерлерге бағыттап, зиянды болуы мүмкін, бірақ органикалық және кванттық нүктелерге сезімтал күн элементтерінде зарядты жинау үшін де маңызды. Сондай-ақ, әртүрлі оптоэлектрондық құрылғылар үшін FRET-ті қолданатын әртүрлі стратегиялар ұсынылған. Осыған байланысты, оқшауланған наноэмиттерлердің тығыз қабатқа жиналғанда қалай әрекет ететінін түсіну өте маңызды. Наножапырақтар, әсіресе, жазықтықтағы күшті дипольдік жұпталуы және төменгі Стокс ығысуының арқасында, күшті гомо FRET экситондық диффузиясы үшін ең перспективті кандидаттар болып табылады. Мұндай бір тізбекті флуоресценциялық микроскопиялық зерттеулер FRET арқылы көрші жапырақтар арасындағы энергияның шамамен 500 нм ұзындықта (шамамен 80 наноэмиттер) диффузиялайтынын және жапырақтар арасындағы энергияның берілу уақыты 1 пс шамасында екенін көрсетті.
Басқалар
Флуоресцентті ақуыздардан өзге әртүрлі қосылыстар.
Қолданбалар
Флуоресценттік резонанстық энергияны беру (ФРЭТ) соңғы 25 жылда зор өркендеді және бұл техника көптеген биологиялық және биофизикалық салаларда маңызды құралға айналды. ФРЭТ қашықтықты өлшеуге және түрлі жүйелердегі молекулалық өзара әрекеттесулерді анықтауға спектроскопиялық өлшегіш ретінде қолданылады, сондай-ақ биология және биохимия салаларында да қолданыс табады.
Белсенділер
FRET жиі ақуыздар арасындағы өзара әрекеттесуді анықтау және қадағалау үшін қолданылады. Сонымен қатар, FRET бір ақуыздың ішіндегі домендер арасындағы қашықтықты өлшеу үшін де қолданылады, мұнда ақуыздың әртүрлі аймақтары флюорофорлармен белгіленеді және қашықтықты анықтау үшін эмиссия өлшенеді. Бұл ақуыздың конформациясы туралы, соның ішінде екіншілік құрылымдары мен бүктелуі туралы ақпарат береді. Бұл, сондай-ақ, миозиннің активтілігімен байланысты конформациялық өзгерістер сияқты ақуыз құрылымындағы функционалдық өзгерістерді қадағалауға мүмкіндік береді. In vivo жағдайында қолданылған FRET жасушалық құрылымдардың орналасуын және интегралдар мен мембраналық ақуыздарды қоса алғандағы өзара әрекеттесуін анықтауға пайдаланылды.
Мембраналар
FRET мембрананың сұйықтығын, мембраналық ақуыздардың қозғалысын және таралуын, мембраналық липид-ақуыз және ақуыз-ақуыз өзара әрекеттесуін, сондай-ақ әртүрлі мембраналардың табысты араласуын бақылау үшін пайдаланылуы мүмкін. FRET жасуша мембраналарындағы мембраналық домендер мен липидтік рафтардың қалыптасуын және қасиеттерін зерттеуге, мембраналардағы беттік тығыздықты анықтауға да қолданылады.
Химиялық сенсор
FRET-ке негізделген зондтар әртүрлі молекулалардың болуын анықтай алады: зондтың құрылымы кішкентай молекулалардың байланысуы немесе активтілігі арқылы өзгереді, бұл FRET жүйесін іске қосуға немесе тоқтатуға мүмкіндік береді. Бұл әдетте аниондарды, катиондарды, зарядталмаған кішкентай молекулаларды, сондай-ақ кейбір ірі биомакромолекулаларды анықтау үшін қолданылады. Сол сияқты, pH, гипоксия немесе митохондриялық мембраналық потенциал сияқты факторларға байланысты жасушалық ортадағы өзгерістерді анықтау үшін де FRET жүйелері жасалған.
Сигнал беру жолдары
FRET-тің тағы бір қолданылуы – метаболизмдік немесе сигналдық жолдарды зерттеуде. Мысалы, FRET және BRET түрлі эксперименттерде G протеинмен байланысқан рецепторлардың белсендірілуін және одан туындайтын сигнал беру механизмдерін анықтау үшін пайдаланылған. Басқа мысалдарға FRET-ті бактериялық хемотаксис және апоптоздағы каспаза активтілігі сияқты алуан түрлі процестерді талдау үшін қолдану кіреді.
Белоктар мен нуклеотидтердің бүлу кинетикасы
Ақуыздар, ДНҚ, РНК және басқа полимерлердің бүктелу динамикасы ФРЕТ (FRET) әдісімен өлшенген. Көбінесе, мұндай жүйелер тепе-теңдік күйде болады, олардың кинетикасы байқауға келмейді. Дегенмен, молекулаларға акцептор және донор бояғыштарын дұрыс орналастырып, бір молекулалық ФРЕТ (FRET) өлшеу арқылы оларды өлшеу мүмкін. Толыққанды сипаттама үшін бір молекулалық ФРЕТ (FRET) туралы қараңыз.
Басқа қолданбалар
Жоғарыда айтылған қолданыстардан өзге, FRET және BRET биохимиялық реакциялардың кинетикасын зерттеуде де тиімді. FRET pH-қа тәуелді жиналу және ыдырауды қадағалау үшін жиі қолданылады және нуклеин қышқылдарын қаптауды талдау үшін құнды. Бұл техника әртүрлі нанобөлшектердің қалыптасуына әсер ететін факторларды, сондай-ақ нанодәрілердің механизмдері мен әсерлерін анықтауға мүмкіндік береді.
Басқа әдістер
Басқа, бірақ байланысты механизм – Декстер электронды трансфері. Белок-белок жақындығын анықтаудың тағы бір әдісі – бимолекулалық флуоресценциялық толықтыру (BiFC), онда флуоресцентті белоктың екі бөлігі басқа белоктарға қосылады. Бұл екі бөлік кездескенде, олар минуттар немесе сағаттар ішінде флуорофор құрайды.