Введение

Фотохимический механизм передачи энергии

Передача энергии резонансом Форстера (FRET), флуоресцентная резонансная передача энергии, резонансная передача энергии (RET) или электронная передача энергии (EET) – это механизм, описывающий передачу энергии между двумя светочувствительными молекулами (хромофорами). Донорный хромофор, изначально находящийся в электронно-возбужденном состоянии, может передавать энергию акцепторному хромофору посредством нерадиационного диполь-дипольного взаимодействия. Эффективность этой передачи энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором, что делает FRET чрезвычайно чувствительным к малейшим изменениям расстояния. Измерения эффективности FRET могут использоваться для определения, находятся ли два флюорофора на определенном расстоянии друг от друга. Такие измерения применяются в качестве исследовательского инструмента в областях, таких как биология и химия. FRET аналогичен ближнепольной связи, поскольку радиус взаимодействия значительно меньше длины волны излучаемого света. В ближней зоне возбужденный хромофор излучает виртуальный фотон, который мгновенно поглощается акцепторным хромофором. Эти виртуальные фотоны необнаружимы, поскольку их существование нарушает законы сохранения энергии и импульса, поэтому FRET известен как механизм без излучения. Квантовоэлектродинамические расчеты показали, что передача энергии без излучения (FRET) и с излучением являются ближними и дальними асимптотами единого унифицированного механизма.

Экспериментальное подтверждение теории FRET

Обратная зависимость от расстояния в шестой степени для переноса энергии резонанса Форстера была экспериментально подтверждена Уилчеком, Эдельхохом и Брендом с использованием триптофильных пептидов. Страйер, Хаугланд и Игуерабиде.

Методы измерения эффективности FRET

В флуоресцентной микроскопии, конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии, а также в молекулярной биологии, FRET является полезным инструментом для количественной оценки молекулярной динамики в биофизике и биохимии, например, белок-белковых взаимодействий, взаимодействий белка с ДНК и изменений конформации белка. Для отслеживания образования комплекса между двумя молекулами одна из них маркируется донором, а другая – акцептором. Эффективность FRET измеряется и используется для определения взаимодействий между помеченными комплексами. Существует несколько методов измерения эффективности FRET путем мониторинга изменений флуоресценции, испускаемой донором или акцептором.

Чувствительная эмиссия

Один из методов измерения эффективности FRET — измерение изменения интенсивности эмиссии акцептора. Использование целой кривой данных для определения констант времени может обеспечить более высокую точность по сравнению с другими методами. Кроме того, тот факт, что измерения времени проводятся в секундах, а не в наносекундах, делает этот метод проще, чем измерения времени жизни флуоресценции, и поскольку скорость фотообесцвечивания обычно не зависит от концентрации донора (если только не происходит насыщение акцептора), тщательный контроль концентраций, необходимый для измерений интенсивности, не требуется. Тем не менее, важно поддерживать одинаковую интенсивность освещения при измерениях с акцептором и без него, поскольку фотообесцвечивание значительно усиливается при более интенсивном падающем свете.

Измерения на протяжении всего срока службы

Эффективность FRET также может быть определена по изменению времени жизни флуоресценции донора. Оба являются цветовыми вариантами зеленого флуоресцентного белка (GFP). Маркировка органическими флуоресцентными красителями требует очистки, химической модификации и внутриклеточного введения белка-хозяина. Варианты GFP могут быть присоединены к белку-хозяину с помощью генетической инженерии, что может быть более удобным. Кроме того, для проведения анализа расщепления можно использовать слияние CFP и YFP ("тандемный димер"), соединенное последовательностью, распознаваемой протеазой.

БРЭТ

Ограничением FRET с использованием флюорофорных доноров является необходимость внешнего освещения для запуска передачи флуоресценции, что может приводить к фоновому шуму из-за прямого возбуждения акцептора или к фотовыцветанию. Для преодоления этого недостатка была разработана биолюминесцентная резонансная передача энергии (или BRET). В этой технике используется биолюминесцентная люцифераза (обычно люцифераза из *Renilla reniformis*) вместо CFP для генерации первичного фотонного излучения, совместимого с YFP. BRET также был реализован с использованием другого фермента люциферазы, сконструированного из глубоководной креветки *Oplophorus gracilirostris*. Эта люцифераза меньше (19 кД) и ярче, чем более распространенная люцифераза из *Renilla reniformis*, и получила название NanoLuc или NanoKAZ. Компания Promega разработала запатентованный субстрат для NanoLuc – фуримазин. Разделенная белковая версия NanoLuc, разработанная Promega, также использовалась в качестве донора BRET в экспериментах по измерению белок-белковых взаимодействий.

Homo-FRET

В целом, "FRET" относится к ситуациям, когда донорные и акцепторные белки (или "флуорофоры") являются двух разных типов. Однако во многих биологических ситуациях исследователям может потребоваться изучить взаимодействие между двумя или более белками одного типа, или даже одного и того же белка с самим собой, например, если белок сворачивается или образует часть полимерной цепи белков, или для других задач количественной оценки в биологических клетках или в экспериментах in vitro. Очевидно, что спектральные различия не могут быть использованы для обнаружения и измерения FRET, поскольку как акцепторный, так и донорный белки излучают свет с одинаковыми длинами волн. Тем не менее, исследователи могут обнаружить различия в поляризации между светом, возбуждающим флуорофоры, и излучаемым светом, используя метод, называемый визуализацией анизотропии FRET; уровень количественной анизотропии (разница в поляризации между возбуждающим и излучающим пучками) становится показателем количества произошедших событий FRET. В области нанофотоники FRET может быть нежелательным, если он направляет экситонную энергию к дефектным участкам, но также важен для сбора заряда в органических и квантово-сенсибилизированных солнечных элементах, и различные стратегии, использующие FRET, были предложены для различных оптоэлектронных устройств. Поэтому необходимо понимать, как ведут себя изолированные наноизлучатели при укладке в плотный слой. Нанопластины особенно перспективны для эффективной диффузии экситона при гомо-FRET благодаря их сильному дипольному взаимодействию в плоскости и малому сдвигу Стокса. Исследование таких одиночных цепей с помощью флуоресцентной микроскопии показало, что передача энергии посредством FRET между соседними пластинами приводит к диффузии энергии на типичную длину 500 нм (около 80 наноизлучателей), а время передачи между пластинами составляет порядка 1 пс.

Другие

Различные соединения, помимо флуоресцентных белков.

Приложения

За последние 25 лет область применения флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) значительно расширилась, и эта методика стала незаменимой во многих биологических и биофизических областях. FRET можно использовать как спектроскопический линейный индикатор для измерения расстояний и выявления молекулярных взаимодействий в различных системах, и он находит применение в биологии и биохимии.

Белки

FRET часто используется для обнаружения и отслеживания взаимодействий между белками. Кроме того, FRET может быть использован для измерения расстояний между доменами в пределах одной молекулы белка, путем маркировки различных участков белка флюорофорами и измерения интенсивности излучения для определения расстояния. Это позволяет получить информацию о конформации белка, включая вторичную структуру и его сворачивание. Этот подход применим и для отслеживания функциональных изменений в структуре белка, таких как конформационные изменения, связанные с активностью миозина. При использовании in vivo, FRET применялся для определения локализации и взаимодействий клеточных структур, включая интегралины и мембранные белки.

Мембраны

FRET может использоваться для наблюдения за текучестью мембран, перемещением и рассеиванием мембранных белков, взаимодействием между липидами и белками, а также между белками, и успешным смешением различных мембран. FRET также применяется для изучения формирования и свойств мембранных доменов и липидных плотов в клеточных мембранах, а также для определения поверхностной плотности в мембранах.

Химиодатчик

Зонды на основе FRET могут обнаруживать присутствие различных молекул: на структуру зонда влияет связывание или активность малых молекул, что может активировать или деактивировать систему FRET. Это часто используется для обнаружения анионов, катионов, небольших незаряженных молекул, а также некоторых более крупных биомакромолекул. Аналогично, системы FRET были разработаны для обнаружения изменений в клеточной среде, вызванных такими факторами, как pH, гипоксия или потенциал митохондриальной мембраны.

Сигнальные пути

Еще одно применение FRET – изучение метаболических или сигнальных путей. Например, FRET и BRET использовались в различных экспериментах для характеристики активации G-белок-связанных рецепторов и последующих сигнальных механизмов. Другие примеры включают использование FRET для анализа таких разнообразных процессов, как бактериальный хемотаксис и активность каспаз при апоптозе.

Кинетики складывания белков и нуклеотидов

Динамика сворачивания белков, ДНК, РНК и других полимеров изучается с помощью FRET. Как правило, эти системы находятся в равновесии, что скрывает их кинетику. Однако кинетику можно измерить, проводя измерения FRET на отдельных молекулах при правильном расположении акцепторного и донорного флуорофоров на молекулах. Подробное описание см. в разделе, посвященном FRET на отдельных молекулах.

Другие применения

В дополнение к ранее упомянутым распространенным применениям, FRET и BRET также эффективно используются для изучения кинетики биохимических реакций. FRET все шире применяется для мониторинга pH-зависимой сборки и диссоциации, а также является ценным инструментом в анализе инкапсуляции нуклеиновых кислот. С помощью этой техники можно определять факторы, влияющие на формирование различных типов наночастиц, а также механизмы и эффекты нанолекарств.

Другие методы

Другой, но связанный механизм – перенос электрона Декстера. Альтернативный метод определения близости белков – бимолекулярная флуоресцентная комплементация (BiFC), при которой к другим белкам присоединяются две части флуоресцентного белка. Когда эти две части встречаются, они формируют флуорофор в течение минут или часов.