Кіріспе
Ферменттер класы
Нитрогенездер – цианобактериялар (көк жасыл бактериялар) және ризобактериялар сияқты белгілі бір бактериялар өндіретін ферменттер. Бұл ферменттер азотты (N2) аммиакқа (NH3) тотығу процесіне жауапты. Нитрогенездер – азотты бекіту процесінің бір қадамы болып табылатын осы реакцияны катализдейтін жалғыз ферменттер отбасы болып табылады. Азотты бекіту – барлық тіршілік формалары үшін қажетті, себебі азот өсімдіктер, жануарлар және басқа да организмдерді құрайтын молекулалардың (нуклеотидтер, аминқышқылдары) биосинтезі үшін өте маңызды. Олар Nif гендері немесе гомологтары арқылы кодталады. Олар протохлорофиллид редуктазамен байланысты.
Редуктаза
Fe ақуызы, динитрогеназа редуктазасы немесе NifH, бірдей кішібірліктерден тұратын димер болып табылады, онда бір [Fe4S4] кластері бар және шамамен 60-64 кДа массасы бар. Fe ақуызының функциясы – ферредоксин немесе флаводоксин сияқты тотықтырғыш заттан нитрогеназа ақуызына электрондарды беру. Электрондарды беру үшін АТФ-тың байланысуы және гидролизінен алынатын химиялық энергия қажет. АТФ гидролизі сонымен қатар нитрогеназа комплексінде конформациялық өзгеріске әкеледі, бұл Fe ақуызы мен MoFe ақуызын жақындатып, электронды оңай беруге мүмкіндік береді.
Нитрогеназа
MoFe ақуызы – шамамен 240-250 кДа массасы бар екі α-қосалқы бірлік және екі β-қосалқы бірліктен тұратын гетеротетрамер. (Басқа ферменттердегі молибден әдетте молибдоптеринмен толық окистенген Mo(VI) түрінде байланысады.) P кластерінің ядросы (Fe8S7) орталық күкірт атомымен байланысқан екі [Fe4S3] куб түрінде болады. Әрбір P кластері MoFe ақуызына алты цистеин қалдығы арқылы байланысады. Әрбір FeMo кофакторы (Fe7MoS9C) үш сульфид ионымен байланысқан екі өзгеше емес кластерден тұрады: [Fe4S3] және [MoFe3S3]. Әрбір FeMo кофакторы бір цистеин және бір гистидин қалдығы арқылы ақуыздың α-қосалқы бірлігімен ковалентті байланысқан. Fe ақуызынан түсетін электрондар P кластерлері арқылы MoFe ақуызына өтеді, содан кейін электрондар FeMo кофакторларына беріледі. Әрбір FeMo кофакторы азотты бекіту орны ретінде қызмет етеді, N2 кофактордың орталық қуысына байланысады.
Вариациялар
MoFe ақуызы Mo кофакторы аз жағдайда балама азот бекіту ферменттерімен алмастырылуы мүмкін. Мұндай азот бекіту ферменттерінің екі түрі белгілі: ванадий-темір (VFe; Vnf) және темір-темір (FeFe; Anf) түрлері. Екеуі де екі α, екі β және екі δ (кейде γ) кішібөлімшелерінен тұрады. Дельта кішібөлімшелері бір-біріне гомологты, ал альфа және бета кішібөлімшелері MoFe азот бекіту ферментінде кездесетіндерге гомологты. Ген кластерлері де гомологты, және осы кішібөлімшелер белгілі бір деңгейде алмастырыла алады. Барлық азот бекіту ферменттері ұқсас Fe S ядролық кластерін пайдаланады, ал айырмашылықтар кофактор металдарында болады. Azotobacter vinelandii-дегі Anf азот бекіту ферменті anfHDGKOR оперонында ұйымдастырылған. Бұл оперонның жұмыс істеуі үшін әлі де кейбір Nif гендері қажет. Осы қосымша қажетті гендерді қамтитын ең кем дегенде 10 гендік оперон жасалды.
Жалпы механизм
Нитрогеназа – азотты бекітуге катализаторлық әрекет ететін фермент, ол азотты (N2) аммиакқа (NH3) тотығуын қамтамасыз етеді және Жердегі тіршілікті сақтауда маңызды рөл атқарады. Әртүрлі азотты бекітетін бактерияларда нитрогеназаның үш түрі кездеседі: молибден (Mo) нитрогеназасы, ванадий (V) нитрогеназасы және тек темір (Fe) нитрогеназасы. Молибден нитрогеназасы, мысалы, бұршақ тұқымдас өсімдіктермен байланысты ризобиялар сияқты диазотрофтарда табылса, ең көп зерттелген және жақсы сипатталған нитрогеназа болып табылады. 1- және 2-теңдеулер тиісінше молибден және ванадий нитрогеназаларында азотты бекітудің теңдестірілген реакцияларын көрсетеді. Барлық нитрогеназалар екі компонентті жүйелер болып табылады, олар I компоненттен (сонымен қатар динитрогеназа деп аталады) және II компоненттен (сонымен қатар динитрогеназа редуктазасы деп аталады) тұрады. I компонент – молибден нитрогеназасында MoFe ақуызы, ванадий нитрогеназасында VFe ақуызы, ал тек темір нитрогеназасында Fe ақуызы болып табылады. Катализ кезінде 2 эквивалент MgATP гидролизденеді, бұл FeS кластерінің және P кластерінің тотығуын төмендетуге, содан кейін FeMo кофакторына көмектеседі, онда N2 аммиакқа (NH3) дейін тотығып өтеді.
Лоу-Торнли кинетикалық моделі
Азоттың екі молекула аммиакқа дейін тотығу-тотықсыздануы I компоненттің FeMo кофакторында II компоненттен протон және электрон эквиваленттерінің біртіндеп қосылуынан кейін жүзеге асырылады. Осы тәжірибелердің нәтижесінде Лоу Торнли (LT) кинетикалық моделі жасалды, ол реакция кезінде қажетті сегіз байланысты протон мен электрон алмасуды көрсетеді.
E0-ден E4-ке дейінгі аралық заттар
Бұл аралық заттардың спектроскопиялық сипаттамалары азотты нитрогеназамен азайтуды жақсырақ түсінуге мүмкіндік берді, алайда бұл механизм зерттеу мен пікірталастың белсенді саласы болып қала береді. Азот қосылғанға дейін аралық заттардың спектроскопиялық эксперименттері қысқаша төменде келтірілген: E0 – Бұл катализ басталғанға дейін ферменттің тынығу күйі. EPR сипаттамалары бұл түрдің спині 3/2 екенін көрсетеді. E1 – Бір электронды азайтылған аралық зат N2 бойынша айналым кезінде тұтқындалған. Тұтқындалған аралық заттардың Мёссбауэр спектроскопиясы FeMo кофакторының 1-ден үлкен бүтін сан спинін көрсетеді. E2 – Бұл аралық зат металл кластерін тынығу окистену күйінде сақтайды, екі қосылған электрон көпірлік гидридте, ал қосымша протон күкірт атомына қосылған. Мутацияланған ферменттердегі осы аралық заттың оқшаулануы FeMo кофакторының жоғары спинді және 3/2 спинді екенін көрсетеді. E3 – Бұл аралық зат бір көпірлік гидрид пен бір гидридті біріктіріп, бір рет реттелген FeMo ко болып ұсынылады. Бұл модификация FeMo кофакторына субстраттың кіруіне кедергі келтіреді. Бұл оқшауланған аралықтың EPR сипаттамалары 1/2 спині бар жаңа түрді көрсетеді. ENDOR эксперименттері осы аралықтың құрылымына түсінік берді, екі көпірлік гидридтердің болуын көрсетті. 20 °C температурада тұтқындалған аралық заттың криоэкзеңкеленуі релаксация кезінде екі сутегі эквивалентінің бірінен соң бірі жоғалуына әкеледі, бұл оқшауланған аралық заттың E4 күйіне сәйкес келетінін дәлелдейді. Дистальды жолда терминал азот алдымен гидрогенизацияланады, аммиак бөлінеді, содан кейін металға тікелей байланған азот гидрогенизацияланады. Бір-бірімен ауыспалы жолмен бір сутегі терминал азотқа, содан кейін бір сутегі металға тікелей байланған азотқа қосады. Аммиак шығарылғанға дейін бұл реттілік жалғасады, сондай-ақ ауыспалы жолда диазен мен гидразин пайда болады. Дистальды жолды нақты қолдау негізінен Шрок пен Чатт жұмысынан туындады, олар Моны модельдік кешендегі металл орталығы ретінде пайдаланып, нитридо кешенін сәтті оқшаулады. Баламалы жолды нақты қолдауға негіз болған бірнеше зерттеулер бар. Темірден ғана тұратын модель кластерлері N2-ні катализаторлық түрде азайтатыны дәлелденді. Вандий нитрогеназасы гидразинді, ауыспалы механизмге тән аралық затты бөліп шығарады. Алайда, жергілікті ферменттің өзінде сипатталған аралық заттардың болмауы екі жолдың да нақты дәлелденбегенін білдіреді. Бұдан басқа, есептеу зерттеулері реакция орнының Mo (дистальды) немесе Fe (алмасу) MoFe кофакторында болғанына байланысты екі жақты да қолдайтыны анықталды. MgATP фосфат топтары мен Fe ақуыздың амин қышқылдары қалдықтарының арасындағы байланысу өзара әрекеттесулері ұқсас ферменттермен салыстырғанда жақсы түсініледі, ал молекуланың қалған бөлігімен өзара әрекеттесулер MgATP байланысқан Fe ақуыз кристалдық құрылымының болмауынан (1996 ж.) туындайды. Үш ақуыз қалдықтарының фосфаттармен елеулі өзара әрекеттесуі анықталды, ал лизин аргининнің орнына ауыстырылған кезде MgATP тұз көпірінің күштілігі себепті байланыса алмайды. 125-орында аспартик қышқылының қажеттілігі осы қалдықтың глютамин қышқылына мутациядан кейін реактивтілігінің өзгеруін байқау арқылы көрсетілді. 16-серин қалдығы MgATP-мен байланысады. Бұл фактіні дәлелдеу үшін сайтқа тән мутагенез қолданылды. MgATP байланысуы сонымен қатар Fe ақуызында маңызды конформациялық өзгерістерді тудырады. Мутанттардағы және жабайы типтегі белоктағы рентген сәулелерін шашырату деректерін салыстыру бүкіл белок MgATP байланысу кезінде шамамен 2,0 Å радиусының төмендеуімен жиырылады деген тұжырымға әкелді. Қысқылтегінің тотықтырғыш қасиеттеріне байланысты азоттанудың көпшілігі диоксигенмен кері бұрылмалы түрде тежеледі, ол Fe S кофакторларын деградациялық тотықтайды. Бұл үшін азотты бекіткіштердің азоттазаны in vivo оттегіден қорғау механизмдері қажет. Бұл проблемаға қарамастан, көптеген адамдар оттегіді тыныс алу үшін соңғы электронды қабылдағыш ретінде пайдаланады. Азотты бекітетін кейбір заттардың, мысалы Azotobacteraceae, аэробтық жағдайларда оттегі лабильді азоттазаны қолдану қабілеті жоғары метаболистік жылдамдыққа байланысты болса да, бұл клетка мембранасындағы оттегі азайтуға мүмкіндік береді, мұндай механизмнің тиімділігі 70 мкм-ден жоғары оттегі концентрациясында (орталық концентрация 230 мкм O2) және қосымша қоректік заттардың шектеулері кезінде күмән тудырады.
E0 – This is the resting state of the enzyme before catalysis begins. EPR characterization shows that this species has a spin of 3/2. E1 – The one electron reduced intermediate has been trapped during turnover under N2. Mӧssbauer spectroscopy of the trapped intermediate indicates that the FeMo co is integer spin greater than 1. E2 – This intermediate is proposed to contain the metal cluster in its resting oxidation state with the two added electrons stored in a bridging hydride and the additional proton bonded to a sulfur atom. Isolation of this intermediate in mutated enzymes shows that the FeMo co is high spin and has a spin of 3/2. E3 – This intermediate is proposed to be the singly reduced FeMo co with one bridging hydride and one hydride. This modification prevents substrate access to the FeMo co. EPR characterization of this isolated intermediate shows a new species with a spin of ½. ENDOR experiments have provided insight into the structure of this intermediate, revealing the presence of two bridging hydrides. Cryoannealing of the trapped intermediate at 20 °C results in the successive loss of two hydrogen equivalents upon relaxation, proving that the isolated intermediate is consistent with the E4 state. In the distal pathway, the terminal nitrogen is hydrogenated first, releases ammonia, then the nitrogen directly bound to the metal is hydrogenated. In the alternating pathway, one hydrogen is added to the terminal nitrogen, then one hydrogen is added to the nitrogen directly bound to the metal. This alternating pattern continues until ammonia is released. and the diazene and hydrazine in the alternating pathway. Specific support for the distal pathway has mainly stemmed from the work of Schrock and Chatt, who successfully isolated the nitrido complex using Mo as the metal center in a model complex. Specific support for the alternating pathway stems from a few studies. Iron only model clusters have been shown to catalytically reduce N2. The vanadium nitrogenase releases hydrazine, an intermediate specific to the alternating mechanism. However, the lack of characterized intermediates in the native enzyme itself means that neither pathway has been definitively proven. Furthermore, computational studies have been found to support both sides, depending on whether the reaction site is assumed to be at Mo (distal) or at Fe (alternating) in the MoFe cofactor. The binding interactions between the MgATP phosphate groups and the amino acid residues of the Fe protein are well understood by comparing to similar enzymes, while the interactions with the rest of the molecule are more elusive due to the lack of a Fe protein crystal structure with MgATP bound (as of 1996). Three protein residues have been shown to have significant interactions with the phosphates. and when the lysine is substituted for an arginine, MgATP cannot bind due to the salt bridge being too strong. The necessity of specifically aspartic acid at site 125 has been shown through noting altered reactivity upon mutation of this residue to glutamic acid. Residue 16, serine, has been shown to bind MgATP. Site specific mutagenesis was used to demonstrate this fact. MgATP binding also induces significant conformational changes within the Fe protein. Comparing X ray scattering data in the mutants versus in the wild type protein led to the conclusion that the entire protein contracts upon MgATP binding, with a decrease in radius of approximately 2.0 Å. Due to the oxidative properties of oxygen, most nitrogenases are irreversibly inhibited by dioxygen, which degradatively oxidizes the Fe S cofactors. This requires mechanisms for nitrogen fixers to protect nitrogenase from oxygen in vivo. Despite this problem, many use oxygen as a terminal electron acceptor for respiration. Although the ability of some nitrogen fixers such as Azotobacteraceae to employ an oxygen labile nitrogenase under aerobic conditions has been attributed to a high metabolic rate, allowing oxygen reduction at the cell membrane, the effectiveness of such a mechanism has been questioned at oxygen concentrations above 70 μM (ambient concentration is 230 μM O2), as well as during additional nutrient limitations.