Введение
Класс ферментов
Нитрогеназы — это ферменты, производимые некоторыми бактериями, такими как цианобактерии (сине-зеленые бактерии) и ризобактерии. Эти ферменты отвечают за восстановление азота (N2) до аммиака (NH3). Нитрогеназы — единственное известное семейство ферментов, способное катализировать эту реакцию, являющуюся этапом процесса фиксации азота. Фиксация азота необходима для всех форм жизни, поскольку азот является важнейшим компонентом для биосинтеза молекул (нуклеотидов, аминокислот), составляющих растения, животных и другие организмы. Они кодируются генами Nif или их гомологами. Они родственно связаны с протохлорофиллидредуктазой.
Редуктаза
Белок Fe, динитрогеназная редуктаза или NifH, является димером из идентичных субъединиц, содержащим один [Fe4S4] кластер и имеющим массу приблизительно 60-64 кДа. Функция белка Fe заключается в переносе электронов от восстановителя, такого как ферредоксин или флаводоксин, к белку нитрогеназе. Перенос электронов требует затрат химической энергии, которая обеспечивается связыванием и гидролизом АТФ. Гидролиз АТФ также вызывает конформационное изменение в комплексе нитрогеназы, приближая белок Fe и MoFe-белок для облегчения переноса электронов.
Нитрогеназа
Мофе-белок представляет собой гетеротетрамер, состоящий из двух α-субъединиц и двух β-субъединиц, с массой приблизительно 240–250 кДа. (Молибден в других ферментах обычно связан с молибдоптерином в виде полностью окисленного Mo(VI)). Ядро (Fe8S7) P-кластера имеет форму двух кубов [Fe4S3], соединенных центральным атомом серы. Каждый P-кластер связан с мофе-белком шестью цистеиновыми остатками. Каждый кофактор FeMo (Fe7MoS9C) состоит из двух неидентичных кластеров: [Fe4S3] и [MoFe3S3], которые связаны тремя сульфид-ионами. Каждый кофактор FeMo ковалентно связан с α-субъединицей белка одним цистеиновым и одним гистидиновым остатком. Электроны от Fe-белка поступают в мофе-белок в P-кластерах, которые затем передают электроны кофакторам FeMo. Каждый кофактор FeMo затем служит местом для фиксации азота, при этом N2 связывается в центральной полости кофактора.
Вариации
Мофе-белок может быть заменен альтернативными азотгеназами в средах с низким содержанием кофактора Mo. Известны два типа таких азотгеназ: ванадиево-железная (VFe; Vnf) и железо-железная (FeFe; Anf). Обе формируют комплекс из двух α-субъединиц, двух β-субъединиц и двух δ (иногда γ)-субъединиц. δ-субъединицы гомологичны друг другу, а α- и β-субъединицы гомологичны тем, что обнаружены в MoFe-азотгеназе. Гены, формирующие кластеры, также гомологичны, и эти субъединицы в некоторой степени взаимозаменяемы. Все азотгеназы используют схожий Fe-S кластер, а различия заключаются в металле кофактора. Азотгеназа Anf у Azotobacter vinelandii организована в оперон anfHDGKOR. Для функционирования этот оперон все еще требует некоторых генов nif. Был сконструирован минимальный оперон из 10 генов, включающий эти дополнительные необходимые гены.
Общий механизм
Азотгеназа — это фермент, ответственный за катализ фиксации азота, представляющей собой восстановление азота (N2) до аммиака (NH3) и являющейся процессом, жизненно важным для поддержания жизни на Земле. Существуют три типа азотгеназ, обнаруженных в различных азотфиксирующих бактериях: молибденовая (Mo) азотгеназа, ванадиевая (V) азотгеназа и железосодержащая (Fe) азотгеназа. Молибденовая азотгеназа, которую можно найти у диазотрофов, таких как ризобии, ассоциированные с бобовыми растениями, является наиболее изученной и, следовательно, наиболее хорошо охарактеризованной азотгеназой. Уравнения 1 и 2 демонстрируют сбалансированные реакции фиксации азота в молибденовой и ванадиевой азотгеназах соответственно. Все азотгеназы представляют собой двухкомпонентные системы, состоящие из компонента I (также известного как динитрогеназа) и компонента II (также известного как динитрогеназаредуктаза). Компонент I является MoFe-белком в молибденовой азотгеназе, VFe-белком в ванадиевой азотгеназе и Fe-белком в железосодержащей азотгеназе. В процессе катализа гидролизуется 2 эквивалента MgATP, что способствует снижению потенциала Fe-S кластера и стимулирует восстановление P-кластера, а затем и FeMo-кофактора, где происходит восстановление N2 до NH3.
Кинетическая модель Лоу-Торнели
Редукция азота до двух молекул аммиака происходит на FeMo-кофакторе компонента I после последовательного присоединения эквивалентов протонов и электронов из компонента II. Кинетическая модель Лоу-Торнели (LT) была разработана на основе этих экспериментов и описывает восемь скоординированных переносов протонов и электронов, необходимых на протяжении всей реакции.
Промежуточные вещества E0 - E4
Спектроскопическая характеристика этих промежуточных соединений позволила лучше понять процесс восстановления азота нитрогеназой, однако механизм остается активной областью исследований и дискуссий. Ниже приведены спектроскопические эксперименты с промежуточными продуктами до добавления азота: E0 – Это состояние покоя фермента до начала катализа. ЭПР-характеристика показывает, что у этого вида спин равен 3/2. E1 – Одноэлектронно восстановленный промежуточный продукт был зафиксирован во время цикла под N2. Мёссбауэровская спектроскопия зафиксированного промежуточного соединения указывает на то, что FeMo-кофактор имеет целый спин, превышающий 1. E2 – Предполагается, что этот промежуточный продукт содержит металлический кластер в состоянии окисления покоя с двумя добавленными электронами, запасенными в мостиковом гидриде, и дополнительным протоном, связанным с атомом серы. Выделение этого промежуточного продукта в мутировавших ферментах показывает, что FeMo-кофактор имеет высокий спин и спин 3/2. E3 – Предполагается, что этот промежуточный продукт представляет собой однократно восстановленный FeMo-кофактор с одним мостиковым гидридом и одним гидридом. Эксперименты ENDOR предоставили информацию о структуре этого промежуточного соединения, выявив наличие двух мостиковых гидридов. Криоотжиг зафиксированного промежуточного соединения при 20 °C приводит к последовательной потере двух водородных эквивалентов при релаксации, что доказывает, что выделенное промежуточное соединение соответствует состоянию E4. В дистальном пути терминальный азот сначала гидрируется, высвобождается аммиак, а затем гидрируется азот, непосредственно связанный с металлом. В альтернативном пути один водород добавляется к терминальному азоту, затем один водород добавляется к азоту, непосредственно связанному с металлом. Этот чередующийся паттерн продолжается до тех пор, пока не высвободится аммиак, а также диазен и гидразин в альтернативном пути. Конкретные доказательства в пользу дистального пути в основном исходят из работ Шрока и Чатта, которые успешно выделили нитридный комплекс, используя Mo в качестве металлического центра в модельном комплексе. Конкретные доказательства в пользу альтернативного пути исходят из нескольких исследований. Модельные кластеры, содержащие только железо, показали способность каталитически восстанавливать N2. Ванадиевая нитрогеназа высвобождает гидразин, промежуточное соединение, специфичное для альтернативного механизма. Однако отсутствие охарактеризованных промежуточных соединений в самом ферменте означает, что ни один из путей не был окончательно доказан. Кроме того, вычислительные исследования подтверждают обе стороны, в зависимости от того, предполагается ли, что сайт реакции находится в Mo (дистальном) или в Fe (альтернативном) кофакторе MoFe. Взаимодействия между фосфатными группами MgATP и аминокислотными остатками Fe-белка хорошо изучены путем сравнения с аналогичными ферментами, в то время как взаимодействия с остальной частью молекулы более трудноуловимы из-за отсутствия кристаллической структуры Fe-белка со связанным MgATP (по состоянию на 1996 год). Показано, что три белковых остатка имеют значительные взаимодействия с фосфатами, и когда лизин заменяется аргинином, MgATP не может связываться из-за слишком сильного солевого мостика. Необходимость аспартата в положении 125 была показана путем наблюдения за измененной реакционной способностью при мутации этого остатка в глутамат. Остаток 16, серин, показал способность связывать MgATP. Для демонстрации этого факта использовался сайт-специфический мутагенез. Связывание MgATP также индуцирует значительные конформационные изменения в Fe-белке. Сравнение данных рентгеновского рассеяния в мутантах и в диком типе белка привело к выводу, что весь белок сжимается при связывании с MgATP, с уменьшением радиуса примерно на 2,0 Å. Из-за окислительных свойств кислорода большинство нитрогеназ необратимо ингибируются диоксигеном, который деградирующим образом окисляет Fe-S кофакторы. Это требует механизмов для фиксаторов азота для защиты нитрогеназы от кислорода in vivo. Несмотря на эту проблему, многие используют кислород в качестве терминального акцептора электронов для дыхания. Хотя способность некоторых фиксаторов азота, таких как Azotobacteraceae, использовать кислородно-лабильную нитрогеназу в аэробных условиях, была связана с высокой скоростью метаболизма, позволяющей восстанавливать кислород на клеточной мембране, эффективность такого механизма была поставлена под сомнение при концентрациях кислорода выше 70 мкМ (окружающая концентрация составляет 230 мкМ O2), а также при дополнительных ограничениях питательных веществ.
E0 – This is the resting state of the enzyme before catalysis begins. EPR characterization shows that this species has a spin of 3/2. E1 – The one electron reduced intermediate has been trapped during turnover under N2. Mӧssbauer spectroscopy of the trapped intermediate indicates that the FeMo co is integer spin greater than 1. E2 – This intermediate is proposed to contain the metal cluster in its resting oxidation state with the two added electrons stored in a bridging hydride and the additional proton bonded to a sulfur atom. Isolation of this intermediate in mutated enzymes shows that the FeMo co is high spin and has a spin of 3/2. E3 – This intermediate is proposed to be the singly reduced FeMo co with one bridging hydride and one hydride. This modification prevents substrate access to the FeMo co. EPR characterization of this isolated intermediate shows a new species with a spin of ½. ENDOR experiments have provided insight into the structure of this intermediate, revealing the presence of two bridging hydrides. Cryoannealing of the trapped intermediate at 20 °C results in the successive loss of two hydrogen equivalents upon relaxation, proving that the isolated intermediate is consistent with the E4 state. In the distal pathway, the terminal nitrogen is hydrogenated first, releases ammonia, then the nitrogen directly bound to the metal is hydrogenated. In the alternating pathway, one hydrogen is added to the terminal nitrogen, then one hydrogen is added to the nitrogen directly bound to the metal. This alternating pattern continues until ammonia is released. and the diazene and hydrazine in the alternating pathway. Specific support for the distal pathway has mainly stemmed from the work of Schrock and Chatt, who successfully isolated the nitrido complex using Mo as the metal center in a model complex. Specific support for the alternating pathway stems from a few studies. Iron only model clusters have been shown to catalytically reduce N2. The vanadium nitrogenase releases hydrazine, an intermediate specific to the alternating mechanism. However, the lack of characterized intermediates in the native enzyme itself means that neither pathway has been definitively proven. Furthermore, computational studies have been found to support both sides, depending on whether the reaction site is assumed to be at Mo (distal) or at Fe (alternating) in the MoFe cofactor. The binding interactions between the MgATP phosphate groups and the amino acid residues of the Fe protein are well understood by comparing to similar enzymes, while the interactions with the rest of the molecule are more elusive due to the lack of a Fe protein crystal structure with MgATP bound (as of 1996). Three protein residues have been shown to have significant interactions with the phosphates. and when the lysine is substituted for an arginine, MgATP cannot bind due to the salt bridge being too strong. The necessity of specifically aspartic acid at site 125 has been shown through noting altered reactivity upon mutation of this residue to glutamic acid. Residue 16, serine, has been shown to bind MgATP. Site specific mutagenesis was used to demonstrate this fact. MgATP binding also induces significant conformational changes within the Fe protein. Comparing X ray scattering data in the mutants versus in the wild type protein led to the conclusion that the entire protein contracts upon MgATP binding, with a decrease in radius of approximately 2.0 Å. Due to the oxidative properties of oxygen, most nitrogenases are irreversibly inhibited by dioxygen, which degradatively oxidizes the Fe S cofactors. This requires mechanisms for nitrogen fixers to protect nitrogenase from oxygen in vivo. Despite this problem, many use oxygen as a terminal electron acceptor for respiration. Although the ability of some nitrogen fixers such as Azotobacteraceae to employ an oxygen labile nitrogenase under aerobic conditions has been attributed to a high metabolic rate, allowing oxygen reduction at the cell membrane, the effectiveness of such a mechanism has been questioned at oxygen concentrations above 70 μM (ambient concentration is 230 μM O2), as well as during additional nutrient limitations.