Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Белок тізбегінен пептидтік тізбектерді трансляциядан кейін жою
The post translational removal of peptide sequences from within a protein sequence
Белокты тігу – бұл белгілі бір белоктың ішкі молекулалық реакциясы, онда ішкі белок сегменті (интеин деп аталады) прекурсорлық белоктан алынып тасталады, ал оның екі жағындағы C және N терминалды сыртқы белоктар (экстеин деп аталады) біріктіріледі. Прекурсорлық белоктың тігу нүктесі негізінен нуклеофильдік бүйір тізбегі бар цистеин немесе серин болып табылады. Қазіргі кезде белгілі белокты тігу реакцияларына экзогенді кофакторлар немесе аденозин трифосфаты (АТФ) немесе гуанозин трифосфаты (ГТФ) сияқты энергия көздері қажет емес. Көбінесе, тігу тек алдын-ала мРНҚ тігумен байланысты болады. Бұл прекурсорлық белок үш сегменттен тұрады: N экстеин, одан кейін интеин, одан кейін C экстеин. Тігу орын алғаннан кейін, нәтижесіндегі белокта N экстеин C экстеинге біріктірілген болады; бұл тігу өнімі экстеин деп те аталады.
Protein splicing is an intramolecular reaction of a particular protein in which an internal protein segment (called an intein) is removed from a precursor protein with a ligation of C terminal and N terminal external proteins (called exteins) on both sides. The splicing junction of the precursor protein is mainly a cysteine or a serine, which are amino acids containing a nucleophilic side chain. The protein splicing reactions which are known now do not require exogenous cofactors or energy sources such as adenosine triphosphate (ATP) or guanosine triphosphate (GTP). Normally, splicing is associated only with pre mRNA splicing. This precursor protein contains three segments—an N extein followed by the intein followed by a C extein. After splicing has taken place, the resulting protein contains the N extein linked to the C extein; this splicing product is also termed an extein.
Тарих
Алғашқы интеин 1988 жылы *Neurospora crassa* және морковканың вакуолярлы АТФазасы (интеинсіз) мен ашытқыдағы гомологты ген (интеинмен) арасындағы тізбек салыстыру арқылы табылды, ол алғаш рет кальций ионын тасымалдаушы ретінде сипатталды. 1990 жылы Hirata және авторлар тобы көрсетті, ашытқы геніндегі қосымша тізбек мРНҚ-ға транскрипцияланып, тек трансляциядан кейін ғана қабылдаушы ақуыздан өзін-өзі алып тастайды. Содан бері интеиндер тіршіліктің үш доменінде (эукариоттар, бактериялар және археялар) және вирустарда табылған. Ақуыз тігілуі күтпеген жағдай болды және оның механизмдерін 1990 жылы екі топ (Анраку және Стивенс) анықтады. Екеуі де вакуолярлы H+ АТФаза ферментінің прекурсорында *Saccharomyces cerevisiae* VMA1 генін тапты. N және C терминалдарының аминқышқылдық тізбегі басқа организмдердің вакуолярлы H+ АТФазасының 70%-ына сәйкес келді, ал орталық бөліктің аминқышқылдық тізбегі ашытқының ДНҚ тізбегінің 30%-ын құрады. Көптеген гендерде әр түрлі орындарда байланыссыз кодтау сегменттері кездеседі. Осы және басқа да себептерге байланысты интеиндер (немесе интеиндерді кодтайтын ген сегменттері) кейде өзімшіл генетикалық элементтер деп аталады, бірақ оларды паразиттік деп санау дұрыс болуы мүмкін. Эволюцияның генге бағытталған көзқарасына сәйкес, көптеген гендер басқа гендермен немесе аллельдермен бәсекелесу үшін ғана «өзімшіл» болып табылады, бірақ әдетте олар организмдер үшін қызмет атқарады, ал «паразиттік генетикалық элементтер» бастапқыда организмнің тіршілігіне оң үлес қоспайды. 2019 жылдың желтоқсанына қарай UniProtKB деректер базасында 188 жазба бар, олар қолмен интеиндер ретінде белгіленген, олар ондаған аминқышқыл қалдықтарынан мыңдағанға дейін жетеді. Алғашқы интеин *Saccharomyces cerevisiae*-нің VMA генінде кодталған. Кейіннен олар саңырауқұлақтарда (аскомицеттер, базидиомицеттер, зигомицеттер және хитридтер) және әртүрлі ақуыздарда да табылды. Белгілі интеиндерге алыс туыс, бірақ метазоандық есек протеиндеріне жақын протеин, *Glomeromycota*-дан интеин тізбегін қамтиды. Жаңа сипатталған интеиндердің көпшілігі гоминг эндонуклеазаларын қамтиды, ал олардың кейбіреулері белсенді болып көрінеді. Саңырауқұлақтардағы интеиннің көптігі интеин құрайтын гендердің көлденең трансферін көрсетеді. Эубактериялар мен археяларда қазіргі кезде 289 және 182 интеин белгілі. Еубактериялар мен археялардағы интеиндердің көпшілігі, саңырауқұлақтар сияқты, нуклеин қышқылының метаболизміне қатысты ақуыздарға енгізілгені таңқаларлық емес. Prp8 құрайтын интеин көбінесе саңырауқұлақтарда кездеседі, бірақ *Amoebozoa*, *Chlorophyta*, *Capsaspora* және *Choanoflagellida*-да да кездеседі. Көптеген микобактерияларда DnaB (бактериялық репликациялық геликаза), RecA (бактериялық ДНК рекомбиназа) және SufB (FeS кластерін құрастыру ақуызы) ішінде интеиндер бар. DnaB интеиндерінің құрылымы мен санының ерекше әртүрлілігі микобактериялар тұқымдасында да, одан тыс жерлерде де кездеседі. Қызығы, DnaB құрамында интеин бар балдырлардың хлоропластарында да кездеседі. Археяларда кездесетін интеин құрайтын ақуыздар RadA (RecA гомологы), RFC, PolB, RNR. Бірдей интеин құрайтын ақуыздардың (немесе олардың гомологтарының) көпшілігі тіршіліктің екі немесе тіпті барлық үш доменінде кездеседі. Интеиндер бактериофагтар мен эукариоттық вирустар кодтайтын протеомаларда да кездеседі. Вирустар интеин таралуының векторы ретінде қатысқан болуы мүмкін. 2-сыныптағы интеиндерде нуклеофильді бірінші тізбек жоқ, тек аланин бар. Керісінше, реакция тікелей нуклеофильді ығысумен басталады, С экстейннің алғашқы қалдықтары N экстейннің соңғы қалдықтарына пептид карбоксилін қосады. Қалғаны әдеттегідей жалғасады, Асан циклдік имидке айналады. Интеиндер (РНК) интрондарына ұқсастығы бойынша ақуыз интрондары деп те аталады.
The first intein was discovered in 1988 through sequence comparison between the Neurospora crassa and carrot vacuolar ATPase (without intein) and the homologous gene in yeast (with intein) that was first described as a putative calcium ion transporter. In 1990 Hirata et al. demonstrated that the extra sequence in the yeast gene was transcribed into mRNA and removed itself from the host protein only after translation. Since then, inteins have been found in all three domains of life (eukaryotes, bacteria, and archaea) and in viruses. Protein splicing was unanticipated and its mechanisms were discovered by two groups (Anraku and Stevens) in 1990. They both discovered a Saccharomyces cerevisiae VMA1 in a precursor of a vacuolar H+ ATPase enzyme. The amino acid sequence of the N and C termini corresponded to 70% DNA sequence of that of a vacuolar H+ ATPase from other organisms, while the amino acid sequence of the central position corresponded to 30% of the total DNA sequence of the yeast HO nuclease. Many genes have unrelated intein coding segments inserted at different positions. For these and other reasons, inteins (or more properly, the gene segments coding for inteins) are sometimes called selfish genetic elements, but it may be more accurate to call them parasitic. According to the gene centered view of evolution, most genes are "selfish" only insofar as to compete with other genes or alleles but usually they fulfill a function for the organisms, whereas "parasitic genetic elements", at least initially, do not make a positive contribution to the fitness of the organism. As of December 2019, the UniProtKB database contains 188 entries manually annotated as inteins, ranging from just tens of amino acid residues to thousands. The first intein was found encoded within the VMA gene of Saccharomyces cerevisiae. They were later found in fungi (ascomycetes, basidiomycetes, zygomycetes and chytrids) and in diverse proteins as well. A protein distantly related to known inteins containing protein, but closely related to metazoan hedgehog proteins, has been described to have the intein sequence from Glomeromycota. Many of the newly described inteins contain homing endonucleases and some of these are apparently active. The abundance of intein in fungi indicates lateral transfer of intein containing genes. While in eubacteria and archaea, there are 289 and 182 currently known inteins. Not surprisingly, most intein in eubacteria and archaea are found to be inserted into nucleic acid metabolic protein, like fungi. Intein containing Prp8 is most commonly found in fungi, but is also seen in Amoebozoa, Chlorophyta, Capsaspora, and Choanoflagellida. Many mycobacteria contain inteins within DnaB (bacterial replicative helicase), RecA (bacterial DNA recombinase), and SufB (FeS cluster assembly protein). There is remarkable variety within the structure and number of DnaB inteins, both within the mycobacterium genus and beyond. Interestingly, intein containing DnaB is also found in the chloroplasts of algae. Intein containing proteins found in archaea include RadA (RecA homolog), RFC, PolB, RNR. Many of the same intein containing proteins (or their homologs) are found in two or even all three domains of life. Inteins are also seen in the proteomes encoded by bacteriophages and eukaryotic viruses. Viruses may have been involved as vectors of intein distribution across the wide variety of intein containing organisms. Class 2 inteins have no nucleophilic first side chain, only an alanine. Instead, the reaction starts directly with a nucleophilic displacement, with the first residue of the C extein atticking the peptide carboxyl on the final residue of the N extein. The rest proceeds as usual, starting with Asn turning into a cyclic imide. Inteins have also been called protein introns, by analogy with (RNA) introns.
Атау беру ережесі
Интеин атауының бірінші бөлігі оны табатын организмнің ғылыми атына, ал екінші бөлігі тиісті геннің немесе экстеиннің атына негізделген. Мысалы, Thermoplasma acidophilum-да табылып, Vacuolar ATPase A (VMA) кішібірлігімен байланысты интеин "Tac VMA" деп аталады. Көбінесе, осы мысалдағыдай, организмді көрсету үшін үш әріп жеткілікті, бірақ өзгерістер де болады. Мысалы, штамды көрсету үшін қосымша әріптер қосылуы мүмкін. Егер тиісті генде бірнеше интеин кодталған болса, интеиндерге 5-тен 3-ке дейін немесе олардың анықталған ретімен сандық жұрнақ беріледі (мысалы, "Msm dnaB 1"). Интеинды кодтайтын геннің бөлігіне әдетте интеинмен бірдей атау беріледі, бірақ шатасуды болдырмау үшін интеиннің аты әдетте үлкен әріппен жазылады (мысалы, Pfu RIR1 1), ал тиісті геннің бөлігінің аты мүсінде жазылады (мысалы, Pfu rir1 1). Тағы бір анықтама беру тәсілі – бастапқы ақуыз атына кіші әріппен "i" қосу, мысалы "Msm DnaBi1".
The first part of an intein name is based on the scientific name of the organism in which it is found, and the second part is based on the name of the corresponding gene or extein. For example, the intein found in Thermoplasma acidophilum and associated with Vacuolar ATPase subunit A (VMA) is called "Tac VMA". Normally, as in this example, just three letters suffice to specify the organism, but there are variations. For example, additional letters may be added to indicate a strain. If more than one intein is encoded in the corresponding gene, the inteins are given a numerical suffix starting from 5 to 3 or in order of their identification (for example, "Msm dnaB 1"). The segment of the gene that encodes the intein is usually given the same name as the intein, but to avoid confusion the name of the intein proper is usually capitalized (e. g., Pfu RIR1 1), whereas the name of the corresponding gene segment is italicized (e. g., Pfu rir1 1). A different disambiguating convention is to place a lowercase "i" after the source protein name, e. g. "Msm DnaBi1".
Интейндердің түрлері
Интейндерді көптеген критерийлер бойынша жіктеуге болады. Олардың өзін-өзі қалай бөліп шығатынына қарай, оларды цис-сплисинг (өзіндік бөлінуді білдіреді) немесе транс-сплисинг (сыртқы көмек қажеттігін білдіреді) деп жіктеуге болады. Көп зерттелген интейндер цис-сплисинг болып табылады. Бөлінген интейндер (төменде қараңыз) көбінесе екі жартысы бір-біріне көмектеседі, сондықтан олар транс-сплисинг болып есептеледі. Олардың құрамында эндонуклеаза доменінің болуына қарай жіктеледі. Эндонуклеаза домені бар интейндер "макси-интеин" деп, ал ондай домені жоқтары "мини-интеин" деп аталады.
Inteins can be classified on many criteria. Based on how they splice themselves out, they can be classified into cis splicing (which means that they splice themselves out) or trans splicing (which means they need outside help). Most studied inteins are cis splicing. Split inteins (see below) usually involves two halves helping each other out, so they are trans splicing. Based on whether they contain the endonuclease domain. Ones that have an endonuclease domain is called a "maxi intein", otherwise a "mini intein".
Толық және шағын интернеттер
Интейндерде шлицтеу домендерімен қатар хомингтік эндонуклеаза генінің (HEG) домені де болуы мүмкін. Бұл домен гомологты хромосомадағы интеинсіз аллельде ДНК-ны кесу арқылы интеиннің таралуына жауапты, соның салдарынан ДНК-ның екі тізбекті үзілуін жөндеу (DSBR) жүйесі іске қосылады, ол үзілісті қалпына келтіріп, интеин кодтайтын ДНК-ны бұрын интеинсіз болған жерге көшіреді.
Inteins can contain a homing endonuclease gene (HEG) domain in addition to the splicing domains. This domain is responsible for the spread of the intein by cleaving DNA at an intein free allele on the homologous chromosome, triggering the DNA double stranded break repair (DSBR) system, which then repairs the break, thus copying the intein coding DNA into a previously intein free site.
Биотехнологиядағы қолданулар
Интеиндер ақуыздарды біріктіруде өте тиімді, сондықтан олар биотехнологияда маңызды рөл атқарады. Бүгінгі күнге дейін 200-ден астам интеин анықталды; олардың мөлшері 100–800 АА аралығында. Интеиндер белоктың жартылай синтезі және ірі белоктардың ЯМР зерттеулерінде пайдалы болатын белок сегменттерін таңдап белгілеу сияқты нақты қолданулар үшін жасалған. Интеиннің экзизиясын фармацевтикалық түрде тежеу дәрі-дәрмектерді әзірлеуде пайдалы құрал болуы мүмкін; интеин экзизияланбаса, оның құрылымы бұзылатындықтан, интеин бар ақуыз қалыпты функциясын орындай алмайды. Интеиндер митохондриялық геноммен кодталған, әсіресе гидрофобты ақуыздардың аллотоптық экспрессиясын қамтамасыз етуге көмектеседі, мысалы, гендік терапияда. Бұл ақуыздардың гидрофобтылығы митохондрияға енуіне кедергі келтіреді. Сондықтан гидрофобты емес интеин енгізу осы процесті жеңілдетуі мүмкін. Импорттан кейін интеиннің кесілуі ақуызды бастапқы күйіне қайтарады. Рекомбинантты ақуыздарды тазарту үшін аффиниттік тегтер кеңінен қолданылады, себебі олар қоспалардың аз болуын қамтамасыз ете отырып, рекомбинантты ақуыздың жиналуына мүмкіндік береді. Дегенмен, аффиниттік тегті соңғы тазарту кезеңінде протеазалармен жою қажет. Аффиниттік тегтерді рекомбинантты ақуыздан жою және қорыту өнімдерін алып тастау кезінде протеазаның таңдаулылығына қатысты қосымша мәселелер туындайды. Бұл мәселені бақыланатын ортада өзін-өзі кесетін интеиндерге аффиниттік тегті біріктіру арқылы болдырмауға болады. Осындай экспрессия векторларының бірінші буыны модификацияланған *Saccharomyces cerevisiae* VMA (Sce VMA) интеинін пайдаланды. Чонг және авторлар тобы *Bacillus circulans*-тан алынған хитин байланыстыру доменін (CBD) аффиниттік тег ретінде пайдаланды және осы тегті модификацияланған Sce VMA интеінімен біріктірді. Модификацияланған интеин 1,4 дитиотреитол (DTT), β-меркаптоэтанол (β ME) немесе цистинмен, кең pH диапазонында төмен температурада N-терминалды пептидтік байланысында өзін-өзі кесу реакциясына түседі. Рекомбинантты ақуызды экспрессиялаудан кейін жасуша гомогенаты хитин бар бағанадан өтеді. Бұл химерлі ақуыздың CBD-сінің бағанаға байланысуына мүмкіндік береді. Содан кейін, температура төмендетілгенде және жоғарыда сипатталған молекулалар бағанадан өткенде, химерлі ақуыз өзін-өзі кесіп, тек мақсатты ақуыз элюцияланады. Бұл жаңа техника протеолиз қадамын қажет етпейді, ал модификацияланған Sce VMA хитинге CBD арқылы байланысқан күйде бағанада қалады. Бұл протеин тазарту үшін қажетті хроматографиялық қадамды жояды. ELP тегтері интеиннің синтезделген ақуызында қолданылды, осылайша агрегаттарды хроматографиясыз (центрифугалау арқылы) оқшаулауға болады, содан кейін интеин мен тег бақыланатын тәртіппен кесіліп, мақсатты ақуыз ерітіндіге босатылады. Бұл ақуызды оқшаулау үздіксіз орта ағыны арқылы жүзеге асырылуы мүмкін, нәтижесінде жоғары мөлшерде ақуыз алынады, бұл процесті дәстүрлі әдістерге қарағанда экономикалық жағынан тиімді етеді.
Inteins are very efficient at protein splicing, and they have accordingly found an important role in biotechnology. There are more than 200 inteins identified to date; sizes range from 100–800 AAs. Inteins have been engineered for particular applications such as protein semisynthesis and the selective labeling of protein segments, which is useful for NMR studies of large proteins. Pharmaceutical inhibition of intein excision may be a useful tool for drug development; the protein that contains the intein will not carry out its normal function if the intein does not excise, since its structure will be disrupted. It has been suggested that inteins could prove useful for achieving allotopic expression of certain highly hydrophobic proteins normally encoded by the mitochondrial genome, for example in gene therapy. The hydrophobicity of these proteins is an obstacle to their import into mitochondria. Therefore, the insertion of a non hydrophobic intein may allow this import to proceed. Excision of the intein after import would then restore the protein to wild type. Affinity tags have been widely used to purify recombinant proteins, as they allow the accumulation of recombinant protein with little impurities. However, the affinity tag must be removed by proteases in the final purification step. The extra proteolysis step raises the problems of protease specificity in removing affinity tags from recombinant protein, and the removal of the digestion product. This problem can be avoided by fusing an affinity tag to self cleavable inteins in a controlled environment. The first generation of expression vectors of this kind used modified Saccharomyces cerevisiae VMA (Sce VMA) intein. Chong et al. used a chitin binding domain (CBD) from Bacillus circulans as an affinity tag, and fused this tag with a modified Sce VMA intein. The modified intein undergoes a self cleavage reaction at its N terminal peptide linkage with 1,4 dithiothreitol (DTT), β mercaptoethanol (β ME), or cystine at low temperatures over a broad pH range. After expressing the recombinant protein, the cell homogenate is passed through the column containing chitin. This allows the CBD of the chimeric protein to bind to the column. Furthermore, when the temperature is lowered and the molecules described above pass through the column, the chimeric protein undergoes self splicing and only the target protein is eluted. This novel technique eliminates the need for a proteolysis step, and modified Sce VMA stays in column attached to chitin through CBD. This eliminates the chromatographic step needed in protein purification. The ELP tags have been used in the fusion protein of intein, so that the aggregates can be isolated without chromatography (by centrifugation) and then intein and tag can be cleaved in controlled manner to release the target protein into solution. This protein isolation can be done using continuous media flow, yielding high amounts of protein, making this process more economically efficient than conventional methods.
Микробқа қарсы препараттарды әзірлеуде қолдану
Соңғы жиырма жылда антимикробтық қолданыс үшін интеиндерді пайдалануға қызығушылық артып келеді. Интеин жарылуы тек бір жасушалы организмдерде ғана кездеседі, әсіресе патогенді микроорганизмдерде кең таралған. Бұдан әрі, интеиндер әдетте организмнің адам организмінде тірі қалуына қатысатын немесе тұрмыстық ақуыздарда кездеседі. Ақуыздың дұрыс бүгілуі және функциясын орындауы үшін посттрансляциялық интеиннің жойылуы қажет. Мысалы, Гаэль Хуэ және авторлар тобы Mycobacterium tuberculosis-те жарылмаған SufB, SUF машинасының құрамдас бөлігі SufBCD кешенінің қалыптасуына кедергі келтіретінін көрсетті. Осылайша, интеин жарылуын тежеу антимикробтық препараттарды әзірлеу үшін тиімді платформа болып табылуы мүмкін. Интеин жарылуын тежегіштерге қазіргі зерттеулер антимикобактериялық препараттарды (M. tb. үш интеин құрайтын ақуызы бар) және патогенді саңырауқұлақтар – Криптококк және Аспергиллға қарсы белсенді заттарды әзірлеуге бағытталған. Мыс (II) және мырыш (II) иондары сияқты дивалентті катиондар жарылуды қайтымды түрде тежеу үшін ұқсас әрекет етеді.
Over the last twenty years, there has been increasing interest in leveraging inteins for antimicrobial applications. Intein splicing is found exclusively in unicellular organisms, with a particularly high abundance in pathogenic microorganisms. Furthermore, inteins are commonly found within housekeeping proteins and/or proteins involved in the survival of the organism within a human host. Post translational intein removal is necessary for the protein to properly fold and function. For example, Gaëlle Huet et al. demonstrated that in Mycobacterium tuberculosis, unspliced SufB prevents the formation of the SufBCD complex, a component of the SUF machinery. As such, the inhibition of intein splicing may serve as a powerful platform for the development of antimicrobials. Current research on intein splicing inhibitors has focused on developing antimycobacterials (M. tb. has three intein containing proteins), as well as agents active against pathogenic fungi Cryptococcus and Aspergillus. Divalent cations, such as copper (II) and zinc (II) ions, function similarly to reversibly inhibit splicing.