Протеиновый сплайсинг: удаление интеинов из белковых последовательностей.

Введение

Посттрансляционное удаление пептидных последовательностей из белковой последовательности.

Сплайсинг белка – это внутримолекулярная реакция, происходящая с определенным белком, в ходе которой внутренний сегмент белка (называемый интеином) удаляется из белка-предшественника с одновременным образованием пептидной связи между C- и N-концевыми экстеинами с обеих сторон. Место сплайсинга в белке-предшественнике обычно представляет собой цистеин или серин – аминокислоты, содержащие нуклеофильную боковую цепь. Известные реакции сплайсинга белков не требуют экзогенных кофакторов или источников энергии, таких как аденозинтрифосфат (АТФ) или гуанозинтрифосфат (ГТФ). Обычно сплайсинг ассоциируется исключительно со сплайсингом пре-мРНК. Белок-предшественник содержит три сегмента: N-экстеин, за которым следует интеин, а затем C-экстеин. После сплайсинга результирующий белок состоит из N-экстеина, соединенного с C-экстеином; этот продукт сплайсинга также называют экстеином.

История

Первый интеин был обнаружен в 1988 году путем сравнения последовательностей между вакуолярной АТФазой *Neurospora crassa* и моркови (без интеина) и гомологичным геном в дрожжах (с интеином), который первоначально был описан как предполагаемый транспортер ионов кальция. В 1990 году Хирата и соавторы показали, что дополнительная последовательность в гене дрожжей транскрибируется в мРНК и удаляется из белка-хозяина только после трансляции. С тех пор интеины были обнаружены во всех трех доменах жизни (эукариоты, бактерии и археи) и в вирусах. Сплайсинг белков был неожиданным, и его механизмы были открыты двумя группами (Анраку и Стивенс) в 1990 году. Они оба обнаружили *Saccharomyces cerevisiae* VMA1 в предшественнике вакуолярного фермента H+ ATPase. Аминокислотная последовательность N- и C-концов соответствовала 70% ДНК-последовательности вакуолярной H+ АТФазы из других организмов, в то время как аминокислотная последовательность центральной части соответствовала 30% от общей ДНК-последовательности дрожжевой HO-нуклеазы. Многие гены содержат несвязанные кодирующие сегменты интеинов, вставленные в разные позиции. По этим и другим причинам интеины (или, точнее, гены, кодирующие интеины) иногда называют эгоистичными генетическими элементами, но, возможно, более точно называть их паразитическими. Согласно генно-центрированному взгляду на эволюцию, большинство генов "эгоистичны" лишь в той мере, в какой они конкурируют с другими генами или аллелями, но обычно выполняют функцию для организма, в то время как "паразитические генетические элементы", по крайней мере, изначально, не вносят положительного вклада в приспособленность организма. По состоянию на декабрь 2019 года база данных UniProtKB содержит 188 записей, вручную аннотированных как интеины, варьирующихся от нескольких десятков аминокислотных остатков до тысяч. Первый интеин был обнаружен в гене *VMA* *Saccharomyces cerevisiae*. Позже они были найдены в грибах (аскомицетах, базидиомицетах, зигомицетах и хитридах), а также в различных белках. Белок, отдаленно связанный с известными интеинами, но тесно связанный с метазоанскими белками hedgehog, был описан как содержащий последовательность интеина из Glomeromycota. Многие из недавно описанных интеинов содержат гоминг-эндонуклеазы, и некоторые из них, по-видимому, активны. Обилие интеинов в грибах указывает на горизонтальный перенос генов, содержащих интеины. В то время как в эубактериях и археях известно 289 и 182 интеина соответственно. Неудивительно, что большинство интеинов в эубактериях и археях вставлены в белки, участвующие в метаболизме нуклеиновых кислот, как и в грибах. Интеин, содержащий Prp8, наиболее часто встречается в грибах, но также встречается в Amoebozoa, Chlorophyta, Capsaspora и Choanoflagellida. Многие микобактерии содержат интеины в генах *DnaB* (бактериальная репликативная геликаза), *RecA* (бактериальная ДНК-рекомбиназа) и *SufB* (белок, участвующий в сборке FeS-кластеров). Наблюдается замечательное разнообразие в структуре и количестве интеинов *DnaB* как внутри рода микобактерий, так и за его пределами. Интересно, что интеин, содержащий *DnaB*, также встречается в хлоропластах водорослей. Белки, содержащие интеины, обнаруженные в археях, включают RadA (гомолог RecA), RFC, PolB, RNR. Многие из тех же белков, содержащих интеины (или их гомологи), встречаются в двух или даже во всех трех доменах жизни. Интеины также встречаются в протеомах, кодируемых бактериофагами и эукариотическими вирусами. Вирусы, возможно, участвовали в качестве векторов распространения интеинов среди широкого разнообразия организмов, содержащих интеины. Интеины класса 2 не имеют нуклеофильной первой боковой цепи, только аланин. Вместо этого реакция начинается непосредственно с нуклеофильного замещения, когда первый остаток C-экстеина атакует пептидную карбоксильную группу последнего остатка N-экстеина. Далее процесс протекает как обычно, начиная с превращения аспарагина в циклический имид. Интеины также называют белковыми интронами по аналогии с (РНК) интронами.

The first intein was discovered in 1988 through sequence comparison between the Neurospora crassa and carrot vacuolar ATPase (without intein) and the homologous gene in yeast (with intein) that was first described as a putative calcium ion transporter. In 1990 Hirata et al. demonstrated that the extra sequence in the yeast gene was transcribed into mRNA and removed itself from the host protein only after translation. Since then, inteins have been found in all three domains of life (eukaryotes, bacteria, and archaea) and in viruses. Protein splicing was unanticipated and its mechanisms were discovered by two groups (Anraku and Stevens) in 1990. They both discovered a Saccharomyces cerevisiae VMA1 in a precursor of a vacuolar H+ ATPase enzyme. The amino acid sequence of the N and C termini corresponded to 70% DNA sequence of that of a vacuolar H+ ATPase from other organisms, while the amino acid sequence of the central position corresponded to 30% of the total DNA sequence of the yeast HO nuclease. Many genes have unrelated intein coding segments inserted at different positions. For these and other reasons, inteins (or more properly, the gene segments coding for inteins) are sometimes called selfish genetic elements, but it may be more accurate to call them parasitic. According to the gene centered view of evolution, most genes are "selfish" only insofar as to compete with other genes or alleles but usually they fulfill a function for the organisms, whereas "parasitic genetic elements", at least initially, do not make a positive contribution to the fitness of the organism. As of December 2019, the UniProtKB database contains 188 entries manually annotated as inteins, ranging from just tens of amino acid residues to thousands. The first intein was found encoded within the VMA gene of Saccharomyces cerevisiae. They were later found in fungi (ascomycetes, basidiomycetes, zygomycetes and chytrids) and in diverse proteins as well. A protein distantly related to known inteins containing protein, but closely related to metazoan hedgehog proteins, has been described to have the intein sequence from Glomeromycota. Many of the newly described inteins contain homing endonucleases and some of these are apparently active. The abundance of intein in fungi indicates lateral transfer of intein containing genes. While in eubacteria and archaea, there are 289 and 182 currently known inteins. Not surprisingly, most intein in eubacteria and archaea are found to be inserted into nucleic acid metabolic protein, like fungi. Intein containing Prp8 is most commonly found in fungi, but is also seen in Amoebozoa, Chlorophyta, Capsaspora, and Choanoflagellida. Many mycobacteria contain inteins within DnaB (bacterial replicative helicase), RecA (bacterial DNA recombinase), and SufB (FeS cluster assembly protein). There is remarkable variety within the structure and number of DnaB inteins, both within the mycobacterium genus and beyond. Interestingly, intein containing DnaB is also found in the chloroplasts of algae. Intein containing proteins found in archaea include RadA (RecA homolog), RFC, PolB, RNR. Many of the same intein containing proteins (or their homologs) are found in two or even all three domains of life. Inteins are also seen in the proteomes encoded by bacteriophages and eukaryotic viruses. Viruses may have been involved as vectors of intein distribution across the wide variety of intein containing organisms. Class 2 inteins have no nucleophilic first side chain, only an alanine. Instead, the reaction starts directly with a nucleophilic displacement, with the first residue of the C extein atticking the peptide carboxyl on the final residue of the N extein. The rest proceeds as usual, starting with Asn turning into a cyclic imide. Inteins have also been called protein introns, by analogy with (RNA) introns.

Конвенции о наименовании

Первая часть названия интеина основана на научном названии организма, в котором он обнаружен, а вторая часть – на названии соответствующего гена или экстеина. Например, интеин, обнаруженный в Thermoplasma acidophilum и связанный с субъединицей А вакуолярной АТФазы (VMA), называется "Tac VMA". Обычно, как в этом примере, для обозначения организма достаточно трех букв, но существуют и исключения. Например, могут добавляться дополнительные буквы для указания штамма. Если в соответствующем гене кодируется более одного интеина, интеинам присваиваются числовые суффиксы, начиная с 5' к 3' или в порядке их идентификации (например, "Msm dnaB 1"). Участок гена, кодирующий интеин, обычно имеет то же название, что и сам интеин, но для избежания путаницы название интеина обычно пишется с большой буквы (например, Pfu RIR1 1), а название соответствующего участка гена – со строчной (например, Pfu rir1 1). Другой способ различения – добавление строчной буквы "i" после названия исходного белка, например, "Msm DnaBi1".

Типы интенов

Интеины можно классифицировать по множеству критериев. В зависимости от механизма их вырезания, их можно классифицировать как цис-сплайсинг (то есть самовырезание) или транс-сплайсинг (то есть вырезание с помощью внешних факторов). Наиболее изучены интеины, осуществляющие цис-сплайсинг. Раздельные интеины (см. ниже) обычно состоят из двух частей, помогающих друг другу, поэтому они осуществляют транс-сплайсинг. Классификация также проводится по наличию домена эндонуклеазы: интеины, содержащие эндонуклеазный домен, называются "макси-интеинами", а остальные – "мини-интеинами".

Полные и мини-интенны

Интеины могут содержать домен гена гомонингового эндонуклеаза (HEG) в дополнение к сплайсинговым доменам. Этот домен отвечает за распространение интеина, расщепляя ДНК в аллеле, не содержащем интеин, на гомологичной хромосоме, что запускает систему восстановления разрывов двухцепочечной ДНК (DSBR). Эта система затем восстанавливает разрыв, копируя кодирующую интеин ДНК в место, ранее свободное от интеина.

Применение в биотехнологии

Интеины обладают высокой эффективностью при сшивании белков и, соответственно, нашли важное применение в биотехнологии. На сегодняшний день идентифицировано более 200 интеинов; их размеры варьируются от 100 до 800 аминокислот. Интеины были модифицированы для решения конкретных задач, таких как полусинтез белков и селективная маркировка белковых сегментов, что полезно при проведении ЯМР-исследований крупных белков. Фармацевтическое ингибирование вырезания интеина может стать полезным инструментом в разработке лекарств; белок, содержащий интеин, не сможет выполнять свою нормальную функцию, если интеин не вырежется, поскольку это нарушит его структуру. Предполагается, что интеины могут оказаться полезными для достижения аллотопической экспрессии некоторых высокогидрофобных белков, обычно кодируемых митохондриальным геномом, например, в генной терапии. Гидрофобность этих белков представляет собой препятствие для их импорта в митохондрии. Поэтому введение негидрофобного интеина может способствовать этому импорту. После импорта вырезание интеина позволит восстановить белок до его природного состояния. Аффинные метки широко используются для очистки рекомбинантных белков, поскольку они позволяют накапливать рекомбинантный белок с минимальным количеством примесей. Однако аффинная метка должна быть удалена протеазами на заключительном этапе очистки. Дополнительный этап протеолиза вызывает проблемы, связанные со специфичностью протеазы при удалении аффинных меток из рекомбинантного белка и удалением продукта расщепления. Эту проблему можно избежать, объединив аффинную метку с саморасщепляющимися интеинами в контролируемых условиях. Первое поколение экспрессионных векторов такого типа использовало модифицированный интеин Saccharomyces cerevisiae VMA (Sce VMA). Чон и соавторы использовали хитин-связывающий домен (CBD) из Bacillus circulans в качестве аффинной метки и объединили эту метку с модифицированным Sce VMA интеином. Модифицированный интеин подвергается реакции саморасщепления в N-терминальной пептидной связи с 1,4-дитиотреитолом (DTT), β-меркаптоэтанолом (β-ME) или цистином при низких температурах в широком диапазоне pH. После экспрессии рекомбинантного белка клеточный гомогенат пропускают через колонку, содержащую хитин. Это позволяет CBD химерного белка связываться с колонкой. Кроме того, при понижении температуры и прохождении вышеупомянутых молекул через колонку химерный белок подвергается самосплайсингу, и элюируется только целевой белок. Эта новая методика устраняет необходимость в этапе протеолиза, а модифицированный Sce VMA остается в колонке, присоединенным к хитину через CBD. Это исключает хроматографический этап, необходимый для очистки белка. ELP-метки использовались в фузионных белках с интеином, чтобы агрегаты можно было изолировать без хроматографии (путем центрифугирования), а затем интеин и метка можно было бы расщепить контролируемым образом для высвобождения целевого белка в раствор. Эта изоляция белка может быть выполнена с использованием непрерывного потока среды, что позволяет получать большое количество белка и делает этот процесс более экономически эффективным, чем традиционные методы.

Inteins are very efficient at protein splicing, and they have accordingly found an important role in biotechnology. There are more than 200 inteins identified to date; sizes range from 100–800 AAs. Inteins have been engineered for particular applications such as protein semisynthesis and the selective labeling of protein segments, which is useful for NMR studies of large proteins. Pharmaceutical inhibition of intein excision may be a useful tool for drug development; the protein that contains the intein will not carry out its normal function if the intein does not excise, since its structure will be disrupted. It has been suggested that inteins could prove useful for achieving allotopic expression of certain highly hydrophobic proteins normally encoded by the mitochondrial genome, for example in gene therapy. The hydrophobicity of these proteins is an obstacle to their import into mitochondria. Therefore, the insertion of a non hydrophobic intein may allow this import to proceed. Excision of the intein after import would then restore the protein to wild type. Affinity tags have been widely used to purify recombinant proteins, as they allow the accumulation of recombinant protein with little impurities. However, the affinity tag must be removed by proteases in the final purification step. The extra proteolysis step raises the problems of protease specificity in removing affinity tags from recombinant protein, and the removal of the digestion product. This problem can be avoided by fusing an affinity tag to self cleavable inteins in a controlled environment. The first generation of expression vectors of this kind used modified Saccharomyces cerevisiae VMA (Sce VMA) intein. Chong et al. used a chitin binding domain (CBD) from Bacillus circulans as an affinity tag, and fused this tag with a modified Sce VMA intein. The modified intein undergoes a self cleavage reaction at its N terminal peptide linkage with 1,4 dithiothreitol (DTT), β mercaptoethanol (β ME), or cystine at low temperatures over a broad pH range. After expressing the recombinant protein, the cell homogenate is passed through the column containing chitin. This allows the CBD of the chimeric protein to bind to the column. Furthermore, when the temperature is lowered and the molecules described above pass through the column, the chimeric protein undergoes self splicing and only the target protein is eluted. This novel technique eliminates the need for a proteolysis step, and modified Sce VMA stays in column attached to chitin through CBD. This eliminates the chromatographic step needed in protein purification. The ELP tags have been used in the fusion protein of intein, so that the aggregates can be isolated without chromatography (by centrifugation) and then intein and tag can be cleaved in controlled manner to release the target protein into solution. This protein isolation can be done using continuous media flow, yielding high amounts of protein, making this process more economically efficient than conventional methods.

Применение в разработке антимикробных препаратов

За последние двадцать лет наблюдается растущий интерес к использованию интеинов в антимикробных целях. Сплайсинг интеинов встречается исключительно в одноклеточных организмах, особенно часто – в патогенных микроорганизмах. Более того, интеины обычно обнаруживаются в белках, выполняющих базовые функции клетки, и/или белках, участвующих в выживании организма внутри человеческого хозяина. Посттрансляционное удаление интеина необходимо для правильного сворачивания и функционирования белка. Например, Гоэль Хуэ и соавторы показали, что у Mycobacterium tuberculosis несплайсированный SufB препятствует образованию комплекса SufBCD, компонента SUF-машинерии. Таким образом, ингибирование сплайсинга интеинов может стать мощной платформой для разработки антимикробных средств. Современные исследования ингибиторов сплайсинга интеинов сосредоточены на создании антимикобактериальных препаратов (M. tb. содержит три белка, содержащих интеины), а также средств, активных против патогенных грибов Cryptococcus и Aspergillus. Дивалентные катионы, такие как ионы меди (II) и цинка (II), функционируют аналогичным образом, обратимо ингибируя сплайсинг.