Конфокальды микроскопия: Оптикалық кескіштің қағидалары мен қолданылуы

Конфокальды микроскопия: жоғары ажыратымдылықты, контрастты кескіндер алуға арналған оптикалық әдіс. 3D құрылымдарды жаңартуға, ғылымда қолданылады.

13 мин оқу

100%

Дереккөз: Confocal microscopy — Wikipedia

Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.

Мазмұны

Кіріспе

Оптикалық бейнелеу техникасы

Конфокалды микроскопия, көбінесе конфокалды лазерлік сканерлеу микроскопиясы (CLSM) немесе лазерлік сканерлеу конфокалды микроскопиясы (LSCM) – бұл микрографтың оптикалық ажыратымдылығы мен контрасттылығын арттыру үшін, бейнелеу кезінде фокустан тыс жарықты кеңістіктік тесік арқылы тоқтатуға негіделген оптикалық бейнелеу техникасы. Үлгідегі әртүрлі тереңдіктегі көптеген екі өлшемді бейнелерді түсіру, объектінің үш өлшемді құрылымдарын қайта құруға мүмкіндік береді (бұл процесс оптикалық қималау деп аталады). Бұл техника ғылыми және өнеркәсіптік салаларда кеңінен қолданылады, әсіресе тірі организмдерді зерттеу, жартылай өткізгіштерді тексеру және материалтануда жиі қолданылады. Дәстүрлі микроскопта жарық үлгіге мүмкіндігінше терең сіңе алады, ал конфокалды микроскоп бір уақытта тек тар тереңдіктегі шағын жарық шоғырын бағыттайды. CLSM бақыланатын және өте шектеулі тереңдікке қол жеткізеді.

Негізгі түсінік

Конфокалды бейнелеу принципі 1957 жылы Марвин Мински патенттеген және дәстүрлі кең өрісті флуоресценциялық микроскоптардың кейбір шектеулерін жеңуге бағытталған. Конвенциялық (яғни, кең өрісті) флуоресценттік микроскопта, үлгіге жарық көзінен тең жарық түседі. Үлгінің барлық бөліктері бір уақытта қозады және нәтижедегі флуоресценция микроскоптың фотодетекторымен немесе камерасымен анықталады, оның ішінде үлкен фокуссыз фондық бөлік те болады. Керісінше, конфокалды микроскоп нүктелік жарықтандыруды (Нүктелік таралу функциясын қараңыз) және детектор алдындағы оптикалық конъюгацияланған жазықтықтағы кішкентай тесікті пайдаланады, бұл фокустан тыс сигналды жоюға мүмкіндік береді – «конфокалды» атауы осы конфигурациядан туындайды. Тек фокалды жазықтыққа өте жақын флуоресценциядан туындаған жарық анықталады, сондықтан бейненің оптикалық ажыратымдылығы, әсіресе үлгінің тереңдігі бағытында, кең өрісті микроскоптардан әлдеқайда жақсы. Алайда, үлгінің флуоресценциясынан туындаған жарықтың көп бөлігі кішкентай тесікте тоқтатылғандықтан, бұл ажыратымдылықтың артуы сигналдың төмендеуіне әкеледі, сондықтан ұзақ экспозициялар жиі қажет болады. Кішкентай тесіктен кейін сигналдың төмендеуін өтеу үшін, жарық интенсивтілігі сезімтал детектормен анықталады, әдетте фотокөбейтілгіш түтікшемен (ФМТ) немесе лавиналық фотодиодпен, жарық сигналын электрлік сигналға түрлендіреді. Үлгіде бір уақытта тек бір нүкте жарықтандырылатындықтан, 2D немесе 3D бейнелеу үшін үлгідегі тұрақты растр бойынша сканерлеу қажет (яғни, параллель сканерлеу сызықтарының тіктөртбұрышты үлгісі). Сәуле бір немесе бірнеше (серво басқарылатын) осцилляциялық айналарды пайдалану арқылы үлгінің көлденең жазықтығында сканерленеді. Бұл сканерлеу әдісі әдетте төмен реакциялық кешігуге ие және сканерлеу жылдамдығын өзгертуге болады. Баяу сканерлеулер сигнал мен шудың жақсы арақатынасын қамтамасыз етеді, нәтижесінде жақсы контрастқа қол жеткізіледі. Фокалды жазықтықтың қол жетімді қалыңдығы негізінен қолданылатын жарықтың толқын ұзындығын объективтің сандық апертурасына бөлу арқылы анықталады, сонымен қатар үлгінің оптикалық қасиеттеріне де байланысты. Мүмкін болатын жұқа оптикалық кесу осы микроскоптардың түрлерін 3D бейнелеуде және үлгілердің беттік профильдеуінде ерекше тиімді етеді. Бір-бірінен кейін алынған кесінділер «z стекін» құрайды, оны 3D бейне жасау үшін өңдеуге болады немесе 2D стекке біріктіруге болады (көбінесе пикселдердің максималды интенсивтігі алынады, басқа да кең таралған әдістерге стандартты ауытқуды пайдалану немесе пикселдерді қосу кіреді). Бағдарламаланатын матрицалық микроскоптар (БММ) жылжымалы кішкентай тесіктер жиынтығын жасайтын электрондық басқарылатын кеңістіктік жарық модуляторларын (КЖМ) пайдаланады. КЖМ – жеке пикселдердің кейбір қасиеттеріне (мөлдірлік, шағылыстыру қабілеті немесе оптикалық айналу) ие пикселдер массивін қамтитын құрылғы, оларды электрондық түрде реттеуге болады. КЖМ микроэлектромеханикалық айналарды немесе сұйық кристалдық компоненттерді қамтиды. Бейне әдетте зарядталған құрылғымен (ЗҚҚ) камерасымен алынады. Конфокалды микроскоптардың әр класының өзіндік артықшылықтары мен кемшіліктері бар. Көптеген жүйелер жазу жылдамдығына (мысалы, бейне түсіруге) немесе жоғары кеңістіктік ажыратымдылыққа бағытталған. Конфокалды лазерлік сканерлеу микроскоптары бағдарламаланатын сынама алу тығыздығына және өте жоғары ажыратымдылыққа ие, ал Nipkow және БММ камераның ажыратымдылығымен анықталатын тұрақты сынама алу тығыздығын пайдаланады. Бейнелеу кадрларының жылдамдығы әдетте бір нүктелі лазерлік сканерлеу жүйелерінде айналу дискісі немесе БММ жүйелеріне қарағанда баяу. Коммерциялық айналу дискісі конфокалды микроскоптары секундына 50 кадрдан астам жылдамдыққа жетеді, бұл тірі жасушаларды бейнелеу сияқты динамикалық байқаулар үшін қажетті мүмкіндік. Іс жүзінде, Nipkow және БММ бір аймақты бір мезгілде сканерлеуге бірнеше кішкентай тесіктерге мүмкіндік береді, егер кішкентай тесіктер бір-бірінен жеткілікті алыс болса. Конфокалды лазерлік сканерлеу микроскопиясының соңғы дамуы қазір бірнеше микроэлектромеханикалық сканерлеу айналарын пайдалану арқылы стандартты бейне жылдамдығынан (60 кадр/сек) жақсы бейнелеуге мүмкіндік береді. Конфокалды рентген сәулелерінің флуоресценциялық бейнелеуі – бұл жаңа техника, ол көлденең және тік бағытта бағыттауға қоса, тереңдікті де бақылауға мүмкіндік береді, мысалы, суреттегі көмілген қабаттарды талдағанда.

The principle of confocal imaging was patented in 1957 by Marvin Minsky and aims to overcome some limitations of traditional wide field fluorescence microscopes. In a conventional (i. e., wide field) fluorescence microscope, the entire specimen is flooded evenly in light from a light source. All parts of the sample can be excited at the same time and the resulting fluorescence is detected by the microscope's photodetector or camera including a large unfocused background part. In contrast, a confocal microscope uses point illumination (see Point Spread Function) and a pinhole in an optically conjugate plane in front of the detector to eliminate out of focus signal – the name "confocal" stems from this configuration. As only light produced by fluorescence very close to the focal plane can be detected, the image's optical resolution, particularly in the sample depth direction, is much better than that of wide field microscopes. However, as much of the light from sample fluorescence is blocked at the pinhole, this increased resolution is at the cost of decreased signal intensity – so long exposures are often required. To offset this drop in signal after the pinhole, the light intensity is detected by a sensitive detector, usually a photomultiplier tube (PMT) or avalanche photodiode, transforming the light signal into an electrical one. As only one point in the sample is illuminated at a time, 2D or 3D imaging requires scanning over a regular raster (i. e. a rectangular pattern of parallel scanning lines) in the specimen. The beam is scanned across the sample in the horizontal plane by using one or more (servo controlled) oscillating mirrors. This scanning method usually has a low reaction latency and the scan speed can be varied. Slower scans provide a better signal to noise ratio, resulting in better contrast. The achievable thickness of the focal plane is defined mostly by the wavelength of the used light divided by the numerical aperture of the objective lens, but also by the optical properties of the specimen. The thin optical sectioning possible makes these types of microscopes particularly good at 3D imaging and surface profiling of samples. Successive slices make up a 'z stack', which can either be processed to create a 3D image, or it is merged into a 2D stack (predominately the maximum pixel intensity is taken, other common methods include using the standard deviation or summing the pixels). Programmable array microscopes (PAM) use an electronically controlled spatial light modulator (SLM) that produces a set of moving pinholes. The SLM is a device containing an array of pixels with some property (opacity, reflectivity or optical rotation) of the individual pixels that can be adjusted electronically. The SLM contains microelectromechanical mirrors or liquid crystal components. The image is usually acquired by a charge coupled device (CCD) camera. Each of these classes of confocal microscope have particular advantages and disadvantages. Most systems are either optimized for recording speed (i. e. video capture) or high spatial resolution. Confocal laser scanning microscopes can have a programmable sampling density and very high resolutions while Nipkow and PAM use a fixed sampling density defined by the camera's resolution. Imaging frame rates are typically slower for single point laser scanning systems than spinning disk or PAM systems. Commercial spinning disk confocal microscopes achieve frame rates of over 50 per second – a desirable feature for dynamic observations such as live cell imaging. In practice, Nipkow and PAM allow multiple pinholes scanning the same area in parallel as long as the pinholes are sufficiently far apart. Cutting edge development of confocal laser scanning microscopy now allows better than standard video rate (60 frames per second) imaging by using multiple microelectromechanical scanning mirrors. Confocal X ray fluorescence imaging is a newer technique that allows control over depth, in addition to horizontal and vertical aiming, for example, when analyzing buried layers in a painting.

Қателіктерді жою

CLSM – сканерлеу бейнелеу әдісі, онда алынған ажыратымдылықты сканерлік электронды микроскоп (SEM) сияқты басқа сканерлеу әдісімен салыстыру арқылы түсіндіруге болады. CLSM-де, мысалы, AFM немесе STM-дегідей, суретті беттен нанометрлік қашықтықта ұстап тұру қажеттілігі жоқ, онда суретті үстіңгі бет үстінен ұсақ қозғалтқышпен сканерлеу арқылы алады. Объектив линзасынан бетке дейінгі қашықтық (жұмыс қашықтығы деп аталады) әдетте дәстүрлі оптикалық микроскопқа ұқсас. Ол жүйелік оптикалық конструкцияға байланысты өзгереді, бірақ жұмыс арақашықтығы жүздеген микрометрден бірнеше миллиметрге дейін болуы мүмкін. CLSM-де үлгі нүктелік лазерлік сәулемен жарықтандырылады, ал әрбір көлемдік элемент дискретті шашырау немесе флуоресценция қарқындылығымен байланысты. Мұнда сканерлеу көлемінің мөлшері оптикалық жүйенің нүктелік мөлшерімен (дифракция шегіне жақын) анықталады, өйткені сканерлеу лазерінің бейнесі шексіз кішкентай нүкте емес, үш өлшемді дифракциялық үлгі болып табылады. Бұл дифракциялық үлгінің мөлшері мен оның анықтайтын фокустық көлемі жүйенің объектив линзасының сандық апертурасымен және қолданылатын лазердің толқын ұзындығымен реттеледі. Бұл кең өрісті жарықтандыруды қолданатын дәстүрлі оптикалық микроскоптардың классикалық ажыратымдылық шегі ретінде қарастырылуы мүмкін. Дегенмен, конфокалды микроскопия арқылы кең өрісті жарықтандыру техникасының ажыратымдылық шегін жақсартуға болады, себебі дифракциялық үлгінің жоғары реттілерін жою үшін конфокалды диафрагманы тарылтуға болады. Мысалы, егер диафрагманың диаметрі 1 Airy бірлігіне орнатылса, дифракциялық үлгінің бірінші реті ғана диафрагмадан детекторға жетеді, ал жоғары реттілері тоқтатылады, осылайша жарықтылықтың сәл төмендеуі есебінен ажыратымдылық жақсартылады. Флуоресценттік бақылауларда конфокалды микроскопияның ажыратымдылық шегі көбінесе флуоресценттік микроскопиядағы фотондардың аз санынан туындаған сигнал мен шудың арақатынасымен шектеледі. Бұл әсерді сезімтал фотодетекторларды пайдалану арқылы немесе жарықтандыру лазерлік нүктелік көзінің қарқындылығын арттыру арқылы толықтыруға болады. Жарықтандыру лазерінің қарқындылығын арттыру, әсіресе флуоресценция жарықтылығын салыстыру қажет болатын тәжірибелер үшін, үлгіге шамадан тыс ағарту немесе басқа да зақым келтіру қаупін тудырады. Дифференциалды рефрактивті тіндерді бейнелеу кезінде, мысалы, өсімдік жапырақтарының губка тәрізді мезофилісі немесе ауа қуыстары бар тіндерде, конфокалды бейне сапасын нашарлататын сфералық аберрациялар жиі байқалады. Алайда, мұндай аберрацияларды үлгілерді перфтордекалин сияқты оптикалық мөлдір, уытты емес перфторкарбондарға орналастыру арқылы едәуір азайтуға болады, ол тіндерге оңай сіңіп, судың рефракциялық индексіне жақын болады. Кері шағылыс геометриясында бейнелеу кезінде жасушаішілік органел сияқты объектінің шағылысқан және шашыраған жарығының интерференциясын анықтауға да болады. Сигналдың интерферометриялық сипаты диафрагманың диаметрін 0,2 Airy бірлігіне дейін азайтуға мүмкіндік береді, демек, сигнал мен шудың арақатынасын құрбан етпей √2 есе ажыратымдылықты арттыруға болады, конфокалды флуоресценттік микроскопиядағыдай.

CLSM is a scanning imaging technique in which the resolution obtained is best explained by comparing it with another scanning technique like that of the scanning electron microscope (SEM). CLSM has the advantage of not requiring a probe to be suspended nanometers from the surface, as in an AFM or STM, for example, where the image is obtained by scanning with a fine tip over a surface. The distance from the objective lens to the surface (called the working distance) is typically comparable to that of a conventional optical microscope. It varies with the system optical design, but working distances from hundreds of micrometres to several millimeters are typical. In CLSM a specimen is illuminated by a point laser source, and each volume element is associated with a discrete scattering or fluorescence intensity. Here, the size of the scanning volume is determined by the spot size (close to diffraction limit) of the optical system because the image of the scanning laser is not an infinitely small point but a three dimensional diffraction pattern. The size of this diffraction pattern and the focal volume it defines is controlled by the numerical aperture of the system's objective lens and the wavelength of the laser used. This can be seen as the classical resolution limit of conventional optical microscopes using wide field illumination. However, with confocal microscopy it is even possible to improve on the resolution limit of wide field illumination techniques because the confocal aperture can be closed down to eliminate higher orders of the diffraction pattern. For example, if the pinhole diameter is set to 1 Airy unit then only the first order of the diffraction pattern makes it through the aperture to the detector while the higher orders are blocked, thus improving resolution at the cost of a slight decrease in brightness. In fluorescence observations, the resolution limit of confocal microscopy is often limited by the signal to noise ratio caused by the small number of photons typically available in fluorescence microscopy. One can compensate for this effect by using more sensitive photodetectors or by increasing the intensity of the illuminating laser point source. Increasing the intensity of illumination laser risks excessive bleaching or other damage to the specimen of interest, especially for experiments in which comparison of fluorescence brightness is required. When imaging tissues that are differentially refractive, such as the spongy mesophyll of plant leaves or other air space containing tissues, spherical aberrations that impair confocal image quality are often pronounced. Such aberrations however, can be significantly reduced by mounting samples in optically transparent, non toxic perfluorocarbons such as perfluorodecalin, which readily infiltrates tissues and has a refractive index almost identical to that of water. When imaging in a reflection geometry, it is also possible to detect the interference of the reflected and scattered light of an object like an intracellular organelle. The interferometric nature of the signal allows to reduce the pinhole diameter down to 0.2 Airy units and therefore enables an ideal resolution enhancement of √2 without sacrificing the signal to noise ratio as in confocal fluorescence microscopy.

Қолданылуы

CLSM жасуша биологиясы, генетика, микробиология және даму биологиясы сияқты биологиялық ғылымдардың көптеген салаларында кеңінен қолданылады. Одан бөлек, ол кванттық оптика және нанокристалл бейнелеу мен спектроскопиясында да пайдаланылады.

Биология және медицина

Клиникалық жағдайда CLSM түрлі көз ауруларын бағалауда қолданылады және ерекше бейнелеу, сапалық талдау және мүйіз қабығының эндотелий жасушаларын сандық өлшеу үшін пайдалы. Кератомикоз жағдайларында мүйіз қабығы стромасында жіп тәрізді саңырауқұлақ элементтерінің орналасқан жерін анықтау және оларды табу үшін қолданылады, бұл жылдам диагноз қоюға және тиімді емді ертерек бастауға мүмкіндік береді. Эндоскопиялық процедуралар (эндомикроскопия) үшін CLSM техникаларын зерттеу де үміттендіргіш. Фармацевтикалық өнеркәсіпте, дәрі-дәрмектердің таралу сапасы мен біртектілігін бақылау үшін жұқа пленкалы фармацевтік формалардың өндіріс процесін қадағалау ұсынылады. Конфокалды микроскопия сондай-ақ микроорганизмдердің табиғи ортасы болып табылатын күрделі кеуекті құрылымдар – биофильмдерді зерттеу үшін қолданылады. Биофильмдердің уақыттық және кеңістіктік функцияларының кейбірін олардың микро және мезо деңгейдегі құрылымын зерттеу арқылы ғана түсінуге болады. Жеке микроорганизмдердің белсенділігі мен ұйымдасуын анықтау үшін микродеңгейде зерттеулер қажет.

Оптика және кристаллография

CLSM кейбір 3D оптикалық дерек сақтау жүйелерінде мәліметтерді алу механизмі ретінде пайдаланылады және Магдалена папирусының жасын анықтауға көмектесті.

Дыбысты сақтау

IRENE жүйесі тарихи аудио жазбаларын оптикалық сканерлеу және қалпына келтіру үшін конфокалды микроскопияны пайдаланады.

Материалдың бетін сипаттау

Лазерлік сканерлеулі конфокалды микроскоптар күн элементтерін өндіруде қолданылатын кремнийлі пластиналар сияқты микроқұрылымдық материалдардың бетін сипаттау үшін қолданылады. Алғашқы өңдеу қадамдарында пластиналар қышқыл немесе сілтілік қосылыстармен химиялық әдіспен өңделеді, бұл олардың бетіне текстура жасайды. Лазерлік конфокалды микроскопия осыдан кейін алынған беттің күйін микрометр дәлдігімен бақылауға мүмкіндік береді. Сондай-ақ, лазерлік конфокалды микроскопия күн элементтерінің бетіне жапсырылған металл жалатылған саусақтардың қалыңдығы мен биіктігін талдау үшін де қолданылуы мүмкін.

Оқпандық ажыратылуын жақсарту

Шынтақ ойықтың нүктелік таралу функциясы - эллипсоид, енінен бірнеше есе ұзын. Бұл микроскоптың осьтік ажыратымдылығын шектейді. Бұл шектеуді жеңудің бір тәсілі - 4Pi микроскопиясы, онда үлгіге жоғарыдан және төменнен келетін немесе шығатын жарық эллипсоидтың көлемін азайту үшін бір-бірімен араласады. Балама тәсіл - конфокалды тета микроскопиясы. Бұл тәсілде жарық сәулесінің конусы мен анықталатын жарық конусы бір-біріне бұрышпен орналасқан (ең жақсы нәтижелер олар перпендикуляр болғанда алынады). Екі нүктелік таралу функциясының қиылысы тиімді үлгі көлемін айтарлықтай кішірейтеді. Осыдан бір жазықтықпен жарықтандыру микроскопы дамыды. Сонымен қатар, эксперименттік жолмен алынған нүктелік таралу функциясын пайдаланып деконволюциялауды қолдануға болады, бұл фокустан тыс жарықты жоюға және осьтік және көлденең жазықтықтағы контрасты жақсартуға мүмкіндік береді.

Супер қатаңдық

Дифракциялық шектен төмен ажыратымдылыққа қол жеткізетін конфокальдық түрлері бар, мысалы, стимуляциялық эмиссиялық таусылу микроскопиясы (STED). Бұл техникадан басқа, PALM, (d)STORM, SIM және т.б. сияқты конфокальдық емес, көптеген басқа да суперрезолюциялық техникалар қолданылады. Олардың әрқайсысының жеңіл пайдалану, ажыратымдылық, сондай-ақ арнайы жабдықтар, буферлер немесе флуорофорлар қажеттілігі сияқты өз артықшылықтары бар.

Төмен температурада жұмыс істеу мүмкіндігі

Үлгілерді төмен температурада бейнелеу үшін екі негізгі тәсіл қолданылды, екеуі де лазерлік сканерлеулі конфокалды микроскопия архитектурасына негізделген. Бір тәсіл – үздіксіз ағынды криостатты пайдалану: төмен температурада тек үлгі ғана болады және ол мөлдір терезе арқылы оптикалық түрде қарастырылады. Екінші мүмкін тәсіл – оптиканың бір бөлігін (әсіресе микроскоп объективін) криогендік сақтау ыдысында орналастыру. Бұл екінші тәсіл, барынша қиын болғанымен, жақсырақ механикалық тұрақтылықты қамтамасыз етеді және терезе арқылы болатын шығындарды болдырмайды.

Молекулалық өзара іс-қимыл

CLSM Фёрстерлік резонанстық энергия беру (FRET) арқылы молекулалық өзара әрекеттесулерді зерттеуге болады, бұл екі белоктың бір-біріне белгілі бір қашықтықта орналасқанын растауға мүмкіндік береді.

Басталуы: 1940-1957 жылдар

1940 жылы Швейцарияның Берн қаласында көз дәрігері Ханс Голдман көз тексерулерін тіркеу үшін жарық шам жүйесін ойлап тапты. Кейбір кейінгі авторлар бұл жүйені алғашқы конфокалды оптикалық жүйе деп есептейді. 1943 жылы Цюнь Коана конфокалды жүйе туралы жариялады. Алғашқы конфокалды сканерлеуші микроскопты 1955 жылы Марвин Мински құрастырды және 1957 жылы патент алды. Фокус жазықтығындағы жарықтандыру нүктесін сканерлеу сахнаны жылжыту арқылы іске асырылды. Ешқандай ғылыми жарияланым жасалмады және осы микроскоппен алынған суреттер сақталған жоқ.

Тандемдік сканерлеу микроскопы

1960 жылдары Пльзендегі Карл университетінің медицина факультетінің чехословакиялық ғалымы Моймир Петрань алғашқы коммерциялық конфокалды микроскоп – «Тандемдік сканерлеу микроскопын» жасады. Ол Чехословакиядағы шағын компания және АҚШ-тағы Tracor Northern (кейін Noran) компаниялары арқылы сатылды. Микроскопта көптеген қозу және эмиссиялық тесіктерді жасау үшін айналмалы Нипков дискісі қолданылды. Чехословакиялық патент 1966 жылы Петрань мен оның чехословакиялық әріптесі Милан Хадравский атынан тіркелді. Осы микроскоппен алынған деректер мен суреттерді қамтитын алғашқы ғылыми жарияланым 1967 жылы «Science» журналында жарық көрді, авторлары – Йель университетінен М. Дэвид Эггер және Петрань. Мақаланың түсіндірмесінде Петрань микроскопты жобалап, құрылысын бақылағандығы және Йельде «ғылыми қызметкер» болғандығы айтылған. 1968 жылғы екінші жарияланымда құралдың теориясы мен техникалық егжей-тегжейлері сипатталған, ал Хадравский мен Йельдегі топ жетекшісі Роберт Галамбос қосымша авторлар ретінде көрсетілген. 1970 жылы АҚШ патенті берілді, ол 1967 жылы тіркелген болатын.

1969 жыл: Алғашқы конфокалды лазерлік сканерлеу микроскопы

1969 және 1971 жылдары Йель университетінің М. Дэвид Эггер мен Пол Дэвидвиц есімді профессорлары алғашқы конфокалды лазерлік сканерлеу микроскопын сипаттаған екі мақала жариялады. Бұл нүктелік сканер болды, яғни тек бір жарық нүктесі тудырылды. Ол жүйке тінін бақылау үшін эпи-жарықтандыру рефлексиялық микроскопиясын пайдаланды. 633 нм толқын ұзындығы бар 5 мВт гелий-неон лазері жартылай өткізгіш айна арқылы объективке бағытталды. Объектив – 8,5 мм фокус арақашықтығы бар қарапайым линза. Барлық алдыңғы және көптеген кейінгі жүйелерден өзгеше, сынама осы линзаның (объективті сканерлеу) қозғалысы арқылы сканерленді, бұл фокус нүктесінің қозғалысына әкелді. Кері шағылысқан жарық жартылай өткізгіш айнаға қайта оралды, ал өткен бөлігі фотокөбейтуші түтік орналастырылған детекторлық тесікке басқа линза арқылы бағытталды. Сигнал осциллоскоптың электронды сәулелік түтігінде (ЭСТ) бейнеленді, катод сәулесі объективпен синхронды түрде қозғалды. Арнайы құрылғы Полароид фотосуреттерін жасауға мүмкіндік берді, олардың үшеуі 1971 жылғы жарияланымда көрсетілген. Авторлар in vivo зерттеулер үшін флуоресцентті бояулар қолдану мүмкіндігі туралы пікір білдіреді. Олар Минскийдің патентын сілтеме жасайды, сол кезде Нью-Йорктегі Альберт Эйнштейн медицина мектебінде докторант болған Стив Баерге, ол конфокалды сызықтық сканерлеу микроскопын жасаған, «Минский микроскопымен» лазерді пайдалануды ұсынғандығы үшін алғыс айтады, сондай-ақ Галамбос, Хадравский және Петраньға микроскопын дамытуға ықпал еткен талқылаулары үшін ризашылық білдіреді. Олардың дамуына түрткі болған фактор – тандемдік сканерлеу микроскопында көз бөлшегіндегі бейнені құруға жарықтың бар болғаны 10−7 бөлігі қатысады. Осылайша, көптеген биологиялық зерттеулер үшін бейне сапасы жеткіліксіз болды.

1977-1985: Лазерлік нүктелік сканерлер және сахналық сканерлеу

1977 жылы Колин Дж.Р. Шеппард пен Амарджоти Чоудхури (Оксфорд, Ұлыбритания) конфокалды және лазерлік сканерлеу микроскоптарының теориялық талдауын жариялады. Бұл "конфокалды микроскоп" терминін қолданған тұңғыш жарияланым болуы мүмкін. Бұл CLSM дизайны алғаш рет лазерлік сканерлеу әдісін флуоресценттік маркерлермен белгіленген биологиялық объектілерді 3D форматта анықтаумен үйлестірді. 1978 және 1980 жылдары Колин Шепард пен Тони Уилсон басқаратын Оксфорд тобы эпи-лазерлік жарықтандыру, сахналық сканерлеу және фотокөбейтуші түтіктерді детектор ретінде пайдаланатын конфокалды микроскопты сипаттады. Сахна оптикалық ось (z ось) бойымен жылжуға қабілетті болды, бұл оптикалық сериялық кесінділер жасауға мүмкіндік берді. Ұзақ өтпей, көптеген топтар конфокалды микроскопияны технологиялық шектеулерге байланысты бұрынғыда жауапсыз қалған ғылыми сұрақтарға жауап беру үшін қолдана бастады. 1983 жылы Оксфордтан И. Дж. Кокс және К. Шепард конфокалды микроскопты компьютермен басқаруды жүзеге асырған алғашқы жұмысты жариялады. Алғашқы коммерциялық лазерлік сканерлеу микроскопы – SOM 25 сатылы сканері 1982 жылдан бастап Oxford Optoelectronics компаниясы ұсынды (кейіннен бірнеше рет сатып алынып, BioRad компаниясына қосылды). Ол Оксфорд тобының дизайны негізінде жасалған.

1985 жылдан бастап: сәулелі сканерлі лазерлік нүктелік сканерлер

1980 жылдардың ортасында Уильям Брэдшоу Амос, Джон Грэм Уайт және Кембридж молекулалық биология зертханасындағы әріптестері алғашқы конфокалды сәулелі сканерлеу микроскопын құрастырды. Үлгі орналасқан платформа қозғалмады, оның орнына жарықтандыру нүктесі қозғалды, бұл суреттерді жылдам түсіруге мүмкіндік берді: секундына төрт сурет, әрқайсысы 512 жолдан тұрды. 1–2 метрлік сәуле жолының нәтижесінде үлкейтілген аралық суреттер, диаметрі ~1 мм болатын «пинол» ретінде дәстүрлі ирис диафрагмасын пайдалануға мүмкіндік берді. Алғашқы микрофотографиялар цифрлық камера қосылғанша ұзақ уақытқа пленкаға түсірілді. Содан кейін дайындаманы үлкейтуге алғаш рет мүмкіндік туды. Zeiss, Leitz және Cambridge Instruments коммерциялық өндіріске қызығушылық танытпады. Медициналық зерттеулер кеңесі (МЗК) ақырында прототипті әзірлеуге қаржылай қолдау көрсетті. Дизайнды Bio Rad сатып алды, компьютерлік басқарумен толықтырылып, «MRC 500» деп сатылымға шығарылды. MRC 600 кейіннен 1990 жылы Корнелл университетінде жасалған алғашқы екі фотонды флуоресцентті микроскопты жасауға негіз болды. 1990 жылы бұл жобаны Molecular Dynamics сатып алды, бірақ CLSM ақырында тоқтатылды. Германияда 1984 жылы құрылған Heidelberg Instruments компаниясы CLSM-ді әзірледі, ол бастапқыда биология емес, өнеркәсіптік қолдануға арналған. Бұл құрал 1990 жылы Leica Lasertechnik компаниясымен сатып алынды. Zeiss нарықта конфокалды емес, ұшатын нүктелі лазерлік сканерлеу микроскопын ұсынды, ол кейіннен конфокалды түрге жаңартылды. 1990 жылғы есепте конфокалды микроскоптарды өндіретін бірнеше компания аталады: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio Rad, Leica, Tracor Northern және Zeiss. Олар Lasentec компаниясын бірлесіп құрып, оны сатуға бағыттады. 2001 жылы Lasentec компаниясын Mettler Toledo сатып алды. Олар негізінен фармацевтикалық өнеркәсіпте ірі тазарту жүйелерінде кристалдану процесін бақылау үшін қолданылады.

2010 жылдар: шығыс шұңқырдың өшіруіне арналған есептеу әдістері

Стандартты конфокалды аспаптарда екінші немесе "шығыс" диафрагма шығарылған немесе шашыраған жарықты сүзгілеу үшін пайдаланылады. Дәстүр бойынша, бұл диафрагма жарықты оптикалық түрде сүзгілеу үшін жарықты тоқтатып тұратын пассивті компонент болып табылады. Дегенмен, жаңа конструкциялар осы сүзгілеуді цифрлық түрде жүзеге асыруға тырысты. Соңғы тәсілдер пассивті диафрагманы күрделі детектор элементімен алмастырды. Әдетте, цифрлық өңдеуден кейін бұл тәсіл жақсырақ ажыратымдылыққа және фотон шығындарына әкеледі, себебі ажыратымдылық шегі шексіз кішкентай диафрагмаға жақындауы мүмкін. Басқа зерттеушілер терең конволюциялық нейрондық желілерді қолдана отырып, нүктелік қоздыру көзінен жарықты цифрлық түрде қайта фокусқа келтіруге тырысты.