Кіріспе
Флюоресценциядан кейін фотоағарту (FRAP) – тіндік немесе жасушалық ортадағы диффузия кинетикасын анықтау әдісі. Ол флуоресцентті белгіленген зондтардан тұратын молекулалық жұқа қабықшаның екі өлшемдік бүйірлік диффузиясын сандық бағалауға немесе жеке жасушаларды зерттеуге мүмкіндік береді. Бұл техника жасуша мембранасының диффузиясын және белок байланысын биологиялық тұрғыдан зерттеуде өте пайдалы. Сонымен қатар, флуоресцентті фосфолипидтік екі қабаттың (немесе бір қабаттың) бетке орналасуы, беттік құрылымы мен еркін энергия тұрғысынан гидрофильді (немесе гидрофобтық) беттерді сипаттауға мүмкіндік береді. Жасуша ішіндегі молекулалардың үш өлшемді диффузиясын және байланысын зерттеу үшін ұқсас, бірақ аз танымал әдістер әзірленген; олар да FRAP деп аталады.
Эксперименттік қондырғы
Негізгі аппарат оптикалық микроскоптан, жарық көзі мен флуоресценттік зондтан тұрады. Флуоресценттік сәуле шығару белгілі бір оптикалық толқын ұзындығы немесе түстің жұтылуына байланысты, бұл шамдарды таңдауды шектейді. Көбінесе, кең спектрлі сынап немесе ксенон көзі түсті сүзгімен бірге қолданылады. Техника фотоағартудан бұрын үлгінің фондық бейнесін сақтаудан басталады. Содан кейін жарық көзі көруге болатын аймақтың кішкентай бөлігіне жоғары ұлғайту микроскопының объективін ауыстыру арқылы немесе тиісті толқын ұзындығындағы лазерлік сәулемен бағытталады. Бұл аймақтағы флюорофорлар жоғары қарқынды жарықтандыруға ұшырайды, бұл олардың флуоресценцияның өмір сүру уақытын жылдам қысқартады (жоғалуға дейін шамамен 105 фотонға дейін шектеледі). Қазір микроскоптағы бейне біркелкі флуоресценттік өріс ретінде көрінеді, ортасында көзге түсетін қара дақ бар. Браун қозғалысы жүріп жатқанда, әлі де флуоресценциялайтын зондтар үлгінің ішінде таралып, ағартылған аймақтағы флуоресценцияламайтын зондтарды алмастырады. Бұл диффузия диффузия теңдеуінен аналитикалық түрде анықтамалы ретпен жүреді. Ағарту сәулесі үшін Гаусс профилін қабылдасақ, диффузия тұрақтысы D мына формула бойынша оңай есептелуі мүмкін: мұнда w – сәуленің радиусы және tD – «Сипаттамалық» диффузия уақыты.
where w is the radius of the beam and tD is the "Characteristic" diffusion time.
Қолдаулы липидтік қос қабаттар
Бастапқыда FRAP әдісі жасуша мембранасындағы жеке липид молекулаларының қозғалғыштығын сипаттау үшін жасалған еді. Егер зерттелетін белок GFP-пен өндірілсе, флуоресценцияны қадағалауға болады. GFP-ті фотобұзу арқылы, содан кейін ағартылған аймаққа қайта толуын бақылау, белоктың өзара әрекеттесетін серіктестері, органеллалардың үздіксіздігі және белок тасымалы туралы мәліметтерді ашуға мүмкіндік береді. Егер белгілі бір уақыттан кейін флуоресценция бастапқы деңгейге жетпесе, онда флуоресценцияның бір бөлігі қозғалмайтын фракциядан туындайды (оның диффузия арқылы толықтырылуы мүмкін емес). Сол сияқты, егер флуоресцентті ақуыздар статикалық жасуша рецепторларымен байланысса, қалпына келтіру жылдамдығы байланысудың ассоциация және диссоциация коэффициенттеріне байланысты фактормен төмендейді. Осы байқау соңғы уақыттарда белок байланысын зерттеу үшін қолданылды. Сондай-ақ, егер GFP белгіленген белок тұрақты түрде үлкен кешенге енгізілсе, флуоресценцияның қалпына келтіру динамикасы үлкен кешеннің диффузиясымен сипатталады.
Мембранадан тыс қолдану
FRAP мембранадан тыс белоктарды бақылау үшін де қолданылуы мүмкін. Қызығушылық тудырған белок флуоресцентті болғаннан кейін, әдетте GFP-пен біріктірілген белок түрінде экспрессиялану арқылы, конфокалды микроскоп цитоплазманың белгілі бір аймағын фотоағарту және бақылау үшін пайдаланылады. Содан кейін аймақтағы орташа флуоресценцияны фотоағартудан бергі уақытқа қарай сызбаға салуға болады, ал нәтижедегі қисық белоктың байланысу реакциялары және/немесе оны бақылайтын ортадағы белоктың диффузия коэффициенті сияқты кинетикалық коэффициенттерді бере алады. Көбінесе диффузия және байланысу/ажырасу өзара әрекеттесулері ғана қарастырылады, бірақ принципте белоктар ағын арқылы да қозғалуы мүмкін, яғни бағытталған қозғалысқа ие болуы мүмкін, және бұл Axelrod және авторлар тобы бұл мәселені ертеректе атап өткен. (Бұл модификацияланған Бессел функцияларын қамтиды және ) диффузияның ерекше уақыт шкаласымен және уақытпен сипатталады. – нормаланған флуоресценция (уақыт шексіздікке жақындағанда 1-ге жуықтайды). Радиусы бар ағартылған нүктенің диффузия уақыт шкаласы , мұнда D – диффузия коэффициенті. Бұл бірденгі ағарту үшін, қадамдық функция профилімен, яғни белгілі бір уақытта ағартылған белоктың үлесі және , ал үшін – ағартылған аймақтың ортасынан қашықтық. Сондай-ақ, қалпына келтіруді екі өлшемді диффузия арқылы модельдеуге болады, яғни біркелкі және изотроптық. Басқаша айтқанда, диффузия біркелкі ортада жүреді, сондықтан тиімді диффузия тұрақтысы D барлық жерде бірдей, ал диффузия изотроптық, яғни жазықтықтағы барлық осьтер бойымен бірдей жылдамдықпен жүреді. Бірақ жасуша ішінде бұл шарттардың ешқайсысы да қатаң түрде орындалмайды. Ағарту бірден жүрмейді. Әсіресе үлкен аумақты күшті ағарту қажет болғанда, ағарту диффузия уақытының маңызды бөлігін алады. Содан кейін ағартылған белоктың маңызды бөлігі ағарту кезінде ағартылған аймақтан тарап кетеді. Мұны ескермеу D-ге маңызды қате енгізеді. Ағартылған профиль радиалды қадамдық функция болмайды. Егер ағартылған нүкте бір пикселге тең болса, онда ағарту орналасу функциясы бойынша дифракциямен шектеледі және қолданылатын конфокалды лазерлік сканерлеу микроскопының оптикасымен анықталады. Бұл радиалды қадамдық функция емес және жазықтыққа перпендикуляр ось бойымен да өзгереді. Және жасуша әрине үш өлшемді, екі өлшемді емес, ағартылған көлем де солай. Жазықтан тыс диффузияны ескермеу (біз оны xy жазықтығы деп есептейміз) флуоресценция негізінен осы жазықтықта диффузия арқылы қалпына келсе ғана дұрыс болады. Мысалы, егер цилиндрлік көлемнің осі z осі бойымен және цилиндрлік көлем жасушаның бүкіл биіктігінен өтетін болса, онда бұл дұрыс. Содан кейін z осі бойымен диффузия флуоресценцияның қалпына келуіне себеп болмайды, өйткені барлық белок z осі бойымен біркелкі ағартылады, сондықтан оны елемеу, Соумпасис теңдеуіндегідей, зиянсыз. Бірақ егер z осі бойымен диффузия флуоресценцияның қалпына келуіне әсер етсе, оны ескеру қажет. Жасуша цитоплазмасының немесе ядролық плазмасының кеңістікте толығымен біркелкі немесе изотроптық болуына күмән. Осылайша, Соумпасис теңдеуі тек пайдалы шамалау болып табылады, оны жоғарыда аталған шарттар нақты жағдайға жақсы сәйкес келгенде және флуоресценцияның қалпына келуі диффузия уақыт шкаласымен шектелгенде қолдануға болады. Соумпасис деректерге жеткілікті түрде сәйкес келгені, шарттар дұрыс және диффузия қалпына келуде басымдық тартады дегенді білдірмейді.
with the characteristic timescale for diffusion, and is the time. is the normalized fluorescence (goes to 1 as goes to infinity). The diffusion timescale for a bleached spot of radius is , with D the diffusion coefficient. Note that this is for an instantaneous bleach with a step function profile, i. e., the fraction of protein assumed to be bleached instantaneously at time is , and , for is the distance from the centre of the bleached area. It is also assumed that the recovery can be modelled by diffusion in two dimensions, that is also both uniform and isotropic. In other words, that diffusion is occurring in a uniform medium so the effective diffusion constant D is the same everywhere, and that the diffusion is isotropic, i. e., occurs at the same rate along all axes in the plane. In practice, in a cell none of these assumptions will be strictly true. Bleaching will not be instantaneous. Particularly if strong bleaching of a large area is required, bleaching may take a significant fraction of the diffusion timescale Then a significant fraction of the bleached protein will diffuse out of the bleached region actually during bleaching. Failing to take account of this will introduce a significant error into D.
The bleached profile will not be a radial step function. If the bleached spot is effectively a single pixel then the bleaching as a function of position will typically be diffraction limited and determined by the optics of the confocal laser scanning microscope used. This is not a radial step function and also varies along the axis perpendicular to the plane. Cells are of course three dimensional not two dimensional, as is the bleached volume. Neglecting diffusion out of the plane (we take this to be the xy plane) will be a reasonable approximation only if the fluorescence recovers predominantly via diffusion in this plane. This will be true, for example, if a cylindrical volume is bleached with the axis of the cylinder along the z axis and with this cylindrical volume going through the entire height of the cell. Then diffusion along the z axis does not cause fluorescence recovery as all protein is bleached uniformly along the z axis, and so neglecting it, as Soumpasis' equation does, is harmless. However, if diffusion along the z axis does contribute to fluorescence recovery then it must be accounted for. There is no reason to expect the cell cytoplasm or nucleoplasm to be completely spatially uniform or isotropic. Thus, the equation of Soumpasis is just a useful approximation, that can be used when the assumptions listed above are good approximations to the true situation, and when the recovery of fluorescence is indeed limited by the timescale of diffusion Note that just because the Soumpasis can be fitted adequately to data does not necessarily imply that the assumptions are true and that diffusion dominates recovery.
Реакциямен шектелген қалпына келтіру
Флуоресценцияны уақыт функциясы ретінде сипаттайтын теңдеу, басқа бір жағдайда ерекше қарапайым болады. Егер көптеген белоктар шағын көлемдегі сайттарға байланысса, нәтижесінде флуоресценттік сигналға байланысқан белоктардың сигналы басым болса, және егер бұл байланыс тек бір күйде жүрсе, онда флуоресценция уақыт функциясы ретінде былай беріледі.
Ескеріңіз, қалпына келтіру тек ажырау жылдамдық тұрақтысы koff-қа ғана тәуелді. Ол байланыс жылдамдық тұрақтысына тәуелді емес. Дегенмен, бірқатар болжамдар жасалса да, FRAP қисықтары диффузия тұрақтысы мен байланыс жылдамдық тұрақтысының әртүрлі жұптарына сәйкес келуі мүмкін, яғни FRAP деректеріне сәйкес келу бірегей емес. Бұл үш параметрлі (байланыс жылдамдық тұрақтысы, ажырау жылдамдық тұрақтысы және диффузия тұрақтысы) сәйкестіктерде кездеседі. Бірегей емес сәйкестіктер, әдетте, тиімді емес. Сондықтан, көптеген параметрлері бар модельдер үшін, FRAP экспериментінің нәтижесі модельдің барлық параметрлерін бағалау үшін жеткіліксіз болуы мүмкін. Осыған байланысты, қосымша деректер қажет, мысалы, әртүрлі өлшемдегі аймақтарды ағарту, кейбір модель параметрлерін тәуелсіз түрде анықтау және т.б.