Кіріспе

Көрінетін жарықты пайдаланатын микроскоп. Оптикалық микроскоп, сондай-ақ жарық микроскопы деп те аталады, бұл микроскоптың түрі, ол көрінетін жарықты және линзалар жүйесін пайдаланып кішкентай объектілердің ұлғайтылған кескіндерін жасайды. Оптикалық микроскоптар – микроскоптардың ең ежелгі түрі және олардың қазіргі күрделі құрамы 17 ғасырда ойлап табылуы мүмкін. Негізгі оптикалық микроскоптар өте қарапайым болуы мүмкін, бірақ көптеген күрделі конструкциялар ажыратымдылықты және үлгінің контрастын жақсартуға бағытталған. Объекті сахнаға қойылады және микроскоптың бір немесе екі окуляры арқылы тікелей қарауға болады. Жоғары қуатты микроскоптарда екі окуляр да әдетте бірдей кескінді көрсетеді, бірақ стереомикроскопта 3D эффектін жасау үшін сәл өзгеше кескіндер қолданылады. Кескінді түсіру үшін әдетте камера қолданылады (микрограф). Үлгіні әртүрлі тәсілдермен жарықтандыруға болады. Мөлдір объектілерді төменнен, ал қатты объектілерді объектив линза арқылы (жарық өрісі) немесе оның айналасынан (қараңғы өріс) жарықтандыруға болады. Металл объектілерінің кристалдық бағытын анықтау үшін поляризацияланған жарық қолданылуы мүмкін. Фазалық контрастты бейнелеу, әртүрлі сындыру көрсеткіштеріне ие кішкентай бөлшектерді ерекшелеу арқылы кескіннің контрастын арттыру үшін қолданылады. Әдетте, мұнараға орнатылған әртүрлі ұлғайту деңгейлеріне ие объектив линзалар ұсынылады, оларды орнына бұруға және жақындату мүмкіндігін қамтамасыз етеді. Оптикалық микроскоптардың максималды ұлғайту қуаты көрінетін жарықтың шешілгіш қабілетінің шектеулі болуына байланысты әдетте 1000x шамасында шектеледі. Үлкен ұлғайтулар мүмкін болғанымен, объектінің қосымша егжей-тегжейлері анықталмайды. Көрінетін жарықты пайдаланбайтын оптикалық микроскопияның баламаларына сканерлеуші электрондық микроскопия, трансмиссиялық электрондық микроскопия және сканерлеуші зондты микроскопия жатады, нәтижесінде олар әлдеқайда жоғары ұлғайтуға қол жеткізе алады.

Түрлері

Оптикалық микроскоптардың негізгі екі түрі бар: қарапайым микроскоптар және құрама микроскоптар. Қарапайым микроскоп бір линзаның немесе линзалар тобының оптикалық күші арқылы ұлғайтуды жүзеге асырады. Ал құрама микроскоп нысанды әлдеқайда жоғары ұлғайту үшін линзалар жүйесін пайдаланады (бір жиын линзалар екіншісінен алынған бейнені ұлғайтады). Қазіргі зерттеулерде қолданылатын микроскоптардың басым көпшілігі – құрама микроскоптар, ал кейбір арзан коммерциялық цифрлық микроскоптар қарапайым, бір линзалы микроскоптар болып табылады. Құрама микроскоптарды оптикалық құрамы, бағасы және қолдану мақсатына қарай түрлі түрлеріне бөлуге болады.

Қарапайым микроскоп

Қарапайым микроскоп объектіні тек бұрыштық ұлғайту арқылы үлкейту үшін линзаны немесе линзалар жиынтығын қолданады, көрерменге тік, үлкейтілген нақты емес бейне көрсетеді. Бір-бір бүкіл линзаның немесе линзалар тобының қолданылуы үлкейту көзілдірі, лупалар және телескоптар мен микроскоптар үшін окулярлар сияқты қарапайым үлкейту құрылғыларында кездеседі.

Цифрлық микроскоп

Цифрлық микроскоп – компьютер арқылы үлгіні бақылауға мүмкіндік беретін цифрлық камерамен жабдықталған микроскоп. Микроскоптар әртүрлі деңгейдегі автоматтандырумен ішінара немесе толықтай компьютерлік басқаруға ие болуы мүмкін. Цифрлық микроскопия микроскоп имиджін тереңірек талдауға мүмкіндік береді, мысалы, қашықтықтар мен аудандарды өлшеу, сондай-ақ флуоресценттік немесе гистологиялық бояудың мөлшерін анықтау. Төмен қуатты цифрлық микроскоптар, USB микроскоптары да саудада қолжетімді. Бұл, негізінен, жоғары қуатты макро линзасы бар веб-камералар және көбінесе трансиллюминация қолданбайды. Камера компьютердің USB портына тікелей қосылып, суреттерді мониторда дереу көрсетеді. Олар көзқарастарды пайдалану қажеттілігінсіз, шамамен 200 есеге дейін қарапайым ұлғайтуды ұсынады және өте төмен бағалы. Жоғары қуатты жарықтандыруды әдетте камера линзасына жақын орналасқан LED көзі немесе көздер қамтамасыз етеді. Сезімтал фотондарды санау цифрлық камераларын пайдаланып, осал биологиялық үлгілерге зиян келтірмеу үшін өте төмен жарық деңгейінде цифрлық микроскопия жасауға болады. Бір-бірімен байланысты фотондарды ұсынатын жарық көзі ең жарыққа сезімтал үлгілердің зақымдану қаупін азайтатыны дәлелденді. Фотондар аз микроскопияға арналған осы «қосымша бейнелеу» әдісінде үлгі инфрақызыл фотондармен жарықтандырылады, олардың әрқайсысы фотонды санау камерасымен тиімді бейнелеу үшін көрінетін спектрдегі байланысты серіктесімен кеңістікте байланысты.

Өнертабыс

Ең алғашқы микроскоптар 13 ғасырда көзілдірікте линзалардың кеңінен қолданылған кезінен бастап, шектеулі ұлғаю мүмкіндігі бар бір линзалы ұлғайтқыштар болды. Құрама микроскоптар алғаш рет Еуропада 1620 жылдары пайда болды, оның ішінде Лондонда Корнелис Дреббельдің (шамамен 1621 жылы) көрсеткені және 1624 жылы Римде көрмеге қойылғандары бар. Көптеген жылдар бойы көптеген талаптар айтылса да, құрама микроскопты кімнің ойлап тапқаны белгісіз. Осы талаптардың бірі – голландиялық көзілдірік жасаушы Йоханнес Закариассеннің 1590 жылы оның әкесі Захариас Янссен құрама микроскопты және/немесе телескопты ойлап тапқаны туралы мәлімдемесі. Йоханнес берген куәлік, кейбіреулер күмәнді деп санайтын, өнертабыстың мерзімін Захарияның сол кезде бала болған кезіне дейін ықпалдайды, бұл Йоханнес айтқанның рас болуы үшін құрама микроскопты Йоханнестің әкесі Ханс Мартенс ойлап тапқан болуы керек деген болжамға әкеледі. Тағы бір талап бойынша, Янссеннің бәсекелесі Ханс Липпершей (1608 жылы алғашқы телескопқа патент алған) де құрама микроскопты ойлап тапқан. Басқа тарихшылар 1621 жылы голландиялық инноватор Корнелис Дреббельдің құрама микроскопын жасағанын көрсетеді. және/немесе кішкентай нысандарды үлкейту үшін кері бағытта қарауға болады. Бір ғана кемшілігі – оның 60 см (2 фут) ұзындықтағы телескопын 180 см (6 фут) дейін созу қажет болды, осылай жақын нысандарды көруге болады. 1624 жылы Римде Дреббельдің құрастырған микроскопын көрген Галилей өзінің жетілдірілген нұсқасын жасады (Галилей оны "occhiolino" немесе "кішкентай көз" деп атады). Фабер бұл атауды грек сөздерінен алды: μικρόν (микрон) – "кішкентай" және σκοπεῖν (скопейн) – "қарау", бұл атау "телескоп" сөзімен салыстырылады, осы сөзді де Линсейлер ойлап тапқан. Голландиялық тағы бір ғалым Христиан Гюйгенс 17 ғасырдың соңында ахроматтық түзетуі бар қарапайым 2 линзалы көз жүйесін жасады, бұл микроскопты дамытуда үлкен қадам болды. Гюйгенс көзі әлі де шығарылуда, бірақ оның көру өрісі шағын және басқа да ұсақ кемшіліктері бар.

Халыққа танымал ету

Антоний ван Левенгук (1632–1724 жж.) микроскопты биологтар назарына жеткізген адам деп есептеледі, тіпті қарапайым ұлғайтқыш линзалар 16 ғасырда-ақ жасала бастаған болатын. Ван Левенгук өз үйінде жасаған микроскоптар бір ғана, өте кішкентай, бірақ күшті линзасы бар қарапайым микроскоптар еді. Оларды пайдалану ыңғайлы болмаса да, ван Левенгукке егжей-тегжейлі бейнелерді көруге мүмкіндік берді. Көп линзаларды дұрыс орналастырудағы қиындықтарға байланысты, құрама микроскоп ван Левенгук жасаған қарапайым микроскоптармен салыстырылатын сапалы бейне бере бастауға 150 жылға жуық оптикалық даму қажет болды. 1850 жылдары Тулан университетінің химия профессоры Джон Леонард Ридделл холераға қатысты алғашқы және ең ауқымды американдық микроскоптық зерттеулер жүргізе отырып, алғашқы практикалық бинокулярлық микроскопты ойлап тапты.

Жарықтандыру техникасы

Микроскоптың негізгі технологиясы мен оптикасы 400 жылдан астам уақыттан бері қолданылып келеді, бірақ қазіргі кездегі жоғары сапалы суреттерді алуға мүмкіндік беретін үлгіні жарықтандыру әдістері соңғы уақытта ғана дамыды. 1893 жылдың тамызында Август Кёлер Кёлер жарықтандыруын ойлап тапты. Үлгіні жарықтандырудың осы әдісі өте біркелкі жарықтандыруды қамтамасыз етеді және бұрынғы үлгіні жарықтандыру техникаларының көптеген кемшіліктерін жояды. Кёлер жарықтандыруын жасауға дейін, мысалы, шамның спиралі сияқты жарық көзі үлгінің суретінде әрқашан көрінетін. 1953 жылы физика саласындағы Нобель сыйлығы голланд физигі Фриц Зерникеге мөлдір үлгілерді суретке түсіруге мүмкіндік беретін фазалық контраст жарықтандыруын жасағаны үшін берілді. Жарықты сіңірудің орнына интерференцияны пайдалану арқылы, тірі сүтқоректі жасушалары сияқты өте мөлдір үлгілерді бояу қажеттілігінсіз суретке түсіруге болады. Одан кейін, екі жыл өткен соң, 1955 жылы Жорж Номарски дифференциалдық интерференциялық контраст микроскопиясының теориясын жариялады, бұл тағы бір интерференцияға негізделген суретке түсіру техникасы.

Флуоресценттік микроскопия

Қазіргі заманғы биологиялық микроскопия жасуша ішіндегі нақты құрылымдарды анықтау үшін флуоресценттік зондтарды дамытуға тікелей байланысты. Көне трансиллюминациялық жарық микроскопиясынан өзгеше, флуоресценциялық микроскопияда үлгі объектив арқылы жарықтың тар спектрлі толқындарымен жарықтандырылады. Бұл жарық үлгідегі флюорофорлармен өзара әрекеттеседі, олар ұзын толқынды жарық шығарады. Сурет осы шығарылған жарықтан құралады. 20 ғасырдың ортасынан бері ДНК-мен байланысатын DAPI сияқты химиялық флуоресценттік бояулар жасуша ішіндегі белгілі бір құрылымдарды белгілеу үшін қолданылып келеді. Жақындағы жетістіктерге иммунофлуоресценция жатады, ол үлгідегі нақты белоктарды тану үшін флуоресценттік таңбаланған антиденелерді пайдаланады, сондай-ақ GFP сияқты флуоресценттік белоктар, оларды тірі жасуша өздігінен өндіріп, флуоресцентті болуына мүмкіндік береді.

Көздің көзқарас (көздің линзасы)

Көздік линза, немесе окуляр, екі немесе одан көп линзадан тұратын цилиндр. Оның қызметі – көзге суретті нақтылап көрсету. Окуляр микроскоптың түтікшесінің жоғарғы жағына салынады. Окулярлар алмастырылатын болып келеді және әртүрлі үлкейту дәрежесі бар әртүрлі окулярларды орнатуға болады. Окулярлардың қалыпты үлкейту шамалары 5×, 10× (ең көп қолданылатыны), 15× және 20×. Кейбір жоғары сапалы микроскоптарда объектив линзасы мен окулярдың оптикалық құрылымы ең жақсы оптикалық нәтиже беру үшін үйлестіріледі. Бұл көбінесе апохроматтық объективтерде кездеседі.

Объективті мұнара (револьвер немесе айналдырушы тұмсық)

Объективтік мұнара, револьвер немесе айналмалы мұрын бөлігі – объектив линзалар жиынтығын ұстайтын бөлік. Ол пайдаланушыға объектив линзаларын алмастыруға мүмкіндік береді.

Объективті линза

Типикалық құрама оптикалық микроскоптың төменгі жағында үлгіден жарық жинауға арналған бір немесе бірнеше объектив линзалары болады. Объектив әдетте шыныдан жасалған, бір немесе бірнеше элементтен тұратын линзасы бар цилиндр тәрізді корпуста орналасады. Көбінесе, айналмалы мұрынға бұралған үш объектив линзасы болады, оларды қажетті объективті таңдау үшін айналдыруға болады. Бұл конструкциялар парфокальды болу үшін жасалған, яғни микроскопта бір линзадан екіншісіне ауысқанда үлгі фокусқа қалады. Микроскоп объективтері екі параметрмен сипатталады: ұлғайту және сандық апертура. Біріншісі әдетте 5×-тен 100×-ке дейін, ал екіншісі 0,14-тен 0,7-ге дейін өзгереді, бұл сәйкесінше шамамен 40-тан 2 мм-ге дейінгі фокустық қашықтықтарға сәйкес келеді. Жоғары ұлғайтуға ие объективтерде әдетте сандық апертурасы жоғары болады және нәтижедегі кескіндегі тереңдік аз болады. Кейбір жоғары өнімділіктегі объективтер ең жақсы оптикалық көрсеткіштерді алу үшін сәйкес келетін окулярларды қажет етуі мүмкін.

Майға батыру объективі

Кейбір микроскоптар жоғары үлкейтуде жақсырақ ажыратымдылыққа қол жеткізу үшін майға немесе суға батырылатын объективтерді пайдаланады. Бұл объективтер, майға батыру майы немесе су сияқты жарық сыну көрсеткіші сәйкес келетін материалмен және объектив линзасы мен үлгінің арасындағы арнайы жамылғыш шынымен қолданылады. Жарық сыну көрсеткіші сәйкес келетін материалдың ауадан жоғары болуы, объектив линзасының сандық апертурасының үлкенірек (1-ден жоғары) болуына мүмкіндік береді, соның арқасында жарық үлгіден объектив линзасының сыртқы бетіне ең аз бұрылыспен жетеді. Сандық апертура 1,6-ға дейін жете алады. Үлкен сандық апертура көбірек жарық жинауға мүмкіндік береді, бұл кішкентай бөлшектерді егжей-тегжейлі қарауға жағдай жасайды. Майға батырылатын линза әдетте 40-100 есе үлкейтуге ие.

Фокус түймешіктері

Бағыттауыш түймелері сахнаны жоғары және төмен жылжытады, ал оның ішінде жалпы және дәл фокус үшін жеке реттеулер бар. Осы басқару элементтері микроскопты әртүрлі қалыңдықтағы сынамаларға бейімдеуге мүмкіндік береді. Микроскоптардың ескі конструкцияларында фокусты реттеу дөңгелектері тұғырға қатысты микроскоп түтігін жоғары немесе төмен жылжытатын болса, сахнасы бекітілген болатын.

Қалқа

Бүкіл оптикалық құрастырма дәстүрлі түрде берік қолға бекітіледі, ал ол өз кезегінде қажетті қаттылықты қамтамасыз ету үшін мінсіз U пішіндес тіреуге бекітіледі. Көзқарасты реттеуге мүмкіндік беру үшін қолдың бұрышы реттелуі мүмкін. Рама микроскоптың әртүрлі басқару элементтерін орнатуға арналған нүктені қамтамасыз етеді. Әдетте, бұл фокусты реттеуге арналған басқару элементтерін қамтиды, әдетте ірі фокусты реттеу үшін үлкен тірелмелі дөңгелек, сондай-ақ ұсақ фокусты басқару үшін кішірек тірелмелі дөңгелек. Басқа мүмкіндіктерге шамды басқару элементтері және/немесе конденсорды реттеуге арналған басқару элементтері жатуы мүмкін.

Сахна

Сцена – объектив линзасының астындағы платформа, ол қаралып жатқан үлгіні ұстап тұрады. Сценаның ортасында жарық өтетін тесік бар, ол үлгіні жарықтандыруға мүмкіндік береді. Сценада әдетте слайдтарды (көлденеңі 25×75 мм болатын тікбұрышты шыны тақталар, оларға үлгі орнатылады) ұстауға арналған иірімдер болады. 100×-тен жоғары ұлғайтуда слайдты қолмен жылжыту қиын. Орташа және жоғары бағалы микроскоптарда кездесетін механикалық сцена, басқару түймелері арқылы слайдты аз-аздап жылжытуға және үлгіні қалауынша орналастыруға мүмкіндік береді. Егер микроскопта бастапқыда механикалық сцена болмаса, оны қосуға болады. Барлық сценалар фокусқа келтіру үшін жоғары және төмен жылжиды. Механикалық сценада слайдтар екі көлденең ось бойымен жылжиды, бұл үлгіні тексеру үшін оның орнын дұрыс табуға көмектеседі. Фокусқа келтіруді пайдаланушының үлгіні сценаның ортасына келтіруі үшін төменгі ұлғайтудан бастау керек. Жоғары ұлғайтуға көшкенде, қайта фокусқа келтіру үшін сценаны тік бойымен жоғары көтеру қажет, сондай-ақ үлгінің көлденең орнын аздап реттеу қажет болуы мүмкін. Механикалық сценаның болуының себебі – үлгінің көлденең орнын реттеуге қолайлы болуы. Үлгіні дайындау және оны слайдқа орнату қиын болғандықтан, балалар үшін дайын слайдтармен бастау жақсы, олар орталықтандырылған және қолданылатын фокус деңгейіне қарамастан, оңай фокусқа келтіріледі.

Жарық көзі

Жарық көздерін көптеп пайдалануға болады. Ең қарапайым түрінде, күн сәулесі айна арқылы бағытталады. Дегенмен, көптеген микроскоптардың өздеріне реттеліп, басқарылатын жарық көзі бар – көбінесе галогендік шам, бірақ LED және лазерлерді пайдалану жиі кездесетін мүмкіндікке айналуда. Көбінесе қымбат құралдарда Кёлер жарығы қолданылады.

Конденсатор

Конденсатор – жарық көзінен шыққан жарықты үлгіге шоғырландыруға арналған линза. Конденсатор жарықтың сапасы мен қарқындылығын реттеу үшін диафрагма және/немесе сүзгілер сияқты қосымша мүмкіндіктерге де ие болуы мүмкін. Қараңғы дала, фазалық контраст және дифференциалдық интерференциялық контраст микроскопиясы сияқты жарықтандыру техникалары үшін қосымша оптикалық компоненттерді жарық жолында дәл орналастыру қажет.

Үлкендеу

Құрама оптикалық микроскоптың нақты ұлғайтуы – бұл окуляр және объектив линзасының ұлғайту шамаларының көбейтіндісі. Мысалы, 10x ұлғайтуы бар окуляр және 100x ұлғайтуы бар объектив линзасы 1000x жалпы ұлғайту береді. Майды немесе ультракүлгін сәулелерді қолдану сияқты өзгертілген жағдайлар ажыратымдылықты арттырып, 1000x-тан жоғары ұлғайтуда ерекше бөлшектерді көруге мүмкіндік береді.

Жарықтандыру әдістері

Көптеген әдістер бар, олар үлгіден жақсартылған контрастты сурет алу үшін жарық жолын өзгертеді. Үлгіден контрастты арттырудың негізгі әдістері: көлденең поляризацияланған жарық, қараңғы дала, фазалық контраст және дифференциалдық интерференциялық контрастты жарықтандыру. Жақындағы (Sarfus) әдісі нанометрлік үлгілерді көру үшін көлденең поляризацияланған жарық пен контрасты күшейткен арнайы слайдтарды біріктіреді.

Қолданбалар

Оптикалық микроскопия микроэлектроникада, нанофизикада, биотехнологияда, фармацевтикалық зерттеулерде, минералогияда және микробиологияда кеңінен қолданылады. Оптикалық микроскопия медициналық диагностика үшін қолданылады, тіндерді зерттегенде бұл сала гистопатология деп аталады, ал бос жасушалар немесе тіндік фрагменттерді зерттегенде – жағынды сынамасы деп аталады. Өнеркәсіптік қолдануда бинокулярлы микроскоптар жиі қолданылады. Нақты тереңдік сезімі қажет болмаса, екі көзді құрылымдарды пайдалану микроскопиялық станцияда ұзақ жұмыс істеуден туындайтын көз шаршауын азайтады. Кейбір жағдайларда ұзақ жұмыс арақашықтығы немесе ұзақ фокусты микроскоптар тиімді. Зерттелетін нысанды терезе артында қарау қажет болуы мүмкін, немесе өнеркәсіптік нысандар объективке зиян келтіруі мүмкін. Мұндай оптика жақын фокусқа ие телескоптарға ұқсайды. Дәл өлшеулер үшін өлшеу микроскоптары қолданылады. Олардың негізгі екі түрі бар. Біреуі фокустық жазықтықтағы қашықтықты өлшеуге мүмкіндік беретін шкаламен жабдықталған. Екінші (ескі) түрінде қарапайым жіптер мен нысанды микроскопқа қатысты жылжытуға арналған микрометрлік механизм болады. Өте кішкентай, портативті микроскоптар зертханалық микроскопты алып жүру қиын болған жағдайларда қолданылады.

Шектеулер

Өткізілетін жарықпен өте жоғары ұлғайту кезінде нүктелік нысандар дифракциялық сақиналармен қоршалған тұманды дискілер ретінде көрінеді. Бұлар Эйри дискілері деп аталады. Микроскоптың ажыратымдылығы – екі жақын орналасқан Эйри дискісін ажырату қабілеті (яғни, микроскоптың жақын орналасқан құрылымдық ерекшеліктерді анық және бөлек көрсету қабілеті). Дәл осы дифракцияның әсері нәзік бөлшектерді ажырату мүмкіндігін шектейді. Дифракциялық үлгілердің мөлшері мен шамасы жарықтың толқын ұзындығына (λ), объектив линзасын жасау үшін қолданылған сыну материалдарына және объектив линзасының сандық апертурасына (NA) байланысты. Сондықтан объектив өрісіндегі жеке нүктелерді ажыратудың шегі бар, ол дифракция шегі деп аталады. Егер бүкіл оптикалық жүйедегі оптикалық аберрациялар ескерілмесе, d ажыратымдылығын былай көрсетуге болады:

Көбінесе 550 нм толқын ұзындығы қолданылады, бұл жасыл жарыққа сәйкес келеді. Ауа сыртқы орта ретінде қолданылғанда ең жоғары практикалық NA 0,95-ке тең, ал май қолданылғанда – 1,5-ке дейін жетеді. Іс жүзінде дәстүрлі линзалармен алынатын d ең төменгі мәні шамамен 200 нм құрайды. Жарықтың көп рет шашырауы арқасында жасалған линзаның жаңа түрі ажыратымдылықты 100 нм-ден төменге дейін жақсартуға мүмкіндік берді.

Қателік шегінен асып кету

Жоғарыда сипатталған беріліп тұратын жарық шегінен асып түсетін ажыратымдылыққа жету үшін бірнеше техникалар бар. 1979 жылы Куржон мен Булабуа сипаттаған голографиялық техникалар да осы ажыратымдылық шегін бұзуға қабілетті, бірақ олардың тәжірибелік талдауында ажыратымдылық шектеулі болды. Флуоресцентті сынамаларды қолдану арқылы тағы да көптеген техникалар қолжетімді. Мысалдарға Vertico SMI, жоғалу толқындарын пайдаланатын жақын дала сканерлеуші оптикалық микроскопия және стимулданған эмиссияның әлсіреуі кіреді. 2005 жылы бір молекуланы анықтауға қабілетті микроскоп оқу құралы ретінде сипатталды. Соңғы он жылдағы маңызды прогреске қарамастан, дифракция шегінен асып түсуге арналған техникалар әлі де шектеулі және мамандандырылған. Көптеген техникалар көлденең ажыратымдылықты арттыруға бағытталған, бірақ өте жұқа сынамаларды талдауға мүмкіндік беретін техникалар да бар. Мысалы, sarfus әдістері жұқа сынаманы контрастты арттыратын бетке орналастырады, соның арқасында 0,3 нанометрге дейін жұқа қабықшаларды тікелей көруге болады. 2014 жылдың 8 қазанында Эрик Бетциг, Уильям Моернер және Стефан Хеллге суперрезолюциялы флуоресценциялық микроскопияны жасағаны үшін химия саласындағы Нобель сыйлығы табысталды.

Құрылымдық жарықтандыру SMI

SMI (кеңістікте модульденген жарықтандыру микроскопиясы) – нүктелік таралу функциясы (PSF) инженериясының жеңіл оптикалық процесі. Бұл процестер микроскоптың PSF-ын тиімді өзгертіп, оптикалық ажыратымдылықты арттыруға, жарық толқынының ұзындығына қарағанда кішкентай флуоресценттік объектілердің қашықтығын өлшеудің дәлдігін жоғарылатуға немесе нанометрлік диапазондағы басқа құрылымдық параметрлерді анықтауға мүмкіндік береді.

Жергілікті микроскопия SPDMфимод

SPDM (спектрлік дәлдік қашықтық микроскопиясы), негізгі локализациялық микроскопия технологиясы – флуоресценттік микроскопияның жарық оптикалық процесі, ол "оптикалық оқшауланған" бөлшектердің (мысалы, молекулалардың) орналасуын, қашықтығын және бұрышын жарық микроскопиясының теориялық шешілім лимитінен әлдеқайда төмен өлшеуге мүмкіндік береді. "Оптикалық оқшауланған" дегеніміз – белгілі бір уақыт кезеңінде дәстүрлі оптикалық шешіліммен (әдетте шамамен 200–250 нм диаметр) анықталатын аймақтағы тек бір ғана бөлшектің/молекуланың тіркелуде. Бұл, егер мұндай аймақтағы молекулалардың барлығы әртүрлі спектрлік маркерлерді (мысалы, әртүрлі түстер немесе әртүрлі бөлшектердің жарық шығаруындағы басқа да пайдалы айырмашылықтар) тасыса мүмкін болады. GFP, Alexa бояулары, Atto бояулары, Cy2/Cy3 және флуоресцеин молекулалары сияқты көптеген стандартты флуоресцентті бояулар, белгілі бір фотофизикалық шарттар орындалған жағдайда локализациялық микроскопия үшін қолданылуы мүмкін. Осы SPDMphymod (физикалық түрде өзгертілген флуорофорлар) технологиясын пайдалану арқылы наносуретке түсіру үшін сәйкес интенсивтіліктегі бір ғана лазер толқын ұзындығы жеткілікті.

3D супер қаталдық микроскопиясы

Стандартты флуоресцентті бояулармен 3D супердеректі микроскопияны стандартты флуоресцентті бояуларға арналған SPDMphymod локализациялық микроскопиясы мен құрылымдық жарықтандыру SMI әдістерін біріктіру арқылы жүзеге асыруға болады.

STED

Ынталандырылған эмиссияның әлсіреуі – дифракция шегінен жоғары ажыратымдылыққа қол жеткізудің қарапайым мысалы, бірақ оның маңызды шектеулері бар. STED – бұл флуоресценттік микроскопия техникасы, ол үлгідегі флуоресцентті молекулалардың шағын топтарында флуоресценцияны тудыру үшін жарық импульстарының комбинациясын пайдаланады. Әрбір молекула кескінде дифракциялық шектелген жарық нүктесін жасайды, және осы нүктелердің әрқайсысының ортасы молекуланың орналасқан жеріне сәйкес келеді. Флуоресценттік молекулалардың саны аз болғандықтан, жарық нүктелерінің бірімен-бірі беттесуі ықтимал емес, сондықтан оларды дәл орналастыруға болады. Бұл процесс кескін жасау үшін көп рет қайталанады. Макс Планк биофизикалық химия институтының ғалымы Стефан Хелл STED микроскопын және осымен байланысты әдістемелерді әзірлегені үшін 2006 жылы 10-шы Германияның болашақ сыйлығымен және 2014 жылы химия бойынша Нобель сыйлығымен марапатталды.