Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Пептидтер өндірісі
Production of peptides
Органикалық химияда пептид синтезі – пептидтердің өндірісі, яғни бірнеше аминқышқылы амидтік байланыстар арқылы біріккен қосылыстар. Пептидтер бір аминқышқылының карбоксил тобының екінші аминқышқылының амин тобымен конденсациялық реакция арқылы химиялық жолмен синтезделеді. Әртүрлі аминқышқылының тізбектерімен немесе бүйір тізбектерімен болатын немесе олардан туындайтын қосымша реакциялардың алдын алу үшін қорғау топтарын қолдану стратегиясы әдетте қажет. Химиялық пептид синтезі көбінесе пептидтің карбоксил ұшынан (С-ұшынан) басталып, амин ұшына (N-ұшына) қарай жүзеге асырылады. Тірі организмдердегі ақуыз биосинтезі (ұзын пептидтер) кері бағытта өтеді. Пептидтердің химиялық синтезін классикалық ерітінділік фазадағы әдістер арқылы жүргізуге болады, бірақ зерттеу және әзірлемелердің көп бөлігінде олар қатты фазалық әдістермен алмастырылды (төменде қараңыз). Сонымен қатар, ерітінділік фазадағы синтез өнеркәсіптік мақсаттар үшін пептидтерді ірі көлемде өндіруде маңыздылығын сақтайды. Химиялық синтез бактерияларда өндіру қиын пептидтерді жасауға, табиғи емес аминқышқылдарын қосуға, пептид/ақуыз тірекшесін өзгертуге және D-аминқышқылынан тұратын D-ақуыздарды синтездеуге мүмкіндік береді.
In organic chemistry, peptide synthesis is the production of peptides, compounds where multiple amino acids are linked via amide bonds, also known as peptide bonds. Peptides are chemically synthesized by the condensation reaction of the carboxyl group of one amino acid to the amino group of another. Protecting group strategies are usually necessary to prevent undesirable side reactions with the various amino acid side chains. Chemical peptide synthesis most commonly starts at the carboxyl end of the peptide (C terminus), and proceeds toward the amino terminus (N terminus). Protein biosynthesis (long peptides) in living organisms occurs in the opposite direction. The chemical synthesis of peptides can be carried out using classical solution phase techniques, although these have been replaced in most research and development settings by solid phase methods (see below). Solution phase synthesis retains its usefulness in large scale production of peptides for industrial purposes moreover. Chemical synthesis facilitates the production of peptides that are difficult to express in bacteria, the incorporation of unnatural amino acids, peptide/protein backbone modification, and the synthesis of D proteins, which consist of D amino acids.
Қатты фаза синтезі
Зертханада синтетикалық пептидтерді өндірудің белгілі әдісі қатты фазалы пептид синтезі (ҚФПС) деп аталады. ҚФПС аминқышқылдарының туындыларының тізбектей реакциялары арқылы макроскопиялық түрде ерімейтін, ісінген кедір-бұдырлы шайыр тірегінде пептидтік тізбектің жылдам құрастырылуын қамтамасыз етеді. Қатты тірек – жаңа пайда болған пептидтік тізбекке байланысатын реакциялық топтармен (мысалы, амин немесе гидроксил топтары) функционалдастырылған кішкентай полимерлі шайыр кедірлерінен тұрады. Тазарту процесі, әсіресе ұзын пептидтер үшін қиынға соғуы мүмкін, себебі қажетті пептидтік өнімге ұқсас қасиеттері бар көптеген қосалқы өнімдердің жиынтық мөлшерін жою қажет. Осы себепті MCSGP сияқты үздіксіз хроматографиялық процестер коммерциялық өндірісте тазалықты төмендетпей, өнімділікті арттыру үшін көбірек қолданылуда. ҚФПС реакцияның нәтижесіне байланысты шектеледі, себебі қосалқы өнімдердің экспоненциалды жинақталуы байқалады, және әдетте 70 аминқышқылынан тұратын пептидтер мен ақуыздар синтетикалық қолжетімділіктің шегіне жақындайды. Ұзын тізбекті пептидтерді алу үшін, мысалы, екі қысқа, толық депротекцияланған синтетикалық пептидті ерітіндіде біріктіретін нативті химиялық лигация сияқты лигациялық тәсілдер қолданылады.
The established method for the production of synthetic peptides in the lab is known as solid phase peptide synthesis (SPPS). SPPS allows the rapid assembly of a peptide chain through successive reactions of amino acid derivatives on a macroscopically insoluble solvent swollen beaded resin support. The solid support consists of small, polymeric resin beads functionalized with reactive groups (such as amine or hydroxyl groups) that link to the nascent peptide chain. The purification process, especially of longer peptides can be challenging, because cumulative amounts of numerous minor byproducts, which have properties similar to the desired peptide product, have to be removed. For this reason so called continuous chromatography processes such as MCSGP are increasingly being used in commercial settings to maximize the yield without sacrificing purity. SPPS is limited by reaction yields due to the exponential accumulation of by products, and typically peptides and proteins in the range of 70 amino acids are pushing the limits of synthetic accessibility. are difficult to make. Longer lengths can be accessed by using ligation approaches such as native chemical ligation, where two shorter fully deprotected synthetic peptides can be joined in solution.
Пептидті біріктіру реагенттері
SPPS-тің кеңінен қолданылуына мүмкіндік берген маңызды ерекшелік – біріктіру кезеңінде өте жоғары шығымдылыққа қол жеткізу, сондай-ақ әрбір аминқышқылының артық мөлшерін (2-ден 10 есеге дейін) қосу болып табылады. Біріктіру кезінде аминқышқылының рацемизациясын барынша азайту, соңғы пептид өнімінде эпимеризацияның алдын алу үшін өте маңызды. Амин мен карбон қышқылы арасындағы амидтік байланыс қалыптасуы баяу болғандықтан, көбінесе «біріктіру реагенттері» немесе «активаторлар» қажет болады. Әртүрлі біріктірулер үшін әртүрлі тиімділіктеріне байланысты көптеген біріктіру реагенттері бар, олардың көпшілігі коммерциялық түрде қолжетімді.
An important feature that has enabled the broad application of SPPS is the generation of extremely high yields in the coupling step. and adding an excess of each amino acid (between 2 and 10 fold). The minimization of amino acid racemization during coupling is also of vital importance to avoid epimerization in the final peptide product. Amide bond formation between an amine and carboxylic acid is slow, and as such usually requires 'coupling reagents' or 'activators'. A wide range of coupling reagents exist, due in part to their varying effectiveness for particular couplings, many of these reagents are commercially available.
Карбодимидтер
N-терминалды Fmoc қорғанысын қолдану Boc/Bzl SPPS-ке қарағанда жұмсақ депротекция схемасын пайдалануға мүмкіндік береді, және бұл қорғау схемасы SPPS жағдайында толыққанды ортогоналды болып табылады. Fmoc депротекциясы негізді пайдаланады, әдетте DMF-та 20–50% пиперидин. Соның нәтижесінде алынған таза пептид TFA тұзы түрінде шығады, оны Boc SPPS-де алынған фтор тұздарына қарағанда еріту қиынырақ. Fmoc/tBu SPPS атомдық тиімділік тұрғысынан кем артықшылықты, себебі флуоренил тобы Boc тобынан әлдеқайда ірі. Сәйкесінше, Fmoc аминқышқылының бағасы 1990 жылдары алғаш синтезделген пептидтік дәрілердің бірі – энфувиртидтің ірі масштабты сынақтары басталғанға дейін жоғары болды, сол кезде нарықтық сұраныс Fmoc және Boc аминқышқылының салыстырмалы бағаларын теңгерді.
The use of N terminal Fmoc protection allows for a milder deprotection scheme than used for Boc/Bzl SPPS, and this protection scheme is truly orthogonal under SPPS conditions. Fmoc deprotection utilizes a base, typically 20–50% piperidine in DMF. The resulting crude peptide is obtained as a TFA salt, which is potentially more difficult to solubilize than the fluoride salts generated in Boc SPPS. Fmoc/tBu SPPS is less atom economical, as the fluorenyl group is much larger than the Boc group. Accordingly, prices for Fmoc amino acids were high until the large scale piloting of one of the first synthesized peptide drugs, enfuvirtide, began in the 1990s, when market demand adjusted the relative prices of Fmoc vs Boc amino acids.
Бензилоксикарбонил
(Z) тобы – карбаматты типтегі тағы бір амин қорғау тобы, оны Леонидас Зервас 1930-жылдардың басында ашқан және әдетте бензил хлороформатпен реакция арқылы енгізіледі. Ол HBr-ді сірке қышқылында қатаң жағдайларда немесе катализдік сутегіленудің жұмсақ жағдайларында алынып тасталады. Бұл әдістеме алғаш рет 1932 жылы Зервас және Макс Бергманн олигопептидтерді синтездеуде қолданды. Содан бері бұл Бергманн-Зервас синтезі деп аталады, ол "эпоха жасайтын" деп сипатталды және синтетикалық пептид химиясын жеке ғылым саласы ретінде қалыптастыруға көмектесті. Протеин микромассивтерін қамтитын синтез кезеңдері сияқты арнайы қолданулар үшін кейде "литографиялық" деп аталатын қорғау топтары қолданылады, олар белгілі бір толқын ұзындығындағы жарыққа фотохимиялық әрекетке ұшырауға бейім және осылайша литографиялық операциялар кезінде алынып тасталуы мүмкін.
The (Z) group is another carbamate type amine protecting group, discovered by Leonidas Zervas in the early 1930s and usually added via reaction with benzyl chloroformate. It is removed under harsh conditions using HBr in acetic acid, or milder conditions of catalytic hydrogenation. This methodology was first used in the synthesis of oligopeptides by Zervas and Max Bergmann in 1932. Hence, this became known as the Bergmann Zervas synthesis, which was characterised "epoch making" and helped establish synthetic peptide chemistry as a distinct field. For special applications like synthetic steps involving protein microarrays, protecting groups sometimes termed "lithographic" are used, which are amenable to photochemistry at a particular wavelength of light, and so which can be removed during lithographic types of operations.
Дисульфидті байланыстардың аймақтық іріктеуі
Бірнеше туа табиғи дисульфидтердің қалыптасуы қатты фазалық әдістермен туа пептид синтезі үшін қиындық туғызады. Кездейсоқ тізбек комбинациясы әдетте туа емес дисульфидтік байланыстармен бірнеше өнімге әкеледі. Дисульфидтік байланыстардың сатылап қалыптасуы әдетте артықшылықты әдіс болып табылады және тиолды қорғаушы топтармен жүзеге асырылады. Тиолдың әртүрлі қорғаушы топтары ортогональды қорғаудың бірнеше өлшемдерін қамтамасыз етеді. Бұл ортогональды қорғалған цистеиндер пептидтің қатты фазалық синтезі кезінде енгізіледі. Бұл топтарды бірінен соң бірі алып тастау, еркін тиол топтарын таңдап ашуға мүмкіндік беру үшін, дисульфидтің сатылап қалыптасуына әкеледі. Топтарды алып тастау реті бір уақытта бір ғана топты алып тастау үшін ескерілуі тиіс. Кейінірек региоселективті дисульфидтік байланыстардың қалыптасуын талап ететін пептид синтезінде қолданылатын тиолды қорғаушы топтар бірнеше сипаттамаларға ие болуы керек. Біріншіден, олар қорғалмаған бүйірлік тізбектерге әсер етпейтін жағдайларда қайтымды болуы керек. Екіншіден, қорғау тобы қатты фазалық синтез шарттарына төтеп беруге қабілетті болуы керек. Үшіншіден, тиолды қорғау тобын алып тастау басқа тиолды қорғау тобын бұзбауы керек, егер ортогональды қорғау қажет болса. Яғни, PG A-ны алып тастау PG B-ға әсер етуі тиіс емес. Тиолды қорғау үшін жиі қолданылатын топтарға ацетамидометил (Acm), трет-бутил (But), 3-нитро-2-пиридин сульфенил (NPYS), 2-пиридин сульфенил (Pyr) және тритил (Trt) топтары жатады. Бұл әдісті қолдана отырып, Кисо және әріптестері 1993 жылы инсулиннің алғашқы толық синтезін жүзеге асырды. Бұл жұмыста инсулиннің А тізбегі келесі қорғаушы топтармен дайындалды: CysA6(But), CysA7(Acm) және CysA11(But), ал CysA20 қорғалмаған күйде қалды.
The formation of multiple native disulfides remains challenging of native peptide synthesis by solid phase methods. Random chain combination typically results in several products with nonnative disulfide bonds. Stepwise formation of disulfide bonds is typically the preferred method, and performed with thiol protecting groups. Different thiol protecting groups provide multiple dimensions of orthogonal protection. These orthogonally protected cysteines are incorporated during the solid phase synthesis of the peptide. Successive removal of these groups, to allow for selective exposure of free thiol groups, leads to disulfide formation in a stepwise manner. The order of removal of the groups must be considered so that only one group is removed at a time. Thiol protecting groups used in peptide synthesis requiring later regioselective disulfide bond formation must possess multiple characteristics. First, they must be reversible with conditions that do not affect the unprotected side chains. Second, the protecting group must be able to withstand the conditions of solid phase synthesis. Third, the removal of the thiol protecting group must be such that it leaves intact other thiol protecting groups, if orthogonal protection is desired. That is, the removal of PG A should not affect PG B. Some of the thiol protecting groups commonly used include the acetamidomethyl (Acm), tert butyl (But), 3 nitro 2 pyridine sulfenyl (NPYS), 2 pyridine sulfenyl (Pyr), and trityl (Trt) groups. Using this method, Kiso and coworkers reported the first total synthesis of insulin in 1993. In this work, the A chain of insulin was prepared with following protecting groups in place on its cysteines: CysA6(But), CysA7(Acm), and CysA11(But), leaving CysA20 unprotected.
Тұрақты ағынды қатты фазалы пептид синтезі
Тұрақты ағынды пептид синтезіне қатысты алғашқы мақала 1986 жылы жарияланды, бірақ техникалық шектеулерге байланысты 2010 жылдардың басында ғана көптеген академиялық топтар пептидтерді жылдам синтездеу үшін үздіксіз ағынды қолдана бастады. Тұрақты ағын әдісінің дәстүрлі топтамалық әдістерге қарағандағы артықшылығы – реактивтерді жақсы температуралық бақылаумен қыздыру мүмкіндігі, бұл реакция кинетикасының жылдамдығын қамтамасыз етеді және жанама реакцияларды азайтады. Цикл уақыты реакция жағдайларына және реагент артық болуына байланысты 30 секундтан 6 минутқа дейін өзгереді. Резин көлемін бақылайтын UV/Vis спектроскопиясы сияқты онлайн-талдаулардың және өзгермелі төсек ағыны реакторын (VBFR) пайдалану арқасында резиннің жиналуын анықтап, біріктіру тиімділігін бағалауға болады.
The first article relating to continuous flow peptide synthesis was published in 1986, but due to technical limitations, it was not until the early 2010's when more academic groups started using continuous flow for the rapid synthesis of peptides. The advantages of continuous flow over traditional batch methods is the ability to heat reagents with good temperature control, allowing the speed of reaction kinetics while minimising side reactions. cycles times vary from 30 seconds, up to 6 minutes, depending on reaction conditions and excess of reagent. Thanks to inline analytics, such as UV/Vis spectroscopy and the use of Variable Bed Flow reactor (VBFR) that monitor the resin volume, on resin aggregation can be identified and coupling efficiency can be evaluated.
Ұзын пептидтерді синтездеу
Аминқышқылдары бірінен соң бірі қадамдық түрде жалғанатын қадамдық ұзарту, 2 мен 100 аралығындағы аминқышқыл қалдықтарын қамтитын шағын пептидтер үшін өте қолайлы. Тағы бір әдіс – фрагменттерді конденсациялау, онда пептид фрагменттері біріктіріледі. Алғашқысы рацемизациясыз пептидтік тізбекті ұзарта алса да, егер ол ұзын немесе жоғары полярлы пептидтерді жасауда ғана қолданылса, шығым төмендейді. Фрагменттік конденсация күрделі, ұзын пептидтерді синтездеу үшін қадамдық ұзартудан артық, бірақ рацемизацияға қарсы қорғау үшін оның қолданылуын шектеу қажет. Фрагменттерді конденсациялау да тиімсіз, себебі біріктірілген фрагменттердің көп мөлшерде болуы керек, бұл фрагменттің ұзындығына байланысты шектеу тудыруы мүмкін. Ұзын пептидтік тізбектерді өндірудің жаңа әдісі – химиялық лигация: қорғалмаған пептидтік тізбектер сулы ерітіндіде химиялық селективті реакцияға түседі. Алғашқы кинетикалық бақылаудағы өнім амидтік байланысты құру үшін қайта құрылымдалады. Табиғи химиялық лигацияның ең көп таралған түрі терминалды цистеин қалдықтарымен реакцияға түсетін пептидті тиоэстерді пайдаланады. Сулы ерітіндіде полипептидтерді ковалентті байланыстыруға қолданылатын басқа әдістерге бөлінген интейндерді, спонтанды изопептидтік байланыс пайда болуын және сортазалық лигацияны қолдану жатады. Ұзын пептидтерді синтездеуді оңтайландыру үшін Медикон аңғарында пептидтік тізбектерді түрлендіру әдісі әзірленді. Пептидтің C-терминалына альфа спираль тәрізді құрылымды индукциялау үшін қосылатын қарапайым пре-тізбек (мысалы, лизин (Lysn); глутамин қышқылы (Glun); (LysGlu)n). Бұл биологиялық жартылай өмірді ұзартуға, пептидтердің тұрақтылығын арттыруға және ферменттік ыдырауды тежеуге мүмкіндік береді, бірақ фармакологиялық белсенділік пен әсер ету профилін өзгертпейді.
Stepwise elongation, in which the amino acids are connected step by step in turn, is ideal for small peptides containing between 2 and 100 amino acid residues. Another method is fragment condensation, in which peptide fragments are coupled. Although the former can elongate the peptide chain without racemization, the yield drops if only it is used in the creation of long or highly polar peptides. Fragment condensation is better than stepwise elongation for synthesizing sophisticated long peptides, but its use must be restricted in order to protect against racemization. Fragment condensation is also undesirable since the coupled fragment must be in gross excess, which may be a limitation depending on the length of the fragment. A new development for producing longer peptide chains is chemical ligation: unprotected peptide chains react chemoselectively in aqueous solution. A first kinetically controlled product rearranges to form the amide bond. The most common form of native chemical ligation uses a peptide thioester that reacts with a terminal cysteine residue. Other methods applicable for covalently linking polypeptides in aqueous solution include the use of split inteins, spontaneous isopeptide bond formation and sortase ligation. In order to optimize synthesis of long peptides, a method was developed in Medicon Valley for converting peptide sequences. The simple pre sequence (e. g. Lysine (Lysn); Glutamic Acid (Glun); (LysGlu)n) that is incorporated at the C terminus of the peptide to induce an alpha helix like structure. This can potentially increase biological half life, improve peptide stability and inhibit enzymatic degradation without altering pharmacological activity or profile of action.
Резин циклдеуі туралы
Пептидтер қатты тіректерде циклдеуге қабілді. HBTU/HOBt/DIEA, PyBop/DIEA, PyClock/DIEA сияқты әртүрлі циклдеу реагенттерін қолдануға болады. Пептидтердің басынан құйрығына дейінгі тізбегі қатты тіректерде жасалуы мүмкін. C-ұшының белгілі бір нүктеде депротекциясы, шайырда амидтік байланыс арқылы депротекцияланған N-ұшымен циклдеуге мүмкіндік береді. Циклдеу аяқталғаннан кейін пептид қышқылдық гидролиз арқылы шайырдан бөлініп, тазартылады. Циклдік пептидтерді қатты фазада синтездеу стратегиясы Asp, Glu немесе Lys қосалқы тізбектері арқылы ғана шектелмейді. Цистеиннің қосалқы тізбегінде өте реактивті сульфгидрил тобы болады. Екі цистеиннің күкірт атомдары арасында ковалентті байланыс пайда болғанда дисульфидтік көпір құрылады, бұл көпірлер ақуыздарды, әсіресе жасушалардан шығарылатын ақуыздарды тұрақтандыруға көмектеседі. Кейбір зерттеушілер дисульфидтік байланыстың қалыптасуын болдырмау үшін S-ацетомидометил (Acm) тобын қолданып, цистеиннің модификацияланған түрін пайдаланады, бірақ цистеин мен ақуыздың бастапқы құрылымын сақтайды.
Peptides can be cyclized on a solid support. A variety of cyclization reagents can be used such as HBTU/HOBt/DIEA, PyBop/DIEA, PyClock/DIEA. Head to tail peptides can be made on the solid support. The deprotection of the C terminus at some suitable point allows on resin cyclization by amide bond formation with the deprotected N terminus. Once cyclization has taken place, the peptide is cleaved from resin by acidolysis and purified. The strategy for the solid phase synthesis of cyclic peptides is not limited to attachment through Asp, Glu or Lys side chains. Cysteine has a very reactive sulfhydryl group on its side chain. A disulfide bridge is created when a sulfur atom from one Cysteine forms a single covalent bond with another sulfur atom from a second cysteine in a different part of the protein. These bridges help to stabilize proteins, especially those secreted from cells. Some researchers use modified cysteines using S acetomidomethyl (Acm) to block the formation of the disulfide bond but preserve the cysteine and the protein's original primary structure.
Резиннен тыс циклдендіру
Резинсіз циклдену – негізгі аралық заттардың қатты фазада синтезі, одан кейін ерітінді фазасындағы маңызды циклдену, ал қорғалған жақшы тізбектердің соңғы депротектілеуі де ерітінді фазасында жүзеге асырылады. Бұл әдіс қатты фаза синтезінің тиімділігін ерітінді фазасындағы кезеңдерде жоғалтуға, қосалқы өнімдерден, реагенттерден және өзге алмаған материалдан тазарту қажеттігіне, сондай-ақ макроцикл түзілуі кезінде қажетсіз олигомерлердің пайда болуына алып келеді. Пептидтерді циклдеу үшін пентафторфенил эфирлері (FDPP, PFPOH) және BOP Cl пайдалану тиімді.
Off resin cyclization is a solid phase synthesis of key intermediates, followed by the key cyclization in solution phase, the final deprotection of any masked side chains is also carried out in solution phase. This has the disadvantages that the efficiencies of solid phase synthesis are lost in the solution phase steps, that purification from by products, reagents and unconverted material is required, and that undesired oligomers can be formed if macrocycle formation is involved. The use of pentafluorophenyl esters (FDPP, PFPOH) and BOP Cl are useful for cyclising peptides.
Тарих
Алғашқы қорғалған пептид 1882 жылы Теодор Куртиус синтездеген, ал алғашқы бос пептид 1901 жылы Эмиль Фишер синтездеген.
The first protected peptide was synthesised by Theodor Curtius in 1882 and the first free peptide was synthesised by Emil Fischer in 1901.