Введение

Производство пептидов

В органической химии пептидный синтез – это получение пептидов, соединений, в которых несколько аминокислот связаны посредством амидных связей, также известных как пептидные связи. Пептиды химически синтезируются в результате реакции конденсации карбоксильной группы одной аминокислоты с аминогруппой другой. Обычно необходимы стратегии использования защитных групп для предотвращения нежелательных побочных реакций с различными радикалами аминокислот. Химический синтез пептидов чаще всего начинается с карбоксильного конца пептида (C-конца) и продвигается к аминоконцу (N-концу). Биосинтез белков (длинных пептидов) в живых организмах происходит в противоположном направлении. Химический синтез пептидов может осуществляться с использованием классических методов в растворе, хотя в большинстве научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ они были заменены методами на твердой фазе (см. ниже). Синтез в растворе, тем не менее, сохраняет свою полезность в крупномасштабном производстве пептидов для промышленных целей. Химический синтез облегчает получение пептидов, которые трудно экспрессировать в бактериях, встраивание неестественных аминокислот, модификацию пептидного/белкового скелета и синтез D-белков, состоящих из D-аминокислот.

Синтез твердой фазы

Установленный метод производства синтетических пептидов в лаборатории известен как пептидный синтез в твердой фазе (SPPS). SPPS позволяет быстро собирать пептидную цепь посредством последовательных реакций производных аминокислот на макроскопически нерастворимом, набухшем растворителе в виде бусинчатой смолы. Твердая опора состоит из небольших полимерных смоловых шариков, функционализированных реактивными группами (такими как амино- или гидроксильные группы), которые связываются с формирующейся пептидной цепью. Процесс очистки, особенно более длинных пептидов, может быть затруднительным, поскольку необходимо удалять кумулятивные количества многочисленных незначительных побочных продуктов, свойства которых схожи со свойствами целевого пептидного продукта. По этой причине так называемые процессы непрерывной хроматографии, такие как MCSGP, все чаще используются в коммерческих условиях для максимизации выхода, не снижая чистоту. SPPS ограничен выходами реакций из-за экспоненциального накопления побочных продуктов, и обычно синтез пептидов и белков длиной более 70 аминокислот достигает предела синтетической доступности. Синтез более длинных пептидов затруднен. Доступ к большей длине можно получить с помощью методов лигирования, таких как нативная химическая лигация, при которой два более коротких, полностью депротектированных синтетических пептида соединяются в растворе.

Реагенты для соединения пептидов

Важной особенностью, которая обеспечила широкое применение SPPS, является получение чрезвычайно высоких выходов на этапе образования пептидной связи. Также используется добавление избытка каждой аминокислоты (в 2–10 раз). Минимизация рацемизации аминокислот в процессе образования пептидной связи также крайне важна для предотвращения эпимеризации в конечном пептидном продукте. Образование амидной связи между амином и карбоновой кислотой протекает медленно и, следовательно, обычно требует использования "реагентов для образования пептидной связи" или "активаторов". Существует широкий спектр таких реагентов, что обусловлено, в частности, их различной эффективностью для конкретных реакций, и многие из них доступны в продаже.

Карбодимиды

Использование N-концевой Fmoc-защиты позволяет применять более мягкую схему депротекции, чем при Boc/Bzl SPPS, и эта схема защиты действительно ортогональна в условиях SPPS. Депротекция Fmoc осуществляется с помощью основания, обычно 20–50% пиперидина в DMF. Полученный сырой пептид получают в виде соли ТФА, которую потенциально сложнее растворять, чем фторидные соли, образующиеся при Boc SPPS. Fmoc/tBu SPPS менее экономичен с точки зрения атомов, поскольку флуоренильная группа значительно больше, чем группа Boc. Соответственно, цены на Fmoc-аминокислоты оставались высокими до начала крупномасштабного производства одного из первых синтезированных пептидных лекарственных средств, энфувиртида, в 1990-х годах, когда рыночный спрос скорректировал относительные цены Fmoc- и Boc-аминокислот.

Бензилоксикарбонил

Группа (Z) — это еще одна группа защиты аминов карбаматного типа, открытая Леонидасом Зервасом в начале 1930-х годов и обычно вводимая посредством реакции с бензилхлороформатом. Она удаляется в жестких условиях с использованием HBr в уксусной кислоте или в более мягких условиях каталитического гидрирования. Эта методология была впервые применена Зервасом и Максом Бергманном в 1932 году при синтезе олигопептидов. Впоследствии это стало известно как синтез Бергмана — Зерваса, который был назван "эпохальным" и способствовал становлению синтетической пептидной химии как самостоятельной области. Для специальных применений, например, на этапах синтеза с использованием белковых микромассивов, используются защитные группы, иногда называемые "литографическими", которые чувствительны к фотохимии при определенной длине волны света и, следовательно, могут быть удалены в ходе литографических операций.

Региоселективное образование дисульфидных связей

Формирование множественных нативных дисульфидных связей остаётся сложной задачей при синтезе нативных пептидов методами твердой фазы. Случайное объединение цепей обычно приводит к образованию нескольких продуктов с неродственными дисульфидными связями. Постепенное формирование дисульфидных связей, как правило, является предпочтительным методом и выполняется с использованием тиольных защитных групп. Различные тиольные защитные группы обеспечивают многомерную ортогональную защиту. Эти ортогонально защищённые цистеины включаются в ходе синтеза пептида в твердой фазе. Последовательное удаление этих групп для обеспечения селективного обнажения свободных тиольных групп приводит к образованию дисульфидных связей поэтапно. Порядок удаления групп необходимо учитывать таким образом, чтобы удалялась только одна группа за раз. Тиольные защитные группы, используемые в пептидном синтезе, требующем последующего формирования региоселективных дисульфидных связей, должны обладать рядом характеристик. Во-первых, они должны быть обратимы в условиях, не влияющих на незащищённые боковые цепи. Во-вторых, защитная группа должна выдерживать условия синтеза в твердой фазе. В-третьих, удаление тиольной защитной группы должно происходить таким образом, чтобы не затрагивать другие тиольные защитные группы, если требуется ортогональная защита. То есть, удаление ПГ А не должно влиять на ПГ В. К часто используемым тиольным защитным группам относятся ацетамидометил (Acm), трет-бутил (But), 3-нитро-2-пиридиносульфенил (NPYS), 2-пиридиносульфенил (Pyr) и тритил (Trt). Используя этот метод, Кисо и его коллеги сообщили о первом полном синтезе инсулина в 1993 году. В этой работе А-цепь инсулина была получена со следующими защитными группами на цистеинах: CysA6(But), CysA7(Acm) и CysA11(But), при этом CysA20 оставался незащищённым.

Синтез пептидов в твердой фазе с непрерывным потоком

Первая статья, посвященная непрерывному проточному синтезу пептидов, была опубликована в 1986 году, но из-за технических ограничений лишь в начале 2010-х годов большее количество академических групп начало использовать непрерывный проток для быстрого синтеза пептидов. Преимущество непрерывного проточного метода перед традиционными дискретными методами заключается в возможности нагрева реагентов с точным контролем температуры, что позволяет ускорить реакционную кинетику, минимизируя при этом побочные реакции. Время цикла варьируется от 30 секунд до 6 минут в зависимости от условий реакции и избытка реагента. Благодаря встроенной аналитике, такой как УФ/Вид-спектроскопия и использованию реактора с переменным объемом слоя (VBFR), который контролирует объем смолы, можно выявлять агрегацию смолы и оценивать эффективность сочетания.

Синтез длинных пептидов

Постепенное удлинение, при котором аминокислоты соединяются последовательно друг за другом, идеально подходит для небольших пептидов, содержащих от 2 до 100 аминокислотных остатков. Другой метод – конденсация фрагментов, при котором соединяются пептидные фрагменты. Хотя первый метод позволяет удлинять пептидную цепь без рацемизации, выход снижается при использовании только его для создания длинных или высокополярных пептидов. Конденсация фрагментов предпочтительнее постепенного удлинения для синтеза сложных длинных пептидов, но ее применение должно быть ограничено для предотвращения рацемизации. Конденсация фрагментов также нежелательна, поскольку используемый фрагмент должен быть в значительном избытке, что может быть ограничением в зависимости от длины фрагмента. Новым подходом к получению более длинных пептидных цепей является химическая лигация: незащищенные пептидные цепи химически селективно реагируют в водном растворе. Первичный кинетически контролируемый продукт перестраивается с образованием амидной связи. Наиболее распространенная форма нативной химической лигации использует пептидный тиоэстер, который реагирует с концевым остатком цистеина. Другие методы, применимые для ковалентного связывания полипептидов в водном растворе, включают использование разделенных интеинов, спонтанное образование изопептидной связи и лигацию сортазой. Для оптимизации синтеза длинных пептидов в Медикон-Вэлли был разработан метод модификации пептидных последовательностей. Простая пре-последовательность (например, лизин (Lysn); глутаминовая кислота (Glun); (LysGlu)n), которая включается в C-конец пептида для индуцирования структуры, подобной альфа-спирали. Это потенциально может увеличить биологический период полувыведения, повысить стабильность пептида и ингибировать ферментативную деградацию, не изменяя фармакологическую активность или профиль действия.

О циклизации смолы

Пептиды могут циклизоваться на твердой подложке. Для циклизации можно использовать различные реагенты, такие как HBTU/HOBt/DIEA, PyBop/DIEA, PyClock/DIEA. Пептиды с последовательностью от N-конца к C-концу могут быть синтезированы на твердой фазе. Депротекция C-конца в подходящей точке позволяет провести циклизацию непосредственно на смоле, формируя амидную связь с депротектированным N-концом. После циклизации пептид отщепляют от смолы кислотным гидролизом и очищают. Стратегия твердофазного синтеза циклических пептидов не ограничивается присоединением через боковые цепи Asp, Glu или Lys. Цистеин содержит очень реактивную сульфгидрильную группу в своей боковой цепи. Дисульфидная связь образуется, когда атом серы одного цистеина образует ковалентную связь с атомом серы другого цистеина, расположенного в другой части белка. Эти связи способствуют стабилизации белков, особенно секретируемых клетками. Некоторые исследователи используют модифицированные цистеины, блокируя образование дисульфидной связи с помощью S-ацетомидометильной (Acm) группы, при этом сохраняя цистеин и исходную первичную структуру белка.

Циклизация вне смолы

Циклизация вне смолы – это синтез ключевых промежуточных соединений в твердой фазе, за которым следует ключевая циклизация в растворе. Окончательное снятие защиты с любых защищенных боковых цепей также проводится в растворе. Это имеет недостатки, такие как потеря эффективности твердофазного синтеза на стадиях, проводимых в растворе, необходимость очистки от побочных продуктов, реагентов и непрореагировавшего исходного материала, а также возможность образования нежелательных олигомеров при формировании макроцикла. Для циклизации пептидов полезно использовать пентафторфениловые эфиры (FDPP, PFPOH) и BOP Cl.

История

Первый пептид, защищенный функциональной группой, был синтезирован Теодором Курциусом в 1882 году, а первый несвязанный пептид – Эмилем Фишером в 1901 году.