Гендердің кеңістіктік-уақыттық активтігі

Кіріспе

Гендерді белсендіру

Гендік экспрессияның кеңістіктік-уақыттық сипаттамасы – даму кезінде организмнің белгілі бір тіндеріндегі гендердің белгілі бір уақытта белсендірілуі. Гендерді белсендіру үлгілерінің күрделілігі әртүрлі. Кейбіреулері қарапайым және тұрақты, мысалы, тубулиннің экспрессиясы, ол өмір бойында барлық жасушаларда кездеседі. Ал кейбіреулерін болжау және модельдеу өте қиын, олардың экспрессиясы әр минут сайын немесе әр жасушада өзгереді. Кеңістіктік-уақыттық өзгерістер дамыған организмдердегі жасуша түрлерінің әртүрлілігін қалыптастыруда маңызды рөл атқарады; жасушаның ерекшелігі сол жасушада белсенді экспрессияланатын гендер жиынтығымен анықталатындықтан, егер гендік экспрессия кеңістікте және уақытта біркелкі болса, онда ең көп дегенде бір жасуша түрі болуы мүмкін. Wnt гендер отбасының мүшесі болып табылатын қанатсыз генді қарастырайық. Үлгілік организм (Drosophila melanogaster) немесе жеміс шыбынының ерте эмбриональды дамуында қанатсыз ген эмбрионның дененің көп бөлігінде үш жасуша арасында кезектесіп орналасқан жолақтар түрінде экспрессияланады. Ағза личинкаға айналған кезде бұл үлгі жоғалады, бірақ қанатсыз ген әлі де түрлі тіндерде экспрессияланады, мысалы, қанаттың бейнелі дискілерінде – ересектерде қанаттарға айналатын тіндерде. Қанатсыз ген экспрессиясының кеңістіктік-уақыттық үлгісі көптеген гендердің әсерінен тұратын реттеуші өзара әрекеттесулер желісімен анықталады, мысалы, even-skipped және Krüppel. Бір геннің экспрессиясындағы кеңістіктік және уақыттық айырмашылықтарға не себеп болады? Қазіргі экспрессия үлгілері бұрынғы экспрессия үлгілеріне тікелей байланысты болғандықтан, ген экспрессиясындағы алғашқы айырмашылықтардың себебін анықтауда қиындық туындайды. Біркелкі ген экспрессиясының кеңістікте және уақытта әртүрлі болу процесі симметрияны бұзу деп аталады. Мысалы, эмбрионалды Drosophila дамуында нанос және бикоид гендері ооцитте асимметриялық экспрессияланады, себебі аналық жасушалар осы гендерге арналған хабаршы РНК (мРНК) жұмыртқаның полюстеріне оны салудан бұрын орналастырады.

Spatiotemporal gene expression is the activation of genes within specific tissues of an organism at specific times during development. Gene activation patterns vary widely in complexity. Some are straightforward and static, such as the pattern of tubulin, which is expressed in all cells at all times in life. Some, on the other hand, are extraordinarily intricate and difficult to predict and model, with expression fluctuating wildly from minute to minute or from cell to cell. Spatiotemporal variation plays a key role in generating the diversity of cell types found in developed organisms; since the identity of a cell is specified by the collection of genes actively expressed within that cell, if gene expression was uniform spatially and temporally, there could be at most one kind of cell. Consider the gene wingless, a member of the wnt family of genes. In the early embryonic development of the model organism Drosophila melanogaster, or fruit fly, wingless is expressed across almost the entire embryo in alternating stripes three cells separated. This pattern is lost by the time the organism develops into a larva, but wingless is still expressed in a variety of tissues such as the wing imaginal discs, patches of tissue that will develop into the adult wings. The spatiotemporal pattern of wingless gene expression is determined by a network of regulatory interactions consisting of the effects of many different genes such as even skipped and Krüppel. What causes spatial and temporal differences in the expression of a single gene? Because current expression patterns depend strictly on previous expression patterns, there is a regressive problem of explaining what caused the first differences in gene expression. The process by which uniform gene expression becomes spatially and temporally differential is known as symmetry breaking. For example, in the case of embryonic Drosophila development, the genes nanos and bicoid are asymmetrically expressed in the oocyte because maternal cells deposit messenger RNA (mRNA) for these genes in the poles of the egg before it is laid.

Уақыт-кеңістік үлгілерді анықтау

Бір геннің экспрессиялық үлгісін анықтаудың бір жолы – оның промоторынан төмен репортер генін орналастыру. Бұл конфигурацияда промотор гені репортер генінің тек қызығушылық тудыратын геннің қай жерде және қай уақытта экспрессияланатындығын анықтайды. Репортер генінің экспрессиясы оны визуализациялау арқылы анықталуы мүмкін. Мысалы, репортер гені – жасыл флуоресцентті ақуызды көк жарықпен стимуляциялау арқылы және кейін цифрлық камераны жасыл флуоресцентті эмиссияны тіркеу үшін пайдалану арқылы визуализациялауға болады. Егер қызығушылық тудыратын геннің промоторы белгісіз болса, оның кеңістіктік-уақыттық таралуын анықтаудың бірнеше жолы бар. Иммуногистохимия зерттелетін генмен байланысты ақуызға ерекше туыстығы бар антидене дайындауды қамтиды. Бұл антидененің таралуын флуоресценттік таңбалау сияқты әдіспен көруге болады. Иммуногистохимия әдістемелік тұрғыдан орындалуы мүмкін және салыстырмалы түрде арзан болудың артықшылығы бар. Оның кемшіліктері антидененің спецификалық емес болуына байланысты экспрессияның жалған оң сәйкестендірілуіне алып келуі мүмкін. Антидененің мақсатты тіндерге нашар енуі жалған теріс нәтижелерге әкелуі мүмкін. Сонымен қатар, иммуногистохимия геннің өндірген ақуызын визуализациялайды, егер ақуыз өнімдері жасушалар арасында таралатын болса немесе ақуызды аудармаға қолданылатын мРНҚ-ға қатысты өте қысқа немесе ұзақ жартылай өмір сүру мерзімі болса, бұл қай жасушалар мРНҚ-ны экспрессиялайтынын бұрмалауға әкелуі мүмкін. In situ гибридизация – бұл геннің мРНҚ-сына толықтырылатын тізбегі бар синтетикалық нуклеин қышқылы – «зондты» тіндерге қосатын баламалы әдіс. Содан кейін зондты химиялық түрде таңбалап, оны кейінірек визуализациялауға болады. Бұл әдіс иммуногистохимиямен байланысты артефакттарсыз тек мРНҚ өндіретін жасушаларды визуализациялауға мүмкіндік береді. Алайда, бұл өте қиын, және қызығушылық тудыратын генге сәйкес келетін ДНК тізбегін білуді қажет етеді. Энхансер тұзақтарын скринингтеу деп аталатын әдіс организмде мүмкін болатын кеңістіктік-уақыттық гендік экспрессия үлгілерінің әртүрлілігін ашады. Бұл әдісте репортер генін кодтайтын ДНК геномға кездейсоқ түрде енгізіледі. Инсерциялық нүктеге жақын орналасқан ген промоторларына байланысты репортер гендері дамудың белгілі бір кезеңдеріндегі белгілі бір тіндерде экспрессияланады. Энхансер тұзақтарынан алынған экспрессиялық үлгілер міндетті түрде нақты гендердің нақты экспрессиялық үлгілерін көрсетпейді, бірақ олар эволюцияға қолжетімді кеңістіктік-уақыттық үлгілердің әртүрлілігін ашады. Репортер гендерін тірі организмдерде визуализациялауға болады, бірақ иммуногистохимия және in situ гибридизация тұрақты тіндерде орындалуы керек. Тіндерді бекітуді қажет ететін әдістер жеке организм үшін тек бір уақыттық нүктені ғана тудырады. Алайда, тірі жануарларды тұрақты тіндердің орнына пайдалану организмнің өмір бойында экспрессиялық үлгілерді динамикалық түсіну үшін маңызды болуы мүмкін. Қай жағдайда болмасын, жеке адамдар арасындағы айырмашылық уақыттық экспрессия үлгілерінің интерпретациясын шатастыруы мүмкін.

One way to identify the expression pattern of a particular gene is to place a reporter gene downstream of its promoter. In this configuration, the promoter gene will cause the reporter gene to be expressed only where and when the gene of interest is expressed. The expression distribution of the reporter gene can be determined by visualizing it. For example, the reporter gene green fluorescent protein can be visualized by stimulating it with blue light and then using a digital camera to record green fluorescent emission. If the promoter of the gene of interest is unknown, there are several ways to identify its spatiotemporal distribution. Immunohistochemistry involves preparing an antibody with specific affinity for the protein associated with the gene of interest. This distribution of this antibody can then be visualized by a technique such as fluorescent labeling. Immunohistochemistry has the advantages of being methodologically feasible and relatively inexpensive. Its disadvantages include non specificity of the antibody leading to false positive identification of expression. Poor penetrance of the antibody into the target tissue can lead to false negative results. Furthermore, since immunohistochemistry visualizes the protein generated by the gene, if the protein product diffuses between cells, or has a particularly short or long half life relative to the mRNA that is used to translate the protein, this can lead to distorted interpretation of which cells are expressing the mRNA. In situ hybridization is an alternate method in which a "probe," a synthetic nucleic acid with a sequence complementary to the mRNA of the gene, is added to the tissue. This probe is then chemically tagged so that it can be visualized later. This technique enables visualization specifically of mRNA producing cells without any of the artifacts associated with immunohistochemistry. However, it is notoriously difficult, and requires knowledge of the sequence of DNA corresponding to the gene of interest. A method called enhancer trap screening reveals the diversity of spatiotemporal gene expression patterns possible in an organism. In this technique, DNA that encodes a reporter gene is randomly inserted into the genome. Depending on the gene promoters proximal to the insertion point, the reporter gene will be expressed in particular tissues at particular points in development. While enhancer trap derived expression patterns do not necessarily reflect the actual patterns of expression of specific genes, they reveal the variety of spatiotemporal patterns that are accessible to evolution. Reporter genes can be visualized in living organisms, but both immunohistochemistry and in situ hybridization must be performed in fixed tissues. Techniques that require fixation of tissue can only generate a single temporal time point per individual organism. However, using live animals instead of fixed tissue can be crucial in dynamically understanding expression patterns over an individual's lifespan. Either way, variation between individuals can confound the interpretation of temporal expression patterns.

Уақытша-кеңістіктік ген экспрессиясын бақылау әдістері

Ген экспрессиясын кеңістікте, уақыт бойынша және әртүрлі деңгейде бақылау үшін бірнеше әдістер зерттелуде. Бір әдіс – ген экспрессиясын уақытша басқаруды қамтамасыз ететін оперондық индуктор/репрессор жүйесін қолдану. Ген экспрессиясын кеңістікте бақылау үшін гельді мәдениетке лигандтарды басып шығаруға арналған сиялы принтерлер жасалуда. Тағы бір танымал әдіс – ген экспрессиясын кеңістіктік-уақыттық түрде басқару үшін жарық қолдану. Жарықты кеңістікте, уақытта және деңгейде оңай басқаруға болатындықтан, ДНК және РНК деңгейінде ген экспрессиясын бақылаудың бірнеше әдістері әзірленді және зерттелуде. Мысалы, РНК-ның араласуын жарық арқылы басқаруға болады, сондай-ақ ген экспрессиясының үлгісі клеткалық моноқабаттарда және қамалған морфолино немесе пептидтік нуклеин қышқылы қолданылып, зебра балығының эмбриондарында жасалды, бұл ген экспрессиясының кеңістіктік-уақыттық бақылауын көрсетеді. Соңғы кезде трансгендік жүйе немесе қақпақпен жабылған триплекс құраушы олигонуклеотидтерді пайдалану арқылы ДНК деңгейінде жарыққа негізделген бақылау мүмкіндігі көрсетілді.