Пространственно-временная активация генов

Введение

Активация генов

Пространственно-временная экспрессия генов – это активация генов в определенных тканях организма в конкретные моменты времени в процессе развития. Паттерны активации генов сильно различаются по сложности. Некоторые из них просты и статичны, например, экспрессия тубулина, который присутствует во всех клетках на протяжении всей жизни. Другие же, напротив, чрезвычайно сложны и их трудно предсказать и смоделировать, при этом экспрессия может резко меняться от минуты к минуте или от клетки к клетке. Пространственно-временные вариации играют ключевую роль в формировании разнообразия типов клеток в развитых организмах; поскольку идентичность клетки определяется набором активно экспрессируемых в ней генов, если бы экспрессия генов была однородной в пространстве и времени, существовало бы максимум один тип клеток. Рассмотрим ген wingless, входящий в семейство генов wnt. В раннем эмбриональном развитии модельного организма Drosophila melanogaster, или плодовой мушки, wingless экспрессируется почти во всем эмбрионе в виде чередующихся полос, разделенных тремя клетками. Этот паттерн исчезает к тому времени, когда организм превращается в личинку, но wingless по-прежнему экспрессируется в различных тканях, таких как диски имагинальных крыльев – участки ткани, из которых разовьются взрослые крылья. Пространственно-временной паттерн экспрессии гена wingless определяется сетью регуляторных взаимодействий, включающей влияние множества различных генов, таких как even-skipped и Krüppel. Что вызывает пространственные и временные различия в экспрессии одного гена? Поскольку текущие паттерны экспрессии строго зависят от предыдущих, возникает регрессивная проблема объяснения того, что вызвало первые различия в экспрессии генов. Процесс, в результате которого однородная экспрессия генов становится пространственно и временно дифференцированной, известен как нарушение симметрии. Например, в случае эмбрионального развития дрозофилы гены nanos и bicoid асимметрично экспрессируются в ооците, поскольку материнские клетки откладывают матричную РНК (мРНК) для этих генов в полюсах яйца до его откладывания.

Spatiotemporal gene expression is the activation of genes within specific tissues of an organism at specific times during development. Gene activation patterns vary widely in complexity. Some are straightforward and static, such as the pattern of tubulin, which is expressed in all cells at all times in life. Some, on the other hand, are extraordinarily intricate and difficult to predict and model, with expression fluctuating wildly from minute to minute or from cell to cell. Spatiotemporal variation plays a key role in generating the diversity of cell types found in developed organisms; since the identity of a cell is specified by the collection of genes actively expressed within that cell, if gene expression was uniform spatially and temporally, there could be at most one kind of cell. Consider the gene wingless, a member of the wnt family of genes. In the early embryonic development of the model organism Drosophila melanogaster, or fruit fly, wingless is expressed across almost the entire embryo in alternating stripes three cells separated. This pattern is lost by the time the organism develops into a larva, but wingless is still expressed in a variety of tissues such as the wing imaginal discs, patches of tissue that will develop into the adult wings. The spatiotemporal pattern of wingless gene expression is determined by a network of regulatory interactions consisting of the effects of many different genes such as even skipped and Krüppel. What causes spatial and temporal differences in the expression of a single gene? Because current expression patterns depend strictly on previous expression patterns, there is a regressive problem of explaining what caused the first differences in gene expression. The process by which uniform gene expression becomes spatially and temporally differential is known as symmetry breaking. For example, in the case of embryonic Drosophila development, the genes nanos and bicoid are asymmetrically expressed in the oocyte because maternal cells deposit messenger RNA (mRNA) for these genes in the poles of the egg before it is laid.

Определение пространственно-временных моделей

Один из способов определить паттерн экспрессии конкретного гена — поместить репортерный ген ниже по течению от его промотора. В этой конфигурации промоторный ген будет вызывать экспрессию репортерного гена только там и тогда, когда экспрессируется интересующий ген. Распределение экспрессии репортерного гена можно определить, визуализируя его. Например, репортерный ген – зеленый флуоресцентный белок – можно визуализировать, стимулируя его синим светом и затем используя цифровую камеру для регистрации зеленого флуоресцентного излучения. Если промотор интересующего гена неизвестен, существует несколько способов определить его пространственно-временное распределение. Иммуногистохимия включает в себя получение антитела со специфическим аффинностью к белку, связанному с интересующим геном. Распределение этого антитела можно затем визуализировать с помощью такой техники, как флуоресцентная маркировка. Иммуногистохимия имеет преимущества в методологической осуществимости и относительной дешевизне. Ее недостатки включают неспецифичность антитела, приводящую к ложноположительной идентификации экспрессии. Плохое проникновение антитела в целевую ткань может привести к ложноотрицательным результатам. Кроме того, поскольку иммуногистохимия визуализирует белок, производимый геном, если белковый продукт диффундирует между клетками или имеет особенно короткий или длительный период полураспада по сравнению с мРНК, используемой для трансляции белка, это может привести к искаженной интерпретации того, какие клетки экспрессируют мРНК. In situ гибридизация — альтернативный метод, при котором в ткань добавляется «зонд», синтетическая нуклеиновая кислота с последовательностью, комплементарной мРНК гена. Затем этот зонд химически маркируется для последующей визуализации. Эта техника позволяет визуализировать конкретно клетки, продуцирующие мРНК, без артефактов, связанных с иммуногистохимией. Однако она печально известна своей сложностью и требует знания последовательности ДНК, соответствующей интересующему гену. Метод, называемый скринингом энхансерной ловушки, выявляет разнообразие пространственно-временных паттернов экспрессии генов, возможных в организме. В этой технике ДНК, кодирующая репортерный ген, случайно вставляется в геном. В зависимости от генов-энхансеров, расположенных вблизи точки вставки, репортерный ген будет экспрессироваться в определенных тканях на определенных этапах развития. Хотя паттерны экспрессии, полученные с помощью энхансерной ловушки, не обязательно отражают фактические паттерны экспрессии конкретных генов, они демонстрируют разнообразие пространственно-временных паттернов, доступных для эволюции. Репортерные гены можно визуализировать в живых организмах, но иммуногистохимия и in situ гибридизация должны выполняться в фиксированных тканях. Методы, требующие фиксации ткани, могут генерировать только одну временную точку на отдельный организм. Однако использование живых животных вместо фиксированной ткани может быть решающим для динамического понимания паттернов экспрессии в течение жизни организма. В любом случае, вариации между особями могут затруднить интерпретацию временных паттернов экспрессии.

One way to identify the expression pattern of a particular gene is to place a reporter gene downstream of its promoter. In this configuration, the promoter gene will cause the reporter gene to be expressed only where and when the gene of interest is expressed. The expression distribution of the reporter gene can be determined by visualizing it. For example, the reporter gene green fluorescent protein can be visualized by stimulating it with blue light and then using a digital camera to record green fluorescent emission. If the promoter of the gene of interest is unknown, there are several ways to identify its spatiotemporal distribution. Immunohistochemistry involves preparing an antibody with specific affinity for the protein associated with the gene of interest. This distribution of this antibody can then be visualized by a technique such as fluorescent labeling. Immunohistochemistry has the advantages of being methodologically feasible and relatively inexpensive. Its disadvantages include non specificity of the antibody leading to false positive identification of expression. Poor penetrance of the antibody into the target tissue can lead to false negative results. Furthermore, since immunohistochemistry visualizes the protein generated by the gene, if the protein product diffuses between cells, or has a particularly short or long half life relative to the mRNA that is used to translate the protein, this can lead to distorted interpretation of which cells are expressing the mRNA. In situ hybridization is an alternate method in which a "probe," a synthetic nucleic acid with a sequence complementary to the mRNA of the gene, is added to the tissue. This probe is then chemically tagged so that it can be visualized later. This technique enables visualization specifically of mRNA producing cells without any of the artifacts associated with immunohistochemistry. However, it is notoriously difficult, and requires knowledge of the sequence of DNA corresponding to the gene of interest. A method called enhancer trap screening reveals the diversity of spatiotemporal gene expression patterns possible in an organism. In this technique, DNA that encodes a reporter gene is randomly inserted into the genome. Depending on the gene promoters proximal to the insertion point, the reporter gene will be expressed in particular tissues at particular points in development. While enhancer trap derived expression patterns do not necessarily reflect the actual patterns of expression of specific genes, they reveal the variety of spatiotemporal patterns that are accessible to evolution. Reporter genes can be visualized in living organisms, but both immunohistochemistry and in situ hybridization must be performed in fixed tissues. Techniques that require fixation of tissue can only generate a single temporal time point per individual organism. However, using live animals instead of fixed tissue can be crucial in dynamically understanding expression patterns over an individual's lifespan. Either way, variation between individuals can confound the interpretation of temporal expression patterns.

Методы контроля пространственно-временной экспрессии генов

Для контроля экспрессии генов в пространстве, времени и в различной степени разрабатывается несколько методов. Один из них – использование системы индукторов/репрессоров оперона, обеспечивающей временной контроль экспрессии генов. Для пространственного контроля экспрессии генов разрабатываются струйные принтеры для нанесения лигандов на гелевые культуры. Другой распространенный метод предполагает использование света для контроля экспрессии генов в пространственно-временном режиме. Поскольку свет легко контролируется в пространстве, времени и степени воздействия, разработаны и изучаются различные методы контроля экспрессии генов на уровне ДНК и РНК. Например, интерференцию РНК можно контролировать с помощью света, а также было продемонстрировано создание паттернов экспрессии генов в клеточных монослоях и эмбрионах зебрафиш с использованием морфолинов в клетке или пептидных нуклеиновых кислот, что демонстрирует пространственно-временной контроль экспрессии генов. Недавно был показан контроль экспрессии на основе света на уровне ДНК с использованием трансгенных систем или олигонуклеотидов, формирующих трехцепочечные структуры.