Ақуызды сәйкестендіруге арналған пептидтік массалық ізтаңбалау техникасы
Peptide mass fingerprinting
Протеин идентификациясы: Пептид масса жиілігі (PMF) әдісімен белоктарды анықтау, масса-спектрометрия, база деректерімен салыстыру. Зерттеулер 1993 ж. басталды.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Белоктарды анықтаудың аналитикалық әдісі
Analytical technique for protein identification
Пептидтік массалық саусақ ізін (PMF), сондай-ақ белок саусақ ізін деп те атайды, бұл белоктарды анықтаудың аналитикалық әдісі, онда қызығушылық тудыратын белгісіз белок алдымен кіші пептидтерге бөлінеді, олардың абсолютті массалары MALDI TOF немесе ESI TOF сияқты массалық спектрометрмен дәл өлшенеді. Бұл әдіс 1993 жылы бірнеше топтар тәуелсіз түрде әзірледі. Пептидтердің массалары белгілі белок тізбектерін немесе тіпті геномды қамтитын деректер базасымен салыстырылады. Бұл компьютерлік бағдарламаларды пайдалану арқылы жүзеге асырылады, олар организмнің белгілі геномын белоктарға аударады, содан кейін белоктарды теориялық түрде пептидтерге бөліп, әр белоктан пептидтердің абсолютті массасын есептейді. Содан кейін белгісіз белоктың пептидтерінің массасы геномда кодталған әр белоктың теориялық пептидтік массасымен салыстырылады. Нәтижелер статистикалық түрде ең жақсы сәйкестікті табу үшін талданады. Бұл әдістің артықшылығы тек пептидтердің массасын білу қажеттігінде. Бір кемшілігі – белок тізбегі қызығушылық тудыратын деректер базасында болуы керек. Сонымен қатар, көптеген PMF алгоритмдері пептидтер бір белоктан алынған деп есептейді. Қоспаның болуы талдауды айтарлықтай қиындатып, нәтижелерге зиян келтіруі мүмкін. PMF негізіндегі белоктарды анықтау үшін ерекше талап – белоктың оқшауланған болуы. 2-3 белоктан аспайтын қоспалар жеткілікті нақтылыққа қол жеткізу үшін MS/MS негізіндегі белокты анықтаудың қосымша қолданылуын қажет етеді. Сондықтан, PMF сынамалары екі өлшемді гель электрофорезінен (2D гельдер) немесе оқшауланған SDS PAGE жолақтарынан алынған оқшауланған белоктар болып табылады. Қосымша талдаулар MS/MS арқылы тікелей, мысалы, MALDI TOF/TOF талдау немесе гельден алынған элюаттардың nanoLC ESI MS/MS талдауы арқылы жүргізілуі мүмкін.
Peptide mass fingerprinting (PMF), also known as protein fingerprinting, is an analytical technique for protein identification in which the unknown protein of interest is first cleaved into smaller peptides, whose absolute masses can be accurately measured with a mass spectrometer such as MALDI TOF or ESI TOF. The method was developed in 1993 by several groups independently. The peptide masses are compared to either a database containing known protein sequences or even the genome. This is achieved by using computer programs that translate the known genome of the organism into proteins, then theoretically cut the proteins into peptides, and calculate the absolute masses of the peptides from each protein. They then compare the masses of the peptides of the unknown protein to the theoretical peptide masses of each protein encoded in the genome. The results are statistically analyzed to find the best match. The advantage of this method is that only the masses of the peptides have to be known. A disadvantage is that the protein sequence has to be present in the database of interest. Additionally most PMF algorithms assume that the peptides come from a single protein. The presence of a mixture can significantly complicate the analysis and potentially compromise the results. Typical for the PMF based protein identification is the requirement for an isolated protein. Mixtures exceeding a number of 2–3 proteins typically require the additional use of MS/MS based protein identification to achieve sufficient specificity of identification. Therefore, typical PMF samples are isolated proteins from two dimensional gel electrophoresis (2D gels) or isolated SDS PAGE bands. Additional analyses by MS/MS can either be direct, e. g., MALDI TOF/TOF analysis or downstream nanoLC ESI MS/MS analysis of gel spot eluates.
Шығу тегі
Ақуызды талдаудың ұзақ және көбінесе қиын процесіне байланысты пептидтік массалық «саусақ із» әдісі әзірленді. Эдман ыдырауы ақуыз талдауында қолданылды, бірақ бір аминқышқыл қалдығын талдауға шамамен бір сағат уақыт кетті. Өте күрделі қоспалардағы ақуызды бөлу үшін SDS PAGE де қолданылды, осымен бірге электроблоттинг және бояу әдістері де пайдаланылды. Содан кейін, жолақтар гельден алынып, автоматты түрде тізбектелетін болды. Процесте жиі кездесетін мәселе – қызығушылық тудыратын ақуызбен бірге басқа да ақуыздар тазарылып қалуы еді. Осы араласатын ақуыздардың тізбектері Дейхофф дерекқоры ретінде жинақталды. Нәтижесінде, белгілі ақуыздық қоспалардың тізбектерін дерекқорда сақтау ақуыз талдауына жұмсалатын уақытты және шығындарды азайтты.
Due to the long, tedious process of analyzing proteins, peptide mass fingerprinting was developed. Edman degradation was used in protein analysis, and it required almost an hour to analyze one amino acid residue. SDS PAGE was also used to separate proteins in very complex mixtures, which also employed methods of electroblotting and staining. Then, bands would be extracted from the gel and sequenced, automatically. A recurring problem in the process was that interfering proteins would also purify with the protein of interest. The sequences of these interfering proteins were compiled into what came to known as the Dayhoff database. Ultimately, having the sequences of these known protein contaminants in databases decreased instrument time and expenses involved in protein analysis.
Есептеулік талдау
Массалық спектрометриялық талдау молекулалық салмақтар тізімін шығарады, бұл тізім көбінесе шыңдар тізімі деп аталады. Пептидтердің массалары Swissprot сияқты ақуыздық деректер базасымен салыстырылады, ол ақуыз тізбектері туралы ақпаратты қамтиды. Бағдарламалық құрал деректер базасындағы ақуыздарды, химиялық ыдырау реакциясында қолданылған ферментпен (мысалы, трипсинмен) бірдей ферментті пайдаланып, компьютерлік ортада "қабылдау" (in silico) жүргізеді. Осы пептидтердің массасы есептеледі және өлшенген массалардың тізімімен салыстырылады. Нәтижелер статистикалық түрде талданып, ықтимал сәйкестіктер нәтижелер кестесінде ұсынылады.
The mass spectrometric analysis produces a list of molecular weights which is often called a peak list. The peptide masses are compared to protein databases such as Swissprot, which contain protein sequence information. Software performs in silico digests on proteins in the database with the same enzyme (e. g. trypsin) used in the chemical cleavage reaction. The mass of these peptides is then calculated and compared to the peak list of measured masses. The results are statistically analyzed and possible matches are returned in a results table.