Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Аналитический метод идентификации белков
Analytical technique for protein identification
Пептидный масс-отпечаток (PMF), также известный как белковый отпечаток, – это аналитический метод идентификации белков, при котором интересующий неизвестный белок сначала расщепляется на более мелкие пептиды, абсолютные массы которых могут быть точно измерены с помощью масс-спектрометра, такого как MALDI TOF или ESI TOF. Метод был разработан в 1993 году несколькими группами независимо. Массы пептидов сравниваются либо с базой данных, содержащей известные последовательности белков, либо даже с геномом. Это достигается с помощью компьютерных программ, которые транслируют известный геном организма в белки, затем теоретически разрезают белки на пептиды и рассчитывают абсолютные массы пептидов для каждого белка. Далее массы пептидов неизвестного белка сравниваются с теоретическими массами пептидов каждого белка, закодированного в геноме. Результаты статистически анализируются для поиска наилучшего соответствия. Преимущество этого метода заключается в том, что необходимо знать только массы пептидов. Недостатком является то, что последовательность белка должна быть представлена в интересующей базе данных. Кроме того, большинство алгоритмов PMF предполагают, что пептиды происходят из одного белка. Наличие смеси может значительно усложнить анализ и потенциально скомпрометировать результаты. Для идентификации белка на основе PMF обычно требуется изолированный белок. Смеси, содержащие более 2–3 белков, как правило, требуют дополнительного использования идентификации белков на основе MS/MS для достижения достаточной специфичности идентификации. Поэтому типичными образцами для PMF являются изолированные белки, полученные с помощью двухмерного гелевого электрофореза (2D-гелей) или изолированные полосы SDS-PAGE. Дополнительный анализ с помощью MS/MS может быть прямым, например, MALDI TOF/TOF анализ, или последующим нано-LC ESI MS/MS анализом элюатов гелевых пятен.
Peptide mass fingerprinting (PMF), also known as protein fingerprinting, is an analytical technique for protein identification in which the unknown protein of interest is first cleaved into smaller peptides, whose absolute masses can be accurately measured with a mass spectrometer such as MALDI TOF or ESI TOF. The method was developed in 1993 by several groups independently. The peptide masses are compared to either a database containing known protein sequences or even the genome. This is achieved by using computer programs that translate the known genome of the organism into proteins, then theoretically cut the proteins into peptides, and calculate the absolute masses of the peptides from each protein. They then compare the masses of the peptides of the unknown protein to the theoretical peptide masses of each protein encoded in the genome. The results are statistically analyzed to find the best match. The advantage of this method is that only the masses of the peptides have to be known. A disadvantage is that the protein sequence has to be present in the database of interest. Additionally most PMF algorithms assume that the peptides come from a single protein. The presence of a mixture can significantly complicate the analysis and potentially compromise the results. Typical for the PMF based protein identification is the requirement for an isolated protein. Mixtures exceeding a number of 2–3 proteins typically require the additional use of MS/MS based protein identification to achieve sufficient specificity of identification. Therefore, typical PMF samples are isolated proteins from two dimensional gel electrophoresis (2D gels) or isolated SDS PAGE bands. Additional analyses by MS/MS can either be direct, e. g., MALDI TOF/TOF analysis or downstream nanoLC ESI MS/MS analysis of gel spot eluates.
Происхождение
Из-за длительного и трудоемкого процесса анализа белков был разработан метод пептидного масс-спектрометрического анализа (или пептидного массового отпечатка). Для анализа белков использовалась деградация Эдмана, требующая почти часа на анализ одного аминокислотного остатка. SDS-PAGE также применялся для разделения белков в очень сложных смесях, с использованием методов электрофоретического переноса и окрашивания. Затем полосы извлекались из геля и автоматически секвенировались. Постоянной проблемой было то, что вместе с целевым белком очищались и мешающие белки. Последовательности этих мешающих белков были собраны в базу данных, получившую название база данных Дейхоффа. В конечном итоге, наличие последовательностей этих известных белковых примесей в базах данных позволило сократить время работы приборов и затраты на анализ белков.
Due to the long, tedious process of analyzing proteins, peptide mass fingerprinting was developed. Edman degradation was used in protein analysis, and it required almost an hour to analyze one amino acid residue. SDS PAGE was also used to separate proteins in very complex mixtures, which also employed methods of electroblotting and staining. Then, bands would be extracted from the gel and sequenced, automatically. A recurring problem in the process was that interfering proteins would also purify with the protein of interest. The sequences of these interfering proteins were compiled into what came to known as the Dayhoff database. Ultimately, having the sequences of these known protein contaminants in databases decreased instrument time and expenses involved in protein analysis.
Вычислительный анализ
Масс-спектрометрический анализ выдает список молекулярных весов, который часто называют списком пиков. Массы пептидов сравниваются с базами данных белков, такими как Swissprot, содержащими информацию о последовательности аминокислот в белках. Программное обеспечение выполняет виртуальное (in silico) расщепление белков в базе данных тем же ферментом (например, трипсином), который использовался в химической реакции расщепления. Затем рассчитывается масса полученных пептидов и сравнивается со списком измеренных масс. Результаты статистически анализируются, и возможные соответствия отображаются в таблице результатов.
The mass spectrometric analysis produces a list of molecular weights which is often called a peak list. The peptide masses are compared to protein databases such as Swissprot, which contain protein sequence information. Software performs in silico digests on proteins in the database with the same enzyme (e. g. trypsin) used in the chemical cleavage reaction. The mass of these peptides is then calculated and compared to the peak list of measured masses. The results are statistically analyzed and possible matches are returned in a results table.