FLAG белгісі: құрылымы, қолданылуы және зерттеудегі маңызы
FLAG-tag
FLAG тегі – бұл рекомбинантты ДНК технологиясымен протеинге қосылатын, тазалауға және жасуша ішінде анықтауға мүмкіндік беретін DYKDDDDK пептидтік тег. 🔬🧬
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Кіріспе
FLAG тегі, немесе FLAG октапептиді, немесе FLAG эпитопы – рекомбинантты ДНҚ технологиясын қолдану арқылы белокқа қосылатын, DYKDDDDK (мұнда D=аспартат қышқылы, Y=тирозин және K=лизин) тізбегі бар пептидтік белок тегі. Бұл ең ерекше тегтердің бірі және бұл – жасанды антиген, оған арналған ерекше, жоғары туыстыққа ие моноклоналды антиденелер жасалған, сондықтан оны аффиниттік хроматография арқылы белокты тазарту үшін, сондай-ақ тірі жасушалардағы белоктарды анықтау үшін пайдалануға болады. FLAG тегі рекомбинантты, жоғары экспрессияланған белокты мезгілдік организмнің өндірген жабайы типтегі белогынан бөлу үшін қолданылған. FLAG тегін көп бөлігі бар белок кешендерін оқшаулау үшін де пайдалануға болады, себебі FLAG тегінің жеңіл тазарту процедурасы мұндай кешендерді бұзбауға бейім. FLAG тегіне негіделген тазарту, рентгендік кристаллография арқылы 3D құрылымын анықтау үшін жеткілікті тазалықтағы және сапалы белоктар алу үшін қолданылған. FLAG тегін антиденемен тануды қажет ететін көптеген әртүрлі талдауларда қолдануға болады. Егер белгілі бір белокқа қарсы антидене болмаса, белокқа FLAG тегін қосу, FLAG тегінің тізбегіне қарсы антиденемен белокты зерттеуге мүмкіндік береді. Мысал ретінде иммунофлуоресценция, иммунопреципитация немесе SDS-PAGE белок электрофорезі және Вестерн блоттинг әдістерімен анықталатын жасушалық локализация зерттеулерін келтіруге болады. FLAG тегінің N ұшынан C ұшына дейінгі пептидтік тізбегі: DYKDDDDK (1012 Да). Сонымен қатар, FLAG тегтерін қатар қолдануға болады, әдетте 3xFLAG пептиді: DYKDHDG DYKDHDI DYKDDDDK (соңғы тег энтерокиназаның кесілу орнын кодтайды). FLAG тегін белоктың C немесе N ұшына қосуға немесе белоктың ішіне енгізуге болады. Саудада қол жетімді кейбір антиденелер (мысалы, M1/4E11) эпитопты тек N ұшында FLAG тегі болған кезде ғана таниды. Дегенмен, басқа қол жетімді антиденелер (мысалы, M2) орналасуына сезімтал емес. FLAG тегіндегі тирозин қалдығы белгілі бір секрецияланатын белоктарға экспрессияланғанда сульфатталануы мүмкін, бұл FLAG эпитопының антиденелермен тануына әсер етуі мүмкін. FLAG тегін басқа аффиниттік тегтермен, мысалы полигистидин тегі (His тегі), HA тегі немесе myc тегімен бірге қолдануға болады.
FLAG tag, or FLAG octapeptide, or FLAG epitope, is a peptide protein tag that can be added to a protein using recombinant DNA technology, having the sequence DYKDDDDK (where D=aspartic acid, Y=tyrosine, and K=lysine). It is one of the most specific tags and it is an artificial antigen to which specific, high affinity monoclonal antibodies have been developed and hence can be used for protein purification by affinity chromatography and also can be used for locating proteins within living cells. FLAG tag has been used to separate recombinant, overexpressed protein from wild type protein expressed by the host organism. FLAG tag can also be used in the isolation of protein complexes with multiple subunits, because FLAG tag's mild purification procedure tends not to disrupt such complexes. FLAG tag based purification has been used to obtain proteins of sufficient purity and quality to carry out 3D structure determination by x ray crystallography. A FLAG tag can be used in many different assays that require recognition by an antibody. If there is no antibody against a given protein, adding a FLAG tag to a protein allows the protein to be studied with an antibody against the FLAG tag sequence. Examples are cellular localization studies by immunofluorescence, immunoprecipitation or detection by SDS PAGE protein electrophoresis and Western blotting. The peptide sequence of the FLAG tag from the N terminus to the C terminus is: DYKDDDDK (1012 Da). Additionally, FLAG tags may be used in tandem, commonly the 3xFLAG peptide: DYKDHD G DYKDHD I DYKDDDDK (with the final tag encoding an enterokinase cleavage site). FLAG tag can be fused to the C terminus or the N terminus of a protein, or inserted within a protein. Some commercially available antibodies (e. g., M1/4E11) recognize the epitope only when FLAG tag is present at the N terminus. However, other available antibodies (e. g., M2) are position insensitive. The tyrosine residue in the FLAG tag can be sulfated when expressed on certain secreted proteins, which can affect antibody recognition of the FLAG epitope. The FLAG tag can be used in conjunction with other affinity tags, for example a polyhistidine tag (His tag), HA tag or myc tag.
Тарих
1984 жылы Мунро мен Пелхам алғаш рет эпитоптық таңбалауды сипаттады. FLAG белгісі ғылыми әдебиетте жарияланған толыққанды, жетілдірілген эпитоптық белгінің екінші мысалы болды және патенттелген жалғыз эпитоптық белгі еді. Одан бері ол әлемдегі зертханаларда ең көп қолданылатын белок белгілерінің біріне айналды. Кейбір басқа белгілерден (мысалы, myc, HA) айырмашылығы, онда моноклоналды антидене алдымен қолданыстағы ақуызға қарсы бөлініп алынып, содан кейін эпитоп сипатталып, белгі ретінде қолданылса, FLAG эпитопы – моноклоналды антиденелерге қарсы жасалған идеалданған, жасанды дизайн болды. FLAG белгісінің тізбегі, ол бекітілген белоктармен үйлесімді болу үшін жақсартылды, себебі FLAG белгісі басқа кең таралған эпитоптық белгілерге қарағанда көбірек су сүйгіш, сондықтан FLAG белгісі қосылған белоктардың активтілігін төмендету мүмкіндігі азырақ. Бұған қоса, N-терминалды FLAG белгілерін, олар бөлініп алынғаннан кейін, энтерокиназа (энтеропептидаза) сияқты арнайы протеазамен өңдеу арқылы белоктардан оңай алып тастауға болады. Эпитоптық таңбалау туралы үшінші хабарлама (HA белгісі) Flag жүйесі алғаш рет жіберілгеннен шамамен бір жыл өткен соң жарияланды.
The first use of epitope tagging was described by Munro and Pelham in 1984. The FLAG tag was the second example of a fully functional, improved epitope tag, published in the scientific literature. and was the only epitope tag to be patented. It has since become one of the most commonly used protein tags in laboratories worldwide. Unlike some other tags (e. g. myc, HA), where a monoclonal antibody was first isolated against an existing protein, then the epitope was characterized and used as a tag, the FLAG epitope was an idealized, artificial design, to which monoclonal antibodies were raised. The FLAG tag's sequence was optimized for compatibility with proteins it is attached to, in that FLAG tag is more hydrophilic than other common epitope tags and therefore less likely to reduce the activity of proteins to which FLAG tag is appended. In addition, N terminal FLAG tags can be removed readily from proteins once they have been isolated, by treatment with the specific protease, enterokinase (enteropeptidase). The third report of epitope tagging, (HA tag), appeared about one year after the Flag system had been first shipped.