Флаг-тег: применение и свойства в биохимии и молекулярной биологии.
FLAG-tag
FLAG-тег: описание, применение в биохимии и молекулярной биологии. Очистка белков, выделение комплексов, определение структуры рекомбинантных протеинов.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Введение
FLAG-тег, или FLAG-октапептид, или FLAG-эпитоп, – это пептидный белковый тег, который может быть присоединен к белку с использованием технологии рекомбинантной ДНК и имеет последовательность DYKDDDDK (где D = аспарагиновая кислота, Y = тирозин и K = лизин). Это один из наиболее специфичных тегов, представляющий собой искусственный антиген, к которому разработаны специфические моноклональные антитела с высокой аффинностью. Благодаря этому он может использоваться для очистки белков методом аффинной хроматографии, а также для определения локализации белков в живых клетках. FLAG-тег применялся для разделения рекомбинантного, сверхэкспрессированного белка от белка дикого типа, экспрессируемого клеткой-хозяином. Он также может использоваться для изоляции белковых комплексов, состоящих из нескольких субъединиц, поскольку мягкие условия очистки с использованием FLAG-тега обычно не нарушают структуру таких комплексов. Очистка на основе FLAG-тега позволяет получать белки достаточной чистоты и качества для определения их трехмерной структуры методом рентгеновской кристаллографии. FLAG-тег может быть использован во множестве различных анализов, требующих распознавания антителом. Если для данного белка нет антитела, добавление FLAG-тега позволяет изучать его с помощью антитела, специфичного к последовательности FLAG-тега. Примеры включают исследования клеточной локализации с помощью иммунофлуоресценции, иммунопреципитацию, а также детекцию белковым электрофорезом в SDS-PAGE и вестерн-блоттингом. Пептидная последовательность FLAG-тега от N-конца к C-концу: DYKDDDDK (1012 Да). Кроме того, FLAG-теги могут использоваться тандемно, чаще всего в виде 3xFLAG пептида: DYKDHDG DYKDHDI DYKDDDDK (при этом последний тег кодирует сайт расщепления энтерокиназы). FLAG-тег может быть присоединен к C- или N-концу белка или вставлен внутрь белковой последовательности. Некоторые коммерчески доступные антитела (например, M1/4E11) распознают эпитоп только при наличии FLAG-тега на N-конце. Однако другие доступные антитела (например, M2) не зависят от положения тега. Остаток тирозина в FLAG-теге может быть сульфатирован при экспрессии в определенных секретируемых белках, что может повлиять на распознавание антителом эпитопа FLAG. FLAG-тег может использоваться в сочетании с другими аффинными тегами, например, с полигистидиновым тегом (His-тег), HA-тегом или myc-тегом.
FLAG tag, or FLAG octapeptide, or FLAG epitope, is a peptide protein tag that can be added to a protein using recombinant DNA technology, having the sequence DYKDDDDK (where D=aspartic acid, Y=tyrosine, and K=lysine). It is one of the most specific tags and it is an artificial antigen to which specific, high affinity monoclonal antibodies have been developed and hence can be used for protein purification by affinity chromatography and also can be used for locating proteins within living cells. FLAG tag has been used to separate recombinant, overexpressed protein from wild type protein expressed by the host organism. FLAG tag can also be used in the isolation of protein complexes with multiple subunits, because FLAG tag's mild purification procedure tends not to disrupt such complexes. FLAG tag based purification has been used to obtain proteins of sufficient purity and quality to carry out 3D structure determination by x ray crystallography. A FLAG tag can be used in many different assays that require recognition by an antibody. If there is no antibody against a given protein, adding a FLAG tag to a protein allows the protein to be studied with an antibody against the FLAG tag sequence. Examples are cellular localization studies by immunofluorescence, immunoprecipitation or detection by SDS PAGE protein electrophoresis and Western blotting. The peptide sequence of the FLAG tag from the N terminus to the C terminus is: DYKDDDDK (1012 Da). Additionally, FLAG tags may be used in tandem, commonly the 3xFLAG peptide: DYKDHD G DYKDHD I DYKDDDDK (with the final tag encoding an enterokinase cleavage site). FLAG tag can be fused to the C terminus or the N terminus of a protein, or inserted within a protein. Some commercially available antibodies (e. g., M1/4E11) recognize the epitope only when FLAG tag is present at the N terminus. However, other available antibodies (e. g., M2) are position insensitive. The tyrosine residue in the FLAG tag can be sulfated when expressed on certain secreted proteins, which can affect antibody recognition of the FLAG epitope. The FLAG tag can be used in conjunction with other affinity tags, for example a polyhistidine tag (His tag), HA tag or myc tag.
История
Первое использование эпитопной маркировки было описано Мунро и Пелхэмом в 1984 году. Флаг-тег был вторым примером полностью функционального, улучшенного эпитоп-тега, опубликованного в научной литературе, и единственным эпитопом, который был запатентован. С тех пор он стал одной из наиболее часто используемых белковых меток в лабораториях по всему миру. В отличие от некоторых других меток (например, myc, HA), где сначала выделялось моноклональное антитело к существующему белку, а затем эпитоп характеризовался и использовался в качестве метки, эпитоп FLAG представлял собой идеализированную, искусственно разработанную структуру, к которой были получены моноклональные антитела. Последовательность Флаг-тега была оптимизирована для совместимости с белками, к которым он присоединяется, поскольку Флаг-тег более гидрофилен, чем другие распространенные эпитопные метки, и, следовательно, реже снижает активность белков, к которым он присоединен. Кроме того, N-концевые Флаг-теги можно легко удалить из белков после их выделения обработкой специфической протеазой – энтерокиназой (энтеропептидазой). Третье сообщение об эпитопной маркировке (HA-тег) появилось примерно через год после начала продаж системы Flag.
The first use of epitope tagging was described by Munro and Pelham in 1984. The FLAG tag was the second example of a fully functional, improved epitope tag, published in the scientific literature. and was the only epitope tag to be patented. It has since become one of the most commonly used protein tags in laboratories worldwide. Unlike some other tags (e. g. myc, HA), where a monoclonal antibody was first isolated against an existing protein, then the epitope was characterized and used as a tag, the FLAG epitope was an idealized, artificial design, to which monoclonal antibodies were raised. The FLAG tag's sequence was optimized for compatibility with proteins it is attached to, in that FLAG tag is more hydrophilic than other common epitope tags and therefore less likely to reduce the activity of proteins to which FLAG tag is appended. In addition, N terminal FLAG tags can be removed readily from proteins once they have been isolated, by treatment with the specific protease, enterokinase (enteropeptidase). The third report of epitope tagging, (HA tag), appeared about one year after the Flag system had been first shipped.