Гендік экспрессия: ДНК-дан функционалды өнімге айналу процесі

Гендік экспрессия: ДНК ақпаратының функционалды өнімдерге (ақуыздар, РНК) айналуы. Фенотиптің қалыптасуындағы маңызды процесс. Биология, генетика.

24 мин оқу

100%

Дереккөз: Gene expression — Wikipedia

Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.

Мазмұны

Кіріспе

Геннің тізбегін жетілген ген өніміне немесе өнімдеріне түрлендіру

Гендік экспрессия – геннен алынған ақпараттың функционалдық ген өнімдерін синтездеуге қолданылатын процесі, бұл соңғы өнімдерді – ақуыздарды немесе кодтамайтын РНК-ны өндіруге және нәтижесінде фенотипке әсер етуге мүмкіндік береді. Бұл өнімдер көбінесе ақуыздар болып табылады, бірақ трансферлік РНК (тРНК) және кішкентай ядролық РНК (кРНК) сияқты ақуызды кодтамайтын гендерде өнім функционалдық кодтамайтын РНК болып табылады. Гендік экспрессия процесі барлық белгілі тіршілік иелері – эукариоттар (оның ішінде көпжасушалы организмдер), прокариоттар (бактериялар және археялар) және вирустар – тіршілік үшін макромолекулалық механизмдерді жасау үшін пайдаланады. Генетикада гендік экспрессия – генотип фенотипке, яғни байқалатын қасиетке қалай көшетінінің ең негізгі деңгейі. ДНК-да сақталған генетикалық ақпарат генотипті білдіреді, ал фенотип осы ақпараттың «түсіндірілуінен» туындайды. Мұндай фенотиптер көбінесе организмнің құрылымын және дамуын бақылайтын немесе белгілі бір метаболикалық жолдарды катализдейтін ферменттер ретінде әрекет ететін ақуыздардың синтезі арқылы көрінеді. Гендік экспрессия процесінің барлық қадамдары – транскрипция, РНК тігілуі, трансляция және ақуыздың трансляциядан кейінгі модификациясы – модуляциялануы (реттелуі) мүмкін. Гендік экспрессияны реттеу белгілі бір ген өнімінің (ақуыз немесе кодтамайтын РНК) уақытын, орнын және мөлшерін бақылауға мүмкіндік береді және жасушаның құрылымы мен функциясына терең әсер етуі мүмкін. Гендік экспрессияны реттеу – жасушалық дифференциацияның, дамудың, морфогенездің және кез келген организмнің әмбебаптығы мен бейімделу қабілетінің негізі. Сондықтан гендік реттеу эволюциялық өзгерістердің негізі ретінде қызмет етуі мүмкін.

Жазба көшірмесі

ДНК-ның бір тармағынан РНК көшірмесін жасау транскрипция деп аталады және оны РНК полимеразалар жүзеге асырады. Олар нуклеотид негіздерінің толықтылығы заңына сәйкес, өсіп келе жатқан РНК тармағына бір уақытта бір рибонуклеотидті қосады. Бұл РНК, 3′ → 5′ үлгідегі ДНК тармағына толықтығымен келеді, бірақ РНК-да тиминдер (T) урацилдерге (U) ауыстырылады және қателер болуы мүмкін. Бактерияларда транскрипцияны РНК полимеразаның бір түрі жүзеге асырады, ол транскрипцияны бастау үшін сигма фактор ақуызының (σ фактор) көмегімен Прибноу қорапшасы деп аталатын ДНК тізбегіне байланысуы керек. Эукариоттарда транскрипция ядрода РНК полимеразалардың үш түрі арқылы жүзеге асырылады, олардың әрқайсысына процесті бастау үшін промотор деп аталатын арнайы ДНК тізбегі және ДНК-ға байланысатын ақуыздар – транскрипция факторлары жиынтығы қажет (транскрипцияны реттеуді төменде қараңыз). РНК полимераза I рибосомалық РНК (rRNA) гендерінің транскрипциясына жауапты. РНК полимераза II (Pol II) барлық ақуызды кодтайтын гендерді, сондай-ақ кейбір кодтамайтын РНК-ны (мысалы, snRNA, snoRNA немесе ұзын кодтамайтын РНК) транскрипциялайды. РНК полимераза III 5S рРНК-ны, трансфер РНК (tRNA) гендерін және кейбір шағын кодтамайтын РНК-ларды (мысалы, 7SK) транскрипциялайды. Транскрипция полимераза терминатор деп аталатын тізбекке кездескенде аяқталады.

mRNA өңдеу

Прокариоттық белоктарды кодтайтын гендердің транскрипциясы ақуыздарға аударуға дайын хабаршы РНК (мРНК) құрайды, ал эукариоттық гендердің транскрипциясы РНК-ның бастапқы транскриптісін (пре-РНК) қалдырады, ол ересек РНК-ға айналу үшін бірқатар өзгерістерден өтуі керек. Пісіп жетілу процестеріне қатысты типтер мен қадамдар кодтаушы және кодтамайтын пре-РНК арасында әр түрлі болады; яғни, мРНК және тРНК үшін пре-РНК молекулалары шплицингке ұшыраса да, қадамдар мен механизмдері әртүрлі. Кодталмайтын РНК-ның өңделуі төменде сипатталған (кодталмайтын РНК пісіп жетілуі). Пре-мРНК өңдеуіне 5′-кептеу кіреді, ол пре-мРНК-ның 5′-ұшына 7 метилгуанозин (m7G) қосатын ферменттік реакциялар жиынтығы және осылайша РНК-ны экзонуклеазалардың ыдырауынан қорғайды. m7G қақпағы содан кейін қақпақ байланыстыру кешенінің гетеродимерімен (CBC20/CBC80) байланысады, бұл мРНК-ның цитоплазмаға экспортталуына көмектеседі және РНК-ны декаппингтен қорғайды. Тағы бір өзгеріс – 3′-бөліну және полиаденилирлеу. Олар пре-мРНК-да полиаденилирлеу сигналдық тізбегі (5′ AAUAAA 3′) болған жағдайда жүзеге асады, ол әдетте белокты кодтау тізбегі мен терминатордың арасында болады. Пре-мРНК алдымен бөлінеді, содан кейін поли(А) құйрығын құру үшін ~200 аденин (А) тізбегі қосылады, бұл РНК-ны ыдыраудан қорғайды. Поли(А) құйрығы мРНК экспорттау және трансляцияны қайта бастау үшін қажетті бірнеше поли(А) байланыстырушы ақуыздармен (PABPs) байланысады. Поли(А) құйрықтарының қысқаруының кері процесінде, CCR4 Not 3′–5′ экзонуклеазасы поли(А) құйрықтарын қысқартады, бұл көбінесе толық транскрипт ыдырауына әкеледі. Эукариоттық пре-мРНК-ның өте маңызды өзгерісі – РНК шплицингі. Эукариоттық пре-мРНК-ның көпшілігі экзондар және интрондар деп аталатын кезектесіп орналасқан сегменттерден тұрады. Шплицинг процесінде сплицеосома деп аталатын РНК-ақуыз катализдік кешені екі трансэстерификациялық реакцияны катализдейді, ол интронды алып тастап, оны лариат құрылымы түрінде босатады, содан кейін көрші экзондарды біріктіреді. Кейбір жағдайларда кейбір интрондар немесе экзондар ересек мРНК-да алынып тасталуы немесе сақталуы мүмкін. Бұл әдіс бір геннен шыққан әртүрлі транскрипттердің тізбегін жасайды. Бұл транскрипттер әртүрлі белоктарға аударылуы мүмкін болғандықтан, шплицинг эукариоттық ген экспрессиясының күрделілігін және түрдің протеомының көлемін кеңейтеді. РНК-ны кеңінен өңдеу эукариоттардың ядросының мүмкіндігі арқасында пайда болатын эволюциялық артықшылық болуы мүмкін. Прокариоттарда транскрипция және трансляция бірге жүреді, ал эукариоттарда ядролық мембрана екі процесті бөліп, РНК өңдеуге уақыт береді.

While transcription of prokaryotic protein coding genes creates messenger RNA (mRNA) that is ready for translation into protein, transcription of eukaryotic genes leaves a primary transcript of RNA (pre RNA), which first has to undergo a series of modifications to become a mature RNA. Types and steps involved in the maturation processes vary between coding and non coding preRNAs; i. e. even though preRNA molecules for both mRNA and tRNA undergo splicing, the steps and machinery involved are different. The processing of non coding RNA is described below (non coding RNA maturation). The processing of pre mRNA include 5′ capping, which is set of enzymatic reactions that add 7 methylguanosine (m7G) to the 5′ end of pre mRNA and thus protect the RNA from degradation by exonucleases. The m7G cap is then bound by cap binding complex heterodimer (CBC20/CBC80), which aids in mRNA export to cytoplasm and also protect the RNA from decapping. Another modification is 3′ cleavage and polyadenylation. They occur if polyadenylation signal sequence (5′ AAUAAA 3′) is present in pre mRNA, which is usually between protein coding sequence and terminator. The pre mRNA is first cleaved and then a series of ~200 adenines (A) are added to form poly(A) tail, which protects the RNA from degradation. The poly(A) tail is bound by multiple poly(A) binding proteins (PABPs) necessary for mRNA export and translation re initiation. In the inverse process of deadenylation, poly(A) tails are shortened by the CCR4 Not 3′ 5′ exonuclease, which often leads to full transcript decay. A very important modification of eukaryotic pre mRNA is RNA splicing. The majority of eukaryotic pre mRNAs consist of alternating segments called exons and introns. During the process of splicing, an RNA protein catalytical complex known as spliceosome catalyzes two transesterification reactions, which remove an intron and release it in form of lariat structure, and then splice neighbouring exons together. In certain cases, some introns or exons can be either removed or retained in mature mRNA. This so called alternative splicing creates series of different transcripts originating from a single gene. Because these transcripts can be potentially translated into different proteins, splicing extends the complexity of eukaryotic gene expression and the size of a species proteome. Extensive RNA processing may be an evolutionary advantage made possible by the nucleus of eukaryotes. In prokaryotes, transcription and translation happen together, whilst in eukaryotes, the nuclear membrane separates the two processes, giving time for RNA processing to occur.

Кодталмаған РНК пісіп жетілуі

Көптеген организмдерде кодтамайтын гендер (нкРНК) қосымша өңдеуден өтетін прекурсорлар түрінде транскрипцияланады. Рибосомалық РНК (рРНК) жағдайында, олар көбінесе бір немесе бірнеше рРНК-ны қамтитын пре-рРНК ретінде транскрипцияланады. Пре-рРНК шамамен 150 түрлі шағын нуклеольдік шектеулі РНК түрлері – snoRNA-лар арқылы белгілі бір орындарда бөлінеді және модификацияланады (2′ O метилирлеу және псевдоуридиннің қалыптасуы). SnoRNA-лар ақуыздармен байланысып, snoRNP-ларды құрайды. SnoRNA-ның бөлігі мақсатты РНК-мен базалық жұптасып, модификацияны дәл орынға орналастырады, ал ақуыз бөлігі каталитикалық реакцияны жүзеге асырады. Эукариоттарда, әсіресе RNase деп аталатын snoRNP, MRP 45S пре-рРНК-ны 28S, 5.8S және 18S рРНК-ға бөледі. рРНК және РНК өңдеу факторлары нуклеолус деп аталатын ірі агрегаттарды құрайды. Мысалы, трансферлік РНК (тРНК) жағдайында, 5′ тізбегі RNase P ферментімен алынып тасталады, ал 3′ тізбегі tRNase Z ферментімен алынып тасталады, ал шаблондық емес 3′ CCA құйрығы нуклеотидилтрансфераза ферментімен қосылады. Микро РНК (миРНК) жағдайында, миРНК-лар бастапқыда қақпақшасы және поли(А) құйрығы бар біріншілік транскрипттер немесе pri-миРНК ретінде транскрипцияланады және Drosha және Pasha ферменттерінің әсерімен жасуша ядросында 70 нуклеотидтік сабақ-ілмек құрылымына ие pre-миРНК-ға өңделеді. Экспортталғаннан кейін, ол цитоплазмада эндонуклеаза Dicer-мен өзара әрекеттесу арқылы жетілген миРНК-ларға өңделеді, бұл Аргонавт ақуызынан тұратын РНК-индукцияланған үнсіздендіру кешенінің (RISC) қалыптасуын бастайды. Тіпті snRNA және snoRNA-лар да функционалдық RNP кешенінің құрамына кірмес бұрын бірнеше модификациядан өтеді. Бұл ядролық плазмада немесе Cajal денелері деп аталатын арнайы бөлімдерде жүзеге асырылады. Олардың негіздері метилденген немесе псевдоуридинилденген, бұл snoRNA-ға құрылымдық ұқсас шағын Cajal денесіне тән РНК-лардың (scaRNA) тобымен жүзеге асырылады.

РНК экспорты

Эукариоттарда көптеген жетілген РНК ядродан цитоплазмаға экспортталуы тиіс. Кейбір РНК ядрода ғана жұмыс істейтін болса, көптеген РНК ядролық поралар арқылы цитозолға тасымалданады. РНК-ның экспорты экспортин деп аталатын белгілі бір ақуыздармен байланысуды қажет етеді. Әр РНК түрін экспорттау үшін нақты экспортін молекулалары жауапты. mРНК тасымалы экзондық түйісу кешенімен (ЭТК) дұрыс байланысуды талап етеді, бұл экспортқа дейін mРНК-ның толыққанды өңделуін қамтамасыз етеді. Кейбір жағдайларда РНК цитоплазманың белгілі бір бөлігіне, мысалы, синапсқа қосымша тасымалданады; одан кейін оларды РНК-дағы линкерлік ақуыздар арқылы нақты реттіліктерге ("зипкодтар" деп аталады) байланысатын моторлық ақуыздар сүйреп әкеледі.

Аударма

Кодталмаған РНК үшін жетілген РНК соңғы ген өнімдері болып табылады. РНК-ның хабаршысы (мРНК) бір немесе бірнеше белоктың синтезі үшін кодталатын ақпарат тасымалдаушы болып табылады. Бір ақуыздық тізбекті (эукариоттарда жиі кездесетін) алып жүретін мРНК моноцистронды, ал бірнеше ақуыздық тізбекті алып жүретін мРНК (прокариоттарда жиі кездесетін) полицистронды деп аталады. Әрбір мРНК үш бөліктен тұрады: 5′ трансляцияланбаған аймақ (5′UTR), белокты кодтайтын аймақ немесе ашық оқу фрейм (ORF) және 3′ трансляцияланбаған аймақ (3′UTR). Кодталған аймақ генетикалық кодпен кодталған ақуыз синтезі туралы ақпаратты алып жүреді. Кодтау аймағының әр нуклеотидтік триплет кодон деп аталады және трансферттік РНК-да антикодондық триплетке толыққанды сәйкес келетін байланыс орнына ие. Бірдей антикодондық реттілікпен трансферт РНК әрқашан бірдей типті амин қышқылы бар. Амин қышқылдары содан кейін рибосомамен кодтау аймағындағы триплеттердің реті бойынша тізбектеледі. Рибосома трансферт РНК-ның хабаршы РНК-ға байланысуына көмектеседі және әр трансферт РНК-дан амин қышқылын алып, одан ақуыз құрылысын жасайды. Әр мРНК молекуласы көптеген ақуыз молекулаларына аударылады, сүтқоректілерде орташа есеппен ~2800. Прокариоттарда аударма көбінесе транскрипция орнында (котранскрипциялық түрде) жүзеге асады, көбінесе әлі де құрылу үрдісіндегі хабаршы РНК-ны пайдаланады. Эукариоттарда аударма жазылып жатқан белоктың орналасуына байланысты клетканың әртүрлі аймақтарында жүруі мүмкін. Негізгі орындар – ерігіш цитоплазмалық ақуыздар үшін цитоплазма және жасушадан экспорттауға немесе жасуша мембранасына енгізуге арналған ақуыздар үшін эндоплазмалық тордың мембранасы. Эндоплазмалық торда өндірілетін ақуыздар аударма процесінің барысында танылады. Бұл сигналды тану бөлшегімен реттеледі – рибосомамен байланысып, өсіп келе жатқан (жаңа) амин қышқылының тізбегіндегі сигнал пептиді табылған кезде оны эндоплазмалық торға бағыттайтын ақуыз.

For some non coding RNA, the mature RNA is the final gene product. In the case of messenger RNA (mRNA) the RNA is an information carrier coding for the synthesis of one or more proteins. mRNA carrying a single protein sequence (common in eukaryotes) is monocistronic whilst mRNA carrying multiple protein sequences (common in prokaryotes) is known as polycistronic. Every mRNA consists of three parts: a 5′ untranslated region (5′UTR), a protein coding region or open reading frame (ORF), and a 3′ untranslated region (3′UTR). The coding region carries information for protein synthesis encoded by the genetic code to form triplets. Each triplet of nucleotides of the coding region is called a codon and corresponds to a binding site complementary to an anticodon triplet in transfer RNA. Transfer RNAs with the same anticodon sequence always carry an identical type of amino acid. Amino acids are then chained together by the ribosome according to the order of triplets in the coding region. The ribosome helps transfer RNA to bind to messenger RNA and takes the amino acid from each transfer RNA and makes a structure less protein out of it. Each mRNA molecule is translated into many protein molecules, on average ~2800 in mammals. In prokaryotes translation generally occurs at the point of transcription (co transcriptionally), often using a messenger RNA that is still in the process of being created. In eukaryotes translation can occur in a variety of regions of the cell depending on where the protein being written is supposed to be. Major locations are the cytoplasm for soluble cytoplasmic proteins and the membrane of the endoplasmic reticulum for proteins that are for export from the cell or insertion into a cell membrane. Proteins that are supposed to be produced at the endoplasmic reticulum are recognised part way through the translation process. This is governed by the signal recognition particle—a protein that binds to the ribosome and directs it to the endoplasmic reticulum when it finds a signal peptide on the growing (nascent) amino acid chain.

Қиылысу

Әрбір белок мРНК тізбегінен аминокислоталардың тізбегіне аударылғанда, жазылмаған полипептид немесе кездейсоқ орам түрінде болады. Бұл полипептидтің дамыған үш өлшемді құрылымы жоқ (қосымша суреттің сол жағы). Полипептид содан кейін кездейсоқ орамнан өзінің ерекше және функционалдық үш өлшемді құрылымына жиырылады. Аминокислоталар бір-бірімен өзара әрекеттесіп, жақсы анықталған үш өлшемді құрылымды, жиырылған белокты (суреттің оң жағы) тума күй деп атайды. Пайда болған үш өлшемді құрылым аминокислоталар тізбегімен анықталады (Анфинсен догмасы). Дұрыс үш өлшемді құрылым функция үшін өте маңызды, бірақ функционалды белоктардың кейбір бөліктері жазылмаған күйде қалуы мүмкін. Күтілген пішінге жиырылмау әдетте әртүрлі қасиеттері бар, белсенді емес ақуыздарды, соның ішінде улы приондарды тудырады. Нейродегенеративті және басқа да аурулардың көптеген түрлері дұрыс жиырылмаған ақуыздардың жиналуынан туындайды деп саналады. Көптеген аллергиялар ақуыздардың жиырылуынан пайда болады, себебі иммундық жүйе кейбір ақуыз құрылымдарына қарсы антиденелер шығармайды. Шаперон деп аталатын ферменттер жаңадан түзілген белокқа жұмыс істеу үшін қажетті үш өлшемді құрылымға (жиырылуға) қол жеткізуге көмектеседі. Сол сияқты, РНК шаперондары РНК-ның функционалдық пішінін алуына көмектеседі. Эндоплазмалық тордың эукариоттардағы негізгі рөлінің бірі – ақуыздардың жиырылуына көмектесу.

Көшіру

Эукариоттар мен прокариоттардың секреторлық ақуыздары секреторлық жолға ену үшін транслокациялануы тиіс. Жаңа синтезделген ақуыздар сигналдық пептидтер арқылы еукариоттық Sec61 немесе прокариоттық SecYEG транслокациялық арнасына бағытталады. Эукариоттардағы ақуыз секрециясының тиімділігі пайдаланылған сигналдық пептидке өте байланысты.

Белоктарды тасымалдау

Көптеген ақуыздар цитозолдан өзге жасушаның басқа бөліктеріне жөнелтіледі және ақуыздарды тиісті орнына бағыттау үшін кең ауқымды сигналдық тізбектер немесе (сигналдық пептидтер) қолданылады. Прокариоттарда жасушаның шектеулі бөлінуіне байланысты бұл әдетте қарапайым процесс болып келеді. Дегенмен, эукариоттарда ақуыздың дұрыс органеллаға жеткенін қамтамасыз ету үшін әртүрлі бағыттау процестері бар. Барлық ақуыздар жасуша ішінде қалып қоймайды, олардың көптеген түрлері сыртқа шығарылады, мысалы, ас қорыту ферменттері, гормондар және жасушадан тыс матрица ақуыздары. Эукариоттарда экспорт жолы жақсы дамыған, ал осы ақуыздарды экспорттаудың негізгі механизмі – эндоплазмалық торға транслокация, одан кейін Гольги аппараты арқылы тасымалдау.

Транскрипциялық реттеу

Транскрипцияны реттеуді үш негізгі әсер ету жолына бөлуге болады: генетикалық (реттеуші фактордың генмен тікелей өзара әрекеттесуі), реттеуші фактордың транскрипция механизмімен модуляциялық өзара әрекеттесуі және эпигенетикалық (транскрипцияға әсер ететін ДНК құрылымының тізбектелмеген өзгерістері). ДНК-мен тікелей өзара әрекеттесу – бұл ақуыздың транскрипция деңгейін өзгертетін ең қарапайым және тікелей әдіс. Гендер көбінесе кодтау аймағының айналасында транскрипцияны реттеуге арналған нақты функциясы бар бірнеше ақуыз байланысу орындарына ие. Күшейткіштер, оқшаулағыштар және басушылар деп аталатын реттеуші ДНК байланысу орындарының көптеген кластары белгілі. Транскрипцияны реттеу механизмдері РНК полимеразаның ДНК-дағы маңызды байланысу орындарын жабудан бастап, РНК полимеразаның байланысуына көмектесу арқылы активатор ретінде әрекет етуге және транскрипцияны ынталандыруға дейін әртүрлі. Транскрипция факторларының белсенділігі клетка ішіндегі сигналдармен одан әрі модуляцияланады, бұл фосфорилдану, ацетилдеу немесе гликозилдеу сияқты ақуыздың трансляциялық модификациясына әкеледі. Бұл өзгерістер транскрипция факторының промоторлық ДНК-ға, РНК полимеразаға тікелей немесе жанама түрде байланысу қабілетіне, сондай-ақ жаңа синтезделген РНК молекуласының созылуына ықпал етеді. Эукариоттардың ядролық мембранасы транскрипция факторларын олардың ядрода болу ұзақтығымен реттеуге мүмкіндік береді, бұл олардың құрылымындағы қайтымды өзгерістермен және басқа ақуыздарға байланысумен реттеледі. Сыртқы ортаның стимулдары немесе эндокриндік сигналдар реттеуші ақуыздардың модификациясына себеп болуы мүмкін, бұл клетка ішіндегі сигналдардың тізбегін тудырады, нәтижесінде ген экспрессиясы реттеледі. Транскрипцияға ДНК тізбегіне тән емес әсерлердің маңызды әсері бар екені анықталды. Бұл әсерлер эпигенетикалық деп аталады және ДНК-ның жоғары ретті құрылымын, тізбектелмеген ДНК байланыстырушы ақуыздарды және ДНК-ның химиялық модификациясын қамтиды. Жалпы, эпигенетикалық әсерлер ДНК-ның ақуыздарға қолжетімділігін өзгертеді және осылайша транскрипцияны модуляциялайды. Эукариоттарда хроматиннің құрылымы гистон кодымен бақыланады, ол ДНК-ға қол жеткізуді реттейді және эухроматин мен гетерохроматин аймақтарындағы гендердің экспрессиясына маңызды әсер етеді.

Regulation of transcription can be broken down into three main routes of influence; genetic (direct interaction of a control factor with the gene), modulation interaction of a control factor with the transcription machinery and epigenetic (non sequence changes in DNA structure that influence transcription). Direct interaction with DNA is the simplest and the most direct method by which a protein changes transcription levels. Genes often have several protein binding sites around the coding region with the specific function of regulating transcription. There are many classes of regulatory DNA binding sites known as enhancers, insulators and silencers. The mechanisms for regulating transcription are varied, from blocking key binding sites on the DNA for RNA polymerase to acting as an activator and promoting transcription by assisting RNA polymerase binding. The activity of transcription factors is further modulated by intracellular signals causing protein post translational modification including phosphorylation, acetylation, or glycosylation. These changes influence a transcription factor's ability to bind, directly or indirectly, to promoter DNA, to recruit RNA polymerase, or to favor elongation of a newly synthesized RNA molecule. The nuclear membrane in eukaryotes allows further regulation of transcription factors by the duration of their presence in the nucleus, which is regulated by reversible changes in their structure and by binding of other proteins. Environmental stimuli or endocrine signals may cause modification of regulatory proteins eliciting cascades of intracellular signals, which result in regulation of gene expression. It has become apparent that there is a significant influence of non DNA sequence specific effects on transcription. These effects are referred to as epigenetic and involve the higher order structure of DNA, non sequence specific DNA binding proteins and chemical modification of DNA. In general epigenetic effects alter the accessibility of DNA to proteins and so modulate transcription. In eukaryotes the structure of chromatin, controlled by the histone code, regulates access to DNA with significant impacts on the expression of genes in euchromatin and heterochromatin areas.

Сүтқоректілердің транскрипциясында күштілендіретін заттар, транскрипция факторлары, медиатор кешені және ДНК циклдері

Сүтқоректілерде гендік экспрессия көптеген цис-реттеуші элементтермен реттеледі, оның ішінде гендердің транскрипцияның басталу орындарының жанында, ДНК-ның жоғары жағында (сезімдік тізбектің 5' аймағына қарай) орналасқан негізгі промоторлар және промоторға жақын элементтер бар. Басқа маңызды цис-реттеуші модульдер транскрипция басталатын орындардан қашықта орналасқан ДНК аймақтарында табылады. Оларға күшейткіштер, басушылар, оқшаулағыштар және байланыстыру элементтері кіреді. Күшейткіштер және олармен байланысты транскрипция факторлары гендік экспрессияны реттеуде маңызды рөл атқарады. Күшейткіштер – гендерді реттейтін геном аймақтары. Күшейткіштер жасуша түріне тән гендік экспрессия бағдарламаларын бақылайды, көбінесе олардың мақсатты гендерінің промоторларымен физикалық жақындыққа келу үшін ұзақ қашықтықтарды аралап өтеді. Көптеген күшейткіштер, әрқайсысы олардың мақсатты гендерінен ондаған немесе жүздеген мың нуклеотидтер қашықтықта орналасқан, мақсатты геннің промоторларына тікелей байланысып, гендік экспрессияны бақылау үшін бір-бірімен үйлеседі. Бірнеше жасушалық функцияға тән транскрипция факторлары (адам жасушасындағы шамамен 1600 транскрипция факторларының арасында) әдетте күшейткіштегі белгілі мотивтерге байланысады. Бұл күшейткішке байланысқан транскрипция факторларының шағын комбинациясы, ДНК иілімі арқылы промоторға жақындағанда, мақсатты геннің транскрипция деңгейін анықтайды. Медиатор (әдетте өзара әрекеттесетін құрылымдағы 26 белоктан тұратын кешен) ДНК-ға байланысқан транскрипция факторларының реттеу сигналдарын тікелей РНК-полимераза II (pol II) ферментіне, промоторға байланысқан күйінде жеткізеді. Күшейткіштер белсенді болғанда, әдетте екі ДНК тізбегінен, екі бағытта әрекет ететін РНК полимеразалармен транскрипцияланады, нәтижесінде суретте көрсетілгендей екі eRNA пайда болады. Белсенді емес күшейткіш белсенді емес транскрипция факторымен байланысуы мүмкін. Транскрипция факторының фосфорилирленуі оны белсендіре алады, ал белсендірілген транскрипция факторы оған байланысқан күшейткішті белсендіре алады (суретте күшейткішке байланысқан транскрипция факторының фосфорилирленуін көрсететін кішкентай қызыл жұлдызды қараңыз). Белсенділенген күшейткіш өзінің мақсатты генінен хабаршы РНК транскрипциясын белсендірмес бұрын өзінің РНК транскрипциясын бастайды.

Gene expression in mammals is regulated by many cis regulatory elements, including core promoters and promoter proximal elements that are located near the transcription start sites of genes, upstream on the DNA (towards the 5' region of the sense strand). Other important cis regulatory modules are localized in DNA regions that are distant from the transcription start sites. These include enhancers, silencers, insulators and tethering elements. Enhancers and their associated transcription factors have a leading role in the regulation of gene expression. Enhancers are genome regions that regulate genes. Enhancers control cell type specific gene expression programs, most often by looping through long distances to come in physical proximity with the promoters of their target genes. Multiple enhancers, each often tens or hundred of thousands of nucleotides distant from their target genes, loop to their target gene promoters and coordinate with each other to control gene expression. Several cell function specific transcription factors (among the about 1,600 transcription factors in a human cell) generally bind to specific motifs on an enhancer. A small combination of these enhancer bound transcription factors, when brought close to a promoter by a DNA loop, govern transcription level of the target gene. Mediator (a complex usually consisting of about 26 proteins in an interacting structure) communicates regulatory signals from enhancer DNA bound transcription factors directly to the RNA polymerase II (pol II) enzyme bound to the promoter. Enhancers, when active, are generally transcribed from both strands of DNA with RNA polymerases acting in two different directions, producing two eRNAs as illustrated in the figure. An inactive enhancer may be bound by an inactive transcription factor. Phosphorylation of the transcription factor may activate it and that activated transcription factor may then activate the enhancer to which it is bound (see small red star representing phosphorylation of transcription factor bound to enhancer in the illustration). An activated enhancer begins transcription of its RNA before activating transcription of messenger RNA from its target gene.

Транскрипциялық реттелудегі ДНК метилирлеу және деметилдеу

ДНҚ метилирлеу - ген экспрессиясына эпигенетикалық әсер ететін кең таралған механизм, ол бактериялар мен эукариоттарда кездеседі және мұралық транскрипцияны басу мен транскрипцияны реттеуде маңызды рөл атқарады. Метилирлеу көбінесе цитозинде жүреді (суретті қараңыз). Цитозиннің метилирленуі негізінен цитозиннен кейін гуанин орналасқан динуклеотидтік тізбектерде, яғни CpG сайтында болады. Адам геномындағы CpG сайттарының саны шамамен 28 миллионға жетеді. Жасуша түріне байланысты, CpG сайттарының шамамен 70% метилирленген цитозинге ие. ДНҚ-дағы цитозиннің метилирленуі ген экспрессиясын реттеуде маңызды рөл атқарады. Геннің промоторлық аймағындағы CpG-нің метилирленуі әдетте геннің транскрипциясын төмендетеді, ал геннің денесіндегі CpG-нің метилирленуі экспрессияны жоғарылатады. ТЭТ ферменттері метилденген цитозиндерді деметилдендіруде орталық рөл атқарады. ТЭТ ферментінің активтілігі арқасында ген промоторындағы CpG-нің деметилденуі геннің транскрипциясын арттырады.

Оқу мен есте сақтаудағы транскрипциялық реттеу

Тышқандағы қорқыныш кондиционирлеуі (CFC) – ауыр оқу тәжірибесі. КФК-ның бір ғана эпизоды өмір бойына созылатын қорқыныш жадына әкелуі мүмкін. КФК эпизодынан кейін цитозин метилирлеуі тышқанның гиппокамп нейроны ДНҚ-сының барлық гендерінің шамамен 9,17% промотор аймақтарында өзгереді. Гиппокамп – жаңа жадтардың бастапқыда сақталанатын орны. КФК-дан кейін 500-ге жуық геннің транскрипциясы артады (көбінесе промотор аймағындағы CpG сайттарының деметилденуі нәтижесінде) және 1000-ға жуық геннің транскрипциясы төмендейді (көбінесе промотор аймағындағы CpG сайттарында жаңадан пайда болған 5-метилцитозин нәтижесінде). Нейрондар ішіндегі индукцияланған және репрессияланған гендердің үлгісі, тышқан миының гиппокамбында осы оқу оқиғасының алғашқы уақытша жадысын қалыптастыру үшін молекулалық негізді қамтамасыз етеді (қорытынды үшін). Бір механизмге ТЕТ1 ДНҚ деметилдеу ферментінің қысқа изоформасы, ТЕТ1s, геномдағы 600-ға жуық орынға бағытталуы жатады. Бағыттау ТЕТ1s пен EGR1 ақуызының байланысы арқылы жүзеге асырылады, ол жад қалыптасуда маңызды транскрипция факторы. ТЕТ1s-ті осы орынға жеткізу сол жерде ДНҚ деметилдеуін бастайды, байланысты гендердің жоғары реттелуіне әкеледі. Екінші механизмге ДНҚ метилтрансферазасы DNMT3A-ның тігіс изоформасы DNMT3A кіреді, ол ДНҚ-дағы цитозиндерге метил топтарын қосады. Бұл изоформа синаптық белсенділікпен индукцияланады, ал оның әрекет ету орны гистонның посттрансляциялық модификацияларымен (гистон коды) анықталады. Нәтижесінде пайда болған жаңа хабаршы РНК-лар хабаршы РНП бөлшектерімен (нейрондық гранулалар) нейрондардың синапстарына тасымалданады, онда олар синапстардың қызметіне әсер ететін ақуыздарға аударылады. КФК-дан кейін BDNF ген экспрессиясының жоғарылауы байқалды, бұл геннің белгілі бір ішкі промоторларының CpG метилирлеуінің төмендеуімен байланысты және бұл оқумен байланысты болды. Геннің көптеген промоторлық CpG сайттары метилирленген кезде ген үндемей қалады. Ішек-қолқа қатерлі ісігі әдетте 3-6 драйверлік мутацияға және 33-66 автостопшы немесе жолаушы мутацияға ие. Дегенмен, қатерлі ісікке прогрессияға себеп болуда транскрипциялық үндеу мутациядан гөрі маңыздырақ болуы мүмкін. Мысалы, ішек-қолқа қатерлі ісігінде 600-800 генге дейін CpG арал метилирлеуі арқылы транскрипциялық түрде үндетіледі (қатерлі ісікте транскрипцияны реттеуді қараңыз). Қатерлі ісіктегі транскрипциялық репрессия басқа эпигенетикалық механизмдер арқылы да жүзеге асырылуы мүмкін, мысалы микроРНК экспрессиясының өзгеруі. Сүт безі қатерлі ісігінде BRCA1 транскрипциялық репрессиясы BRCA1 промоторының гиперметилденуіне қарағанда, жоғары транскрипцияланған 182 микроРНК арқылы жиірек жүреді (сүт және жұмыртқа безі қатерлі ісігінде BRCA1 экспрессиясының төмендеуін қараңыз).

In a rat, contextual fear conditioning (CFC) is a painful learning experience. Just one episode of CFC can result in a life long fearful memory. After an episode of CFC, cytosine methylation is altered in the promoter regions of about 9.17% of all genes in the hippocampus neuron DNA of a rat. The hippocampus is where new memories are initially stored. After CFC about 500 genes have increased transcription (often due to demethylation of CpG sites in a promoter region) and about 1,000 genes have decreased transcription (often due to newly formed 5 methylcytosine at CpG sites in a promoter region). The pattern of induced and repressed genes within neurons appears to provide a molecular basis for forming the first transient memory of this training event in the hippocampus of the rat brain. for summary). One mechanism includes guiding the short isoform of the TET1 DNA demethylation enzyme, TET1s, to about 600 locations on the genome. The guidance is performed by association of TET1s with EGR1 protein, a transcription factor important in memory formation. Bringing TET1s to these locations initiates DNA demethylation at those sites, up regulating associated genes. A second mechanism involves DNMT3A2, a splice isoform of DNA methyltransferase DNMT3A, which adds methyl groups to cytosines in DNA. This isoform is induced by synaptic activity, and its location of action appears to be determined by histone post translational modifications (a histone code). The resulting new messenger RNAs are then transported by messenger RNP particles (neuronal granules) to synapses of the neurons, where they can be translated into proteins affecting the activities of synapses. After CFC there was upregulation of BDNF gene expression, related to decreased CpG methylation of certain internal promoters of the gene, and this was correlated with learning. When many of a gene's promoter CpG sites are methylated the gene becomes silenced. Colorectal cancers typically have 3 to 6 driver mutations and 33 to 66 hitchhiker or passenger mutations. However, transcriptional silencing may be of more importance than mutation in causing progression to cancer. For example, in colorectal cancers about 600 to 800 genes are transcriptionally silenced by CpG island methylation (see regulation of transcription in cancer). Transcriptional repression in cancer can also occur by other epigenetic mechanisms, such as altered expression of microRNAs. In breast cancer, transcriptional repression of BRCA1 may occur more frequently by over transcribed microRNA 182 than by hypermethylation of the BRCA1 promoter (see Low expression of BRCA1 in breast and ovarian cancers).

Транскрипциядан кейінгі реттеу

Трансляция мүмкін болу үшін РНК экспорты қажет эукариоттарда, ядролық экспорт гендік экспрессияны қосымша реттеуге мүмкіндік береді деп саналады. Ядроға кіру және одан шығудың барлық көлігі ядролық тесік арқылы жүзеге асады және көлікті импорт және экспорт ақуыздарының кең спектрі бақылайды. Белгілі бір белокты кодтаушы геннің экспрессиясы, кодты тасымалдайтын жарғылық РНК (мРНК) аудармаға жеткенше жеткілікті ұзақ сақталған жағдайда ғана мүмкін. Типик жасушада РНК молекуласы ыдыраудан қорғалғанда ғана тұрақты болады. РНК ыдырауы эукариоттық жасушаларда экспрессияны реттеуде маңызды рөл атқарады, себебі мРНК аудармадан бұрын айтарлықтай қашықтықты жүріп өтуі керек. Эукариоттарда РНК, транскрипциядан кейінгі белгілі бір өзгерістер арқылы тұрақтандырылады, әсіресе 5' қақпақ және полиаденилденген құйрық. мРНК-ның қасақана ыдырауы тек сыртқы РНК-дан (әдетте вирустардан) қорғаныс механизмі ретінде ғана емес, сонымен қатар мРНК-ны тұрақсыздандыру жолы ретінде де қолданылады. Егер мРНК молекуласында кішкентай интерференциялық РНК-мен толыққан тізбек болса, онда ол РНК-ның интерференциялық жолы арқылы жойылған болады.

Үш негізгі трансляцияланбаған аймақтар мен микроРНК

Үш негізгі аударылмаған аймақтар (3′ UTR) хабаршы РНК-ның (mRNA) құрамында жиі ген экспрессиясын транскрипциядан кейін реттейтін тізбектер болады. Мұндай 3′ UTR-лерде микроРНК-ларға (miRNA) және реттеуші ақуыздарға байланысу орындары жиі кездеседі. 3′ UTR ішіндегі белгілі бір орындарға байланысу арқылы miRNA әртүрлі mRNA-лардың ген экспрессиясын төмендетуі мүмкін, трансляцияны тежеу арқылы немесе транскрипттің тікелей деградациясына алып келу арқылы. 3′ UTR мРНК экспрессиясын тежейтін репрессорлық ақуыздарды байланыстыратын үнсіздеуші аймақтарды да қамти алады. 3′ UTR жиі микроРНК жауап элементтерін (MRE) қамтиды. MRE – miRNA-лардың байланысатын тізбектері. Бұл 3′ UTR-лерде кең таралған мотивтер. 3′ UTR-дегі барлық реттеуші мотивтердің (мысалы, үнсіздеуші аймақтарды қоса алғанда) арасында MRE мотивтер шамамен жартысын құрайды. 2014 жылғы мәлімет бойынша, miRBase веб-сайтында (miRNA тізбектері мен түсіндірмелерінің архиві) 233 биологиялық түрге қатысты 28 645 жазба тізімделген. Олардың ішінде 1 881 miRNA аннотацияланған адам miRNA локустарында кездеседі. miRNA-лардың орта есеппен шамамен төрт жүздей мақсатты mRNA-ға ие болуы болжамдалған (бірнеше жүз геннің экспрессиясына әсер етеді). Фридман және авторлар. Басқа эксперименттер бір miRNA жүздеген белоктардың өндірісін басып тастауға қабілетті екенін, бірақ бұл басу көбінесе салыстырмалы түрде жұмсақ (2 еседен аз) болатынын көрсетті. miRNA-ның ген экспрессиясын бұзудың салдары қатерлі ісіктерде маңызды рөл атқаратын секілді. Мысалы, асқазан-ішек жолының қатерлі ісігінде тоғыз miRNA эпигенетикалық түрде өзгергені және ДНК жөндеу ферменттерін төмендетуде тиімді екені анықталды. miRNA-ның ген экспрессиясын бұзудың салдары шизофрения, екіполярлы бұзылу, үлкен депрессия, Паркинсон ауруы, Альцгеймер ауруы және аутизм спектріндегі бұзылулар сияқты нейропсихиатриялық ауруларда да маңызды болып көрінеді.

Аудармалық реттеу

Трансляцияның тікелей реттелуі транскрипцияның немесе мРНҚ тұрақтылығының бақылауына қарағанда сирек кездеседі, бірақ кейде қолданылады. Ақуыз трансляциясын тежеу – токсиндер мен антибиотиктердің маңызды нысанасы, олар қалыпты гендік экспрессияны бақылауды жоңғылтпай, жасушаны өлтіре алады. Ақуыз синтезінің ингибиторларына антибиотик неомицин және рицин токсині жатады.

Аудармадан кейінгі өзгерістер

Трансляциялықтан кейінгі модификациялар (ПТМ) – ақуыздардың коваленттік модификациялары. РНҚ тігілуі сияқты, олар протеомды едәуір әртараптандыруға көмектеседі. Бұл модификациялар әдетте ферменттермен катализденеді. Аминқышқылының тізбектес қалдықтарына коваленттік қосылу сияқты процестерді басқа ферменттер кері қайтаруы мүмкін. Дегенмен, кейбіреулері, мысалы, ақуыздың негізгі тізбегінің протеолитикалық кесілуі, қайтымсыз болып табылады. ПТМ жасушада көптеген маңызды қызметтер атқарады. Мысалы, фосфорилдану ақуыздарды белсендіру және белсендіруден тоқтату, сондай-ақ сигналдық жолдарға қатысумен байланысты. ПТМ транскрипциялық реттеуге қатысады: ацетилдену және метилденудің маңызды функциясы – гистонның құйрықшасын модификациялау, ол ДНҚ-ның транскрипцияға қолжетімділігін өзгертеді. ПТМ-нің бір түрі ПТМ-нің басқа түрін іске қосуы мүмкін, мысалы, протеолиз арқылы ыдырауға белгіленген кезде ақуыздарда байқалады.

Өлшем

Гендік экспрессияны өлшеу көптеген өмірлік ғылымдардың маңызды бөлігі болып табылады, себебі белгілі бір геннің жасуша, тіндер немесе организмде экспрессия деңгейін анықтау мүмкіндігі көптеген құнды ақпаратты ұсынуы мүмкін. Мысалы, гендік экспрессияны өлшеу арқылы:
Жасушаның вирустық инфекциясын (вирустық белок экспрессиясын) анықтауға болады. Адамның қатерлі ісікке бейімділігін анықтауға болады (онкоген экспрессиясы). Бактерияның пенициллинге (бета-лактамаза экспрессиясы) төзімділігін анықтауға болады. Гендік экспрессия профилі – жасушаның негізгі механизмдерін түсінуге көмектесетін гендер жиынтығын бағалау. Бұл қатерлі ісіктерді емдеуде, химиялық терапияны нақты мақсатқа бағыттау үшін көбірек қолданылады. (Толық мәліметтер үшін РНК секвенциялау және ДНК микромассивтеріне қараңыз.) Сонымен қатар, ақуыз экспрессиясының орналасуын талдау – күшті құрал, оны организмдер немесе жасушалар деңгейінде жүргізуге болады. Орналасуды зерттеу көпжасушалы организмдердің дамуын зерттеу үшін және жеке жасушадағы ақуыз функциясының индикаторы ретінде өте маңызды. Идеалды жағдайда экспрессияны өлшеу соңғы ген өнімін (көптеген гендер үшін бұл ақуыз) анықтау арқылы жүзеге асырылады; бірақ көбінесе мРНК прекурсорының біреуін анықтау және осы өлшемдерден гендік экспрессия деңгейін болжау оңайырақ.

mRNA сандық анықтау

МРНК деңгейін сандық тұрғыдан өлшеу үшін солтүстік блоттау әдісі қолданылады, ол мРНК молекулаларының мөлшері және тізбегі туралы ақпаратты қамтамасыз етеді. РНҚ үлгісі агароза гелінде бөлініп, мақсатты тізбекке толық сәйкес келетін радиоактивті белгіленген РНҚ зондымен гибридтеледі. Радиобелгіленген РНҚ кейіннен авторадиография арқылы анықталады. Радиоактивті реагенттерді қолдану процедураны уақытты қажет ететін және қауіпті ететіндіктен, дигоксигенин және биотин химиясы сияқты баламалы белгілеу және анықтау әдістері әзірленді. Солтүстік блоттаудың кемшіліктеріне үлкен мөлшерде РНҚ қажеттігі және сандық анықтаудың толыққанды дәлдігінің болмауы жатады, себебі ол гель суретіндегі жолақтың қарқындылығын өлшеуді қамтиды. Алайда, Солтүстік блоттан алынған қосымша мРНК мөлшері туралы ақпарат, альтернативті тігілген транскрипттерді ажыратуға мүмкіндік береді. МРНК мөлшерін өлшеудің тағы бір әдісі – RT qPCR. Бұл әдісте кері транскрипциядан кейін сандық ПТР жүргізіледі. Кері транскрипция мРНК-дан ДНК матрицасын жасайды; бұл бір тізбекті матрица cDNA деп аталады. Содан кейін cDNA матрицасы сандық кезеңде күшейтіледі, осы кезеңде белгіленген гибридтеу зондтары немесе интеркаляциялық бояулардың шығаратын флуоресценциясы ДНК күшейту процесінің барысына қарай өзгереді. Дұрыс құрастырылған стандартты қисықпен qPCR бастапқы мРНК көшірмелерінің санын абсолютті түрде өлшеуге мүмкіндік береді, әдетте гомогенделген тіндің нанолитріне немесе бір жасушаға шаққандағы көшірмелердің бірлігінде. qPCR өте сезімтал (теориялық тұрғыдан бір мРНК молекуласын анықтау мүмкін), бірақ қолданылатын репортер түріне байланысты қымбат болуы мүмкін; флуоресцентті белгіленген олигонуклеотидтік зондтар, ерекше емес интеркаляциялық флуоресценттік бояуларға қарағанда қымбат. Экспрессиялық профильдеу немесе үлгідегі көптеген гендерді жоғары өтімділікпен талдау үшін, сандық ПТР төмен тығыздықтағы массивтерде бір мезгілде жүздеген гендер үшін орындалуы мүмкін. Балама тәсіл – гибридтік микроаррай. Бір аррай немесе "чип" бір немесе бірнеше организмнің геномдарындағы барлық белгілі гендердің транскрипт деңгейін анықтау үшін зондтарды қамтуы мүмкін. Сонымен қатар, ген экспрессиясының сериялық талдауы (SAGE) және РНК Seq сияқты "тегге негізделген" технологияларды қолдануға болады, олар әртүрлі мРНК-ның жасушалық концентрациясын салыстырмалы түрде өлшейді. Тегге негізделген әдістердің артықшылығы – "ашық архитектура", бұл белгілі немесе белгісіз тізбегі бар кез келген транскриптті дәл өлшеуге мүмкіндік береді. РНК Seq сияқты келесі буын тізбектеу (NGS) – тағы бір тәсіл, ол анықтамалық геноммен сәйкес келетін үлкен көлемдегі тізбек деректерін шығарады. NGS салыстырмалы түрде уақытты қажет ететін, қымбат және ресурстарды көп қажет ететін болса да, ол жалғыз нуклеотидтік полиморфизмдерді, тігілу варианттарын және жаңа гендерді анықтай алады, сондай-ақ, тізбегі туралы ақпарат аз немесе мүлдем жоқ организмдердегі экспрессияны профильдеу үшін де қолданылуы мүмкін.

Levels of mRNA can be quantitatively measured by northern blotting, which provides size and sequence information about the mRNA molecules. A sample of RNA is separated on an agarose gel and hybridized to a radioactively labeled RNA probe that is complementary to the target sequence. The radiolabeled RNA is then detected by an autoradiograph. Because the use of radioactive reagents makes the procedure time consuming and potentially dangerous, alternative labeling and detection methods, such as digoxigenin and biotin chemistries, have been developed. Perceived disadvantages of Northern blotting are that large quantities of RNA are required and that quantification may not be completely accurate, as it involves measuring band strength in an image of a gel. On the other hand, the additional mRNA size information from the Northern blot allows the discrimination of alternately spliced transcripts. Another approach for measuring mRNA abundance is RT qPCR. In this technique, reverse transcription is followed by quantitative PCR. Reverse transcription first generates a DNA template from the mRNA; this single stranded template is called cDNA. The cDNA template is then amplified in the quantitative step, during which the fluorescence emitted by labeled hybridization probes or intercalating dyes changes as the DNA amplification process progresses. With a carefully constructed standard curve, qPCR can produce an absolute measurement of the number of copies of original mRNA, typically in units of copies per nanolitre of homogenized tissue or copies per cell. qPCR is very sensitive (detection of a single mRNA molecule is theoretically possible), but can be expensive depending on the type of reporter used; fluorescently labeled oligonucleotide probes are more expensive than non specific intercalating fluorescent dyes. For expression profiling, or high throughput analysis of many genes within a sample, quantitative PCR may be performed for hundreds of genes simultaneously in the case of low density arrays. A second approach is the hybridization microarray. A single array or "chip" may contain probes to determine transcript levels for every known gene in the genome of one or more organisms. Alternatively, "tag based" technologies like Serial analysis of gene expression (SAGE) and RNA Seq, which can provide a relative measure of the cellular concentration of different mRNAs, can be used. An advantage of tag based methods is the "open architecture", allowing for the exact measurement of any transcript, with a known or unknown sequence. Next generation sequencing (NGS) such as RNA Seq is another approach, producing vast quantities of sequence data that can be matched to a reference genome. Although NGS is comparatively time consuming, expensive, and resource intensive, it can identify single nucleotide polymorphisms, splice variants, and novel genes, and can also be used to profile expression in organisms for which little or no sequence information is available.

РНК-ның профильдері

Осы сияқты профильдер Уикипедияда тізімделген барлық ақуыздар үшін дерлік табылады. Оларды Novartis Research Foundation Genomics Institute және European Bioinformatics Institute сияқты ұйымдар жасап шығарады. Қосымша ақпаратты олардың дерекқорларын іздеу арқылы алуға болады (мысалы, осында суреттелген GLUT4 транспортері үшін цитатаны қараңыз). Бұл профильдер белгілі бір тіндегі белгілі бір ақуыздың ДНК экспрессиясының деңгейін (соның салдарынан өндірілген РНК мөлшерін) көрсетеді және әрбір Уикипедия бетінің оң жағындағы Ақуыз қорабындағы суреттерде тиісті түстермен белгіленеді.

Белоктарды өлшеу

Белсенді кодтайтын гендер үшін экспрессия деңгейін бірнеше әдістермен тікелей бағалауға болады, бұл мРНК санын анықтау әдістерімен айқын ұқсастығы бар. Ең көп қолданылатын әдістердің бірі – қызығушылық тудыратын белокқа қарсы вестерн блот жасау. Бұл белоктың мөлшерімен қатар, оның танылуы туралы да ақпарат береді. Үлгі (көбінесе жасушалық лизат) полиакриламид гельде бөлінеді, мембранаға көшіріледі, содан кейін қызығушылық тудыратын белокқа қарсы антиденемен зерттеледі. Антидене бейнелеу және/немесе сандық өлшеу үшін флуоресценттік затпен немесе ақшаян пероксидазасымен байланыстырылуы мүмкін. Бұл әдістің гельге негізделгендігі сандық өлшеудің дәлдігін төмендетсе де, белоктағы кейінгі өзгерістерді, мысалы, протеолиз немесе убиквитинацияны, оның мөлшерінің өзгеруі арқылы анықтау мүмкіндігін ұсынады.

mРНК- ақуыздық кореляция

Транскрипция гендік экспрессияны тікелей көрсетеді, бірақ мРНК молекулаларының саны мРНК-дан аударылған ақуыз молекулаларының санымен тікелей байланысты емес. Ақуыз бен мРНК-ның екеуін де өлшеу осы екі деңгейдің өзара байланысын анықтауға мүмкіндік береді. Гендік экспрессияның кез келген сатысындағы реттеу, аударманың реттелуі сияқты, осы байланысқа әсер етуі мүмкін. Сонымен қатар, жоғары поляризацияланған жасушалардағы ақуыз тасымалы сияқты пост-трансляциялық факторлар да өлшенген мРНК-ақуыз байланысына әсер етуі мүмкін.

Жергілікті жер

Экспрессияны талдау сандық өлшеумен ғана шектелмейді; локализациясын да анықтауға болады. mRNA-ны тиісті белгісі бар толықтырғыш mRNA-ның тізбегі арқылы анықтауға болады, ал белокты белгіленген антиденелер арқылы анықтауға болады. Зерттелген үлгіде mRNA немесе белоктың қайда орналасқанын анықтау үшін микроскоппен қаралады. Генді жасыл флуоресцентті белок маркеріне немесе осыған ұқсас жаңа нұсқаға ауыстыру арқылы тірі жасушаларда экспрессияны тікелей өлшеуге болады. Бұл флуоресценттік микроскоп арқылы бейнелеу арқылы жүзеге асырылады. ГФП-ге біріктірілген белокты геномдағы оның табиғи орнына экспрессия деңгейіне әсер етпей клондау өте қиын, сондықтан бұл әдіс эндогендік ген экспрессиясын өлшеу үшін көбінесе қолданылмайды. Дегенмен, ол жасанды түрде жасушаға енгізілген геннің экспрессиясын өлшеу үшін кеңінен қолданылады, мысалы экспрессиялық вектор арқылы. Нысаналы белокты флуоресцентті репортермен біріктіру арқылы белоктың мінез-құлқы, оның ішінде жасушалық локализациясы және экспрессия деңгейі айтарлықтай өзгеруі мүмкін. Ферментке байланысты иммуносорбциялық талдау микротитрлік пластинада бекітілген антиденелерді пайдалану арқылы үлгідегі қызығушылық тудыратын ақуыздарды ұстау үшін жұмыс істейді. Фермент немесе флюороформен байланыстырылған антиденені қолдану арқылы байланысқан ақуыздың мөлшерін флуорометриялық немесе колориметриялық әдіспен дәл өлшеуге болады. Анықтау процесі Вестерн блотқа өте ұқсас, бірақ гельдік қадамдардан аулақ болу арқасында дәлірек сандық өлшемдерге қол жеткізуге болады.

Көрініс беру жүйесі

Экспрессиялық жүйе – қалаулы ген өнімін өндіруге арналған, арнайы жасалған жүйе. Бұл әдетте ақуыз, бірақ РНК да болуы мүмкін, мысалы, тРНК немесе рибозим. Экспрессиялық жүйе ДНК-мен кодталған геннен және ДНК-ны мРНК-ға транскрипциялауға, ал мРНК-ны қолданылатын реагенттер арқылы ақуызға аударуға қажетті молекулалық механизмдерден тұрады. Ең кең мағынасында, бұл тірі жасушаның кез келгенін қамтиды, бірақ бұл термин көбінесе зертханалық құрал ретінде экспрессияға қатысты қолданылады. Сондықтан экспрессиялық жүйе көбінесе бір жағынан жасанды болып табылады. Дегенмен, экспрессиялық жүйелер – бұл табиғи процесс. Вирустар – вирустық ақуыздар мен геномды өндіру үшін жақын жасушаны экспрессиялық жүйе ретінде пайдаланатын, тамаша мысал.

Индукцияланатын өрнегі

Доксициклин сонымен қатар, организмдер мен жасуша мәдениеттерінде трансгендік экспрессияны реттеу үшін тетрациклинмен бақыланатын "Tet on" және "Tet off" транскрипциялық активацияда қолданылады.

Табиғатта

Осы биологиялық құралдармен қатар, ДНК-ның табиғатта кездесетін белгілі бір конфигурациялары (гендер, промоторлар, күшейткіштер, репрессорлар) және олармен байланысты механизмдер экспрессия жүйесі деп аталады. Бұл термин әдетте ген немесе гендер жиынтығы белгілі бір жағдайларда қосылған кезде қолданылады, мысалы, Ламбда фагындағы қарапайым репрессорлық коммутациялық экспрессия жүйесі және бактериялардағы лак оператор жүйесі. Көптеген табиғи экспрессия жүйелері тікелей қолданылады немесе өзгертіліп, Tet on және Tet off экспрессия жүйесі сияқты жасанды экспрессия жүйелері үшін пайдаланылады.

Гендік желілер

Гендер кейде желідегі түйіндер ретінде қарастырылады, олардың кірістері – транскрипция факторлары сияқты ақуыздар, ал шығыстары – гендік экспрессия деңгейі. Түйіннің өзі функцияны атқарады, ал осы функциялардың жұмысы жасушалар ішіндегі белгілі бір ақпаратты өңдеуді жүзеге асырып, жасушалық мінез-құлықты анықтайды деп түсіндіріледі. Гендік желілерді нақты себептік модельді құрмай-ақ жасауға болады. Мұндай жағдай көбінесе үлкен экспрессиялық деректер жиынтығынан желілерді құрастыру кезінде туындайды. Көптеген жағдайлар мен өлшемдердің үлкен үлгісінде (әдетте транскриптомдық немесе протеомдық деректер) экспрессияның ковариациясы және корреляциясы есептеледі. Өзгергіштіктің көзі эксперименттік немесе табиғи (бақылау) болуы мүмкін. Гендік экспрессия желілерін құрудың бірнеше тәсілі бар, бірақ ең көп қолданылатыны – жағдайлар, уақыт нүктелері немесе жеке тұлғалар бойынша экспрессияның барлық жұптық корреляцияларының матрицасын есептеу және осы матрицаны (белгілі бір шекті мәннен жоғары мәндерді алып тастағаннан кейін) графикалық түрде бейнелеу болып табылады, онда түйіндер гендерді, транскрипттерді немесе ақуыздарды, ал түйіндерді байланыстыратын сызықтар осылардың арасындағы байланыстың күшін көрсетеді (GeneNetwork GeneNetwork 2 қараңыз).