Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
ДНК-мен байланысатын протеин
DNA binding protein
Лактоза репрессоры (LacI) – бактерияларда лактоза метаболизміне қатысатын белоктарды кодтайтын гендердің экспрессиясын тежейтін ДНК-мен байланысатын протеин. Лактоза клеткаға қолжетімді болмағанда бұл гендер өшіріледі, осылайша бактерия лактоза болған кезде ғана оны қабылдау және пайдалану үшін қажетті механизмдерді өндіруге энергия жұмсайды. Лактоза қолжетімді болғанда, ол ең алдымен бактериялардағы β-галактозидаза (lacZ) арқылы аллолактозаға айналады. Аллолактозамен байланысқан лактоза репрессорының ДНК-мен байланысу қабілеті аллостерикалық реттеу нәтижесінде төмендейді, соның салдарынан лактозаны қабылдау және пайдалануға қатысатын белоктарды кодтайтын гендер экспрессиялана алады.
The lac repressor (LacI) is a DNA binding protein that inhibits the expression of genes coding for proteins involved in the metabolism of lactose in bacteria. These genes are repressed when lactose is not available to the cell, ensuring that the bacterium only invests energy in the production of machinery necessary for uptake and utilization of lactose when lactose is present. When lactose becomes available, it is firstly converted into allolactose by β Galactosidase (lacZ) in bacteria. The DNA binding ability of lac repressor bound with allolactose is inhibited due to allosteric regulation, thereby genes coding for proteins involved in lactose uptake and utilization can be expressed.
Функция
Лак репрессоры (LacI) ДНК-мен байланысу доменіндегі спираль-бұрылыс-спираль мотиві арқылы жұмыс істейді, лак оперонының оператор аймағының негізгі ойығына негіздерді байланыстырады, сондай-ақ симметриялық альфа-спиральдердің қалдықтарымен, "ілмек" спиральдерімен базалық контактілер жасайды, олар кіші ойыққа терең еніп байланысады. Бұл байланысқан репрессор РНК полимеразаның байланысу орнын жауып қою арқылы немесе ДНК-ның иілуін қозғау арқылы Лак ақуыздарының транскрипциясын төмендете алады. Лактоза қатысқанда, аллолактоза лак репрессорымен байланысып, оның пішінінде аллостериялық өзгеріске алып келеді. Өзгерген күйінде лак репрессоры өзінің сай операторымен берік байланыса алмайды. Осылайша, ген индуктордың болмағанда көбінесе өшіріледі және индуктордың болғанда көбінесе қосылады, бірақ ген экспрессиясының деңгейі клеткадағы репрессорлардың санына және репрессордың ДНК-ға байланысу туыстығына байланысты. Изопропил β D 1 тиогалактопиранозид (IPTG) – лак репрессорымен реттелетін гендердің транскрипциясын индукциялау үшін қолданылатын кең таралған аллолактоза аналогы.
The lac repressor (LacI) operates by a helix turn helix motif in its DNA binding domain, binding base specifically to the major groove of the operator region of the lac operon, with base contacts also made by residues of symmetry related alpha helices, the "hinge" helices, which bind deeply in the minor groove. This bound repressor can reduce transcription of the Lac proteins by occluding the RNA polymerase binding site or by prompting DNA looping. When lactose is present, allolactose binds to the lac repressor, causing an allosteric change in its shape. In its changed state, the lac repressor is unable to bind tightly to its cognate operator. Thus, the gene is mostly off in the absence of inducer and mostly on in the presence of inducer, although the degree of gene expression depends on the number of repressors in the cell and on the repressor's DNA binding affinity. Isopropyl β D 1 thiogalactopyranoside (IPTG) is a commonly used allolactose mimic which can be used to induce transcription of genes being regulated by lac repressor.
ДНҚ-ның байланысу және ажырасу кинетикасы
ЛакИ оператор ДНК-сын таңғаларлық жылдам табады. In vitro іздеу, үш өлшемді (3D) диффузия арқылы бір-бірін іздейтін екі бөлшектің теориялық жоғарғы шегінен 10-100 есе жылдам. Осы жылдам іздеуді түсіндіру үшін LacI және басқа транскрипция факторларының (ТФ) байланыс орындарын жеңілдетілген диффузия арқылы табатыны болжалды – бұл 3D-дегі еркін диффузия мен ДНК-дағы 1D-дегі сырғанаудың комбинациясы. Сырғанау кезінде репрессор ДНК спиралімен жанасып, оның үлкен ойығын іздеп, сызып жүреді. Бұл ТФ операторға бүйірден сырғанап кіргенде нысананың ұзындығын ұзартып, іздеу процесін жылдамдатады. E. coli жасушаларымен жүргізілген in vivo бір молекулалық эксперименттер жеңілдетілген диффузия модельін сынап, растады. Нәтижесінде, ТФ әр сырғанау кезінде орташа есеппен 45 базалық жұпты (bp) сканерлейді, содан кейін ТФ өздігінен ажырап, геномды 3D кеңістікте зерттеуді қайта бастайды. In vivo және in vitro эксперименттер ДНК тізбегіне байланысты операторды тану ықтималдығы өзгеретінін көрсетті, ал ТФ оператордағы байланысқан күйде қалу уақыты тізбек өзгергенде аз өзгереді. ТФ көбінесе реттеуге тиіс тізбектен шығып кетеді, бірақ күшті нысаналық орында ол қайтадан жол табу үшін өте қысқа қашықтыққа ғана жүреді. Макроскопиялық деңгейде бұл тұрақты өзара әрекеттесу сияқты көрінеді. Осы байланыс механизмі ДНК-мен байланысатын белоктардың шын нысанаға ұқсайтын тізбектерде ұзақ уақыт тоқтап қалмай, жасуша геномын жылдам іздеуін қалай жүзеге асыратынын түсіндіреді. Барлық атомдық молекулалық динамикалық модельдеу транскрипция факторының сырғанау кезінде 1 kBT, ал диссоциация кезінде 12 kBT тосқауылдарына тап болатынын көрсетті, яғни репрессор диссоциацияланғанға дейін орташа есеппен 8 bp-ға сырғанады. Лак репрессорының in vivo іздеу моделі сегменттер арасындағы ауысуды, секіруді және басқа белоктардың тығыздығын қамтиды, бұл E. coli жасушаларындағы геномды репрессор үшін аз қолжетімді етеді. Протеиннің ДНК-ның үлкен ойығынан шығып, ДНК тізбегі бойымен жақын ойыққа түсуі – секірудің болуы in vitro жағдайында тікелей дәлелденді, онда лак репрессор операторларды айналып өтуі, бағытын өзгертуі және ДНК-ның 10,5 bp периодынан ұзақ питчпен қозғалуы байқалды.
LacI finds its target operator DNA surprisingly fast. In vitro the search is 10 100 times faster than the theoretical upper limit for two particles searching for each other via diffusion in three dimensions (3D). To explain the fast search, it was hypothesized that LacI and other transcription factors (TFs) find their binding sites by facilitated diffusion, a combination of free diffusion in 3D and 1D sliding on the DNA. During sliding the repressor is in contact with the DNA helix, sliding around and tracking its major groove, which speeds up the search process by extending the target length when the TF slides in onto the operator from the side. In vivo single molecule experiments with E. coli cells have now tested and verified the facilitated diffusion model, and shown that the TF scans on average 45 bp during each sliding event, before the TF detaches spontaneously and resumes exploring the genome in 3D. In vivo and in vitro experiments have shown that it is this probability to recognize the operator that changes with DNA sequence, while the time the TF remains in the bound conformation on the operator changes less with sequence. The TF often leaves the sequence it is intended to regulate, but at a strong target site, it almost always make a very short journey before finding the way back again. On the macroscopic scale, this looks like a stable interaction. This binding mechanism explains how DNA binding proteins manage to quickly search through the genome of the cell without getting stuck too long at sequences that resemble the true target. An all atom molecular dynamics simulation suggests that the transcription factor encounters a barrier of 1 kBT during sliding and 12 kBT for dissociation, implying that the repressor will slide over 8 bp on average before dissociating. The in vivo search model for the lac repressor includes intersegment transfer and hopping as well as crowding by other proteins which make the genome in E. coli cells less accessible for the repressor. The existence of hopping, where the protein slips out of the major groove of DNA to land in another nearby groove along the DNA chain, has been proven more directly in vitro, where the lac repressor has been observed to bypass operators, flip orientation, and rotate with a longer pitch than the 10.5 bp period of DNA while moving along it.
Ашылу
Лак репрессорды алғаш рет Уолтер Гилберт пен Бенно Мюллер Хилл 1966 жылы бөліп алды. Олар in vitro жағдайында ақуыздың лактоза операторын құрайтын ДНК-ға байланысатынын, ал IPTG (аллолактозаның аналогы) қосылғанда ДНК-ны босататынын көрсетті.
The lac repressor was first isolated by Walter Gilbert and Benno Müller Hill in 1966. They showed that in vitro the protein bound to DNA containing the lac operon, and it released the DNA when IPTG (an analog of allolactose) was added.