Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
ДНК талдау техникасы
DNA analysis technique
Оңтүстік блот – ДНК үлгілеріндегі белгілі бір ДНК тізбектерін анықтау және олардың мөлшерін бағалау үшін қолданылатын әдіс. Бұл әдіс молекулалық биологияда қолданылады. Айта кетейік, биологиялық үлгіден (мысалы, қан немесе тінден) алынған ДНК шектеу ферменттерімен кесіледі, содан кейін пайда болған ДНК фрагменттері электр тогының көмегімен гель немесе матрица сияқты сүзуге ұқсас орта арқылы бөлінеді, бұл кіші фрагменттердің үлкендеріне қарағанда жылдам қозғалуын қамтамасыз етеді. ДНК фрагменттері гельден немесе матрицадан қатты мембранаға көшіріледі, содан кейін радиоактивті, флуоресцентті немесе химиялық маркерленген ДНК зондымен әрекеттестіріледі. Бұл маркер ДНК зондының тізбегімен толық сәйкес келетін ДНК фрагменттерін Оңтүстік блот ішінде көруге мүмкіндік береді. Оңтүстік блоттинг – электрофорез арқылы бөлінген ДНК фрагменттерін «блоттинг» деп аталатын процесте сүзгі мембранасына көшіру және одан кейін зондты гибридтеу арқылы фрагменттерді анықтаудың үйлесімі. Бұл әдіс 1975 жылы алғаш рет жариялаған британдық биолог Эдвин Саузернның есімімен аталған. Кейіннен РНК немесе ақуызды пайдаланатын, бірақ ұқсас принциптерге негізделген басқа блоттинг әдістері (мысалы, батыс блот, солтүстік блот, шығыс блот, оңтүстік-батыс блот) Саузернның атына сәйкес компастың бағыттарымен аталды. Маркер атаулы болғандықтан, «Оңтүстік» сөзі, есімдер сияқты, үлкен әріппен жазылады. Басқа блоттинг әдістерінің атаулары да осы принципке сәйкес болуы мүмкін.
Southern blot is a method used for detection and quantification of a specific DNA sequence in DNA samples. This method is used in molecular biology. Briefly, purified DNA from a biological sample (such as blood or tissue) is digested with restriction enzymes, and the resulting DNA fragments are separated by using an electric current to move them through a sieve like gel or matrix, which allows smaller fragments to move faster than larger fragments. The DNA fragments are transferred out of the gel or matrix onto a solid membrane, which is then exposed to a DNA probe labeled with a radioactive, fluorescent, or chemical tag. The tag allows any DNA fragments containing complementary sequences with the DNA probe sequence to be visualized within the Southern blot. The Southern blotting combines the transfer of electrophoresis separated DNA fragments to a filter membrane in a process called blotting, and the subsequent fragment detection by probe hybridization. The method is named after the British biologist Edwin Southern, who first published it in 1975. Other blotting methods (i. e., western blot, northern blot, eastern blot, southwestern blot) that employ similar principles, but using RNA or protein, have later been named for compass directions as a sort of pun from Southern's name. As the label is eponymous, Southern is capitalized, as is conventional of proper nouns. The names for other blotting methods may follow this convention, by analogy.
Тарих
Оңтүстік үш жаңалықты біріктіргеннен кейін Оңтүстік блотын ойлап тапты, біріншісі – Джонс Хопкинс университетінде Том Келли мен Гамильтон Смит әзірлеген шектеу эндонуклеазалары, олар ДНК-ны белгілі бір тізбекте кесу үшін қолданылады. Кеннет пен Норин Мюррей осы әдісті «Оңтүстік блоты» деп атады. Екінші жаңалық – ДНК, РНК немесе ақуыз қоспаларын молекулалық мөлшері бойынша бөлуге негізделген гельдік электрофорез, оны 1971 жылы Джонс Хопкинс университетінде Дэниел Натанс пен Кэтлин Данна да әзірлеген. Үшінші жаңалық – Фредерик Сангердің РНК молекулаларын DEAE қағазына көшіру әдісі. Оңтүстік блоты 1973 жылы ойлап табылды, бірақ 1975 жылға дейін жарияланбады. Кейінірек жарияланғанымен, бұл әдіс Оңтүстіктің Колд Спринг Харбор зертханасындағы Майкл Мэтьюз деген ғалымға Оңтүстік блоты техникасын қағазға сурет салу арқылы көрсеткеннен кейін кеңінен тарады.
Southern invented Southern blot after combining three innovations, the first one is the restriction endonucleases which were developed at Johns Hopkins University by Tom Kelly and Hamilton Smith, those restriction endonucleases are used to cut the DNA at a specific sequence. Kenneth and Noreen Murray introduced this technique as Southern. The second innovation is the gel electrophoresis that based on separation of mixtures of DNA, RNA, or proteins according to molecular size, which was also developed at Johns Hopkins University by Daniel Nathans and Kathleen Danna in 1971. The third innovation is blotting through methods which was developed by Frederick Sanger, when he transferred RNA molecules to DEAE paper. Southern blot was invented in 1973 but it was not published until 1975. Although it was published later the technique was disseminated when Southern introduced the Southern blot technique to a scientist at Cold Spring Harbor Laboratory called Michael Mathews by drawing this technique on a paper.
Әдіс
Геномдық ДНҚ бір немесе бірнеше шектеу ферменттерімен қорытылады, содан кейін ДНҚ фрагменттері гельдік электрофорез арқылы мөлшері бойынша бөлінеді. ДНК фрагменттері нейлон немесе нитроцеллюлоза мембранасына көшірілмес бұрын, олар алдымен сілтілік өңдеу арқылы денатурацияланады. ДНҚ оқшаулау: Зерттелетін ДНҚ әртүрлі тіндерден оқшауланады. ДНҚ-ның ең қолайлы көзі – қан ұлпасы. Дегенмен, оны әртүрлі тіндерден (шаш, сперма, сілекей және т.б.) оқшаулауға болады. ДНҚ қорытылуы: Шектеу эндонуклеаздары жоғары молекулалық ДНҚ жіптерін кішірек фрагменттерге кесу үшін қолданылады. Бұл қажетті мөлшерде ДНҚ қосып, оны қолданылатын зондқа және ДНҚ-ның күрделілігіне қарай өзгертуге болады, содан кейін шектеу ферментімен, фермент буферімен және тазартылған сумен бірге реакцияны 37°C температурада бір түнге инкубациялау арқылы жүзеге асырылады. Гельдік электрофорез: ДНҚ фрагменттері агароз гельінде электрофорез арқылы мөлшері бойынша бөлінеді. Егер ДНҚ фрагменттерінің кейбіреуі 15 кб-дан үлкен болса, онда гельді көшіруден бұрын, мысалы, сұйылтылған HCl сияқты қышқылмен өңдеуге болады. Бұл ДНҚ фрагменттерін депуринациялап, ДНК-ны кішірек бөліктерге бөледі, осылайша гельден мембранаға тиімдірек көшіруге мүмкіндік береді. Денатурациялау: Егер сілтілік көшіру әдістері қолданылса, ДНҚ гелі қос жіпті ДНҚ-ны денатурациялау үшін сілтілік ерітіндіге (әдетте натрий гидроксидін қамтиды) салынады. Сілтілік ортада денатурациялау ДНҚ-ның теріс зарядталған тимин қалдықтарының мембрананың оң зарядталған амино топтарымен байланысуын жақсартады, оны жеке ДНҚ жіптеріне бөліп, кейіннен зондқа гибридтеу үшін (төменде қараңыз) дайындайды және ДНҚ-да әлі де болуы мүмкін қалдық РНҚ-ны жояды. Алайда, сілтілік әдістерді бейтарап әдістерге қарағанда таңдау көбінесе эмпирикалық болып табылады және бірдей нәтижелерге әкелуі мүмкін. Көшіру (Блоттинг): Гельдің үстіне (немесе астына, көшіру бағытына байланысты) нитроцеллюлоза (немесе, мүмкін, нейлон) мембранасы қойылады. Гельге тұрақты түрде қысым жасалады (сору арқылы немесе гель мен мембрананың үстіне қағаз сүлгілер мен салмақ қою арқылы), гель мен мембрананың жақсы және біркелкі байланысын қамтамасыз ету үшін. Егер сору арқылы көшіргенде, 20X SSC буфері гельдің жабысуын қамтамасыз ету және кептіруін болдырмау үшін қолданылады. Судың жоғары потенциалы бар аймақтан судың төмен потенциалы бар аймаққа (әдетте сүзгі қағаз және қағаз маталары) капиллярлық әрекет арқылы буферлік көшіру ДНҚ-ны гельден мембранаға жылжыту үшін қолданылады; ион алмасу өзара әрекеттесулері ДНҚ-ның теріс заряды және мембрананың оң зарядының әсерінен ДНҚ-ны мембранаға байланыстырады. ДНҚ фрагменттерін қатты мембранаға көшіру үшін бес әдіс қолданылуы мүмкін: Гибридтеудің ерекшелігін азайту арқылы басқа түрлерде немесе геномда ұқсас тізбектерді табуға болады. Жеке тұлғаны анықтау үшін саусақ іздерін алу және ауруды диагностикалау үшін қолданылуы мүмкін.
The genomic DNA is digested with either one or more than one restriction enzyme, then the DNA fragments are size fractionated by gel electrophoresis. Before the DNA fragments are transferred to a solid membrane which is either nylon or nitrocellulose membrane it is first denatured by alkaline treatment. DNA Isolation: The DNA to be studied is isolated from various tissues. The most suitable source of DNA is known as blood tissue. However, it can be isolated from different tissues (hair, semen, saliva, etc.). DNA digestion: Restriction endonucleases are used to cut high molecular weight DNA strands into smaller fragments. This is done by adding the desired amount of DNA which can be changed according to the probe used and the intricacy of the DNA, with the restriction enzyme, enzyme buffer and purified water then incubate the reaction at 37 °C overnight. Gel electrophoresis: The DNA fragments are then electrophoresed on an agarose gel to separate them by size. If some of the DNA fragments are larger than 15 kb, then before blotting, the gel may be treated with an acid, such as dilute HCl. This depurinates the DNA fragments, breaking the DNA into smaller pieces, thereby allowing more efficient transfer from the gel to membrane. Denaturation: If alkaline transfer methods are used, the DNA gel is placed into an alkaline solution (typically containing sodium hydroxide) to denature the double stranded DNA. The denaturation in an alkaline environment may improve binding of the negatively charged thymine residues of DNA to a positively charged amino groups of membrane, separating it into single DNA strands for later hybridization to the probe (see below), and destroys any residual RNA that may still be present in the DNA. The choice of alkaline over neutral transfer methods, however, is often empirical and may result in equivalent results. Blotting: A sheet of nitrocellulose (or, alternatively, nylon) membrane is placed on top of (or below, depending on the direction of the transfer) the gel. Pressure is applied constantly to the gel (either using suction, or by placing a stack of paper towels and a weight on top of the membrane and gel), to ensure good and even contact between gel and membrane. If transferring by suction, 20X SSC buffer is used to ensure a seal and prevent drying of the gel. Buffer transfer by capillary action from a region of high water potential to a region of low water potential (usually filter paper and paper tissues) is then used to move the DNA from the gel onto the membrane; ion exchange interactions bind the DNA to the membrane due to the negative charge of the DNA and positive charge of the membrane. Five methods can be used to transfer DNA fragments to the solid membrane and they are:
Can be used to find similar sequences in other species or in the genome by decreasing the specificity of hybridization. Can be used in personal identification through fingerprinting, and in disease diagnosis.
Шектеулер
Басқа сынақтармен салыстырғанда, оңтүстік блот – бірнеше қадамнан тұратын күрделі техника, және осы қадамдарға қымбат жабдықтар мен реагенттер қажет. Жоғары сапалы және көп мөлшерде ДНК талап етіледі. Оңтүстік блот – уақытты көп алатын әдіс, және ол ДНК-ның мөлшерін ғана шамамен анықтай алады, себебі бұл жартылай сандық әдіс. Оны базалық жұптар деңгейіндегі мутацияларды анықтау үшін пайдалануға болмайды.
Compared to other tests, southern blot is a complex technique that has multiple steps and these steps require equipment and reagents that are expensive. High quality and large amounts of DNA are needed. Southern blot is a time consuming method and can only estimate the size of the DNA since it is a semi quantitative method. It cannot be used to detect mutations at base pair level.