Кіріспе

ДНҚ-ның 2–13 негіздік жұптарының қайталама тізбектері, ДНҚ тізбегі.

Микросателлит – белгілі бір ДНҚ мотивтерінің (ұзындығы бірден алты немесе одан да көп негіздік жұпқа дейін) әдетте 5–50 рет қайталануымен сипатталатын қайталама ДНҚ учаскесі. Микросателлиттер организм геномында мыңдаған жерде кездеседі. Олардың мутация деңгейі ДНҚ-ның басқа аймақтарына қарағанда жоғары. Микросателлиттердің ұзын туыстары – минисателлиттер бірге ВНТР (айнымалы тандемді қайталаулар) ДНҚ деп жіктеледі. "Спутник" ДНҚ атауы геномдық ДНҚ-ны сынақ түтігінде центрифугалау кезінде ірі көлемді ДНҚ-ның бөлінуімен, сондай-ақ қайталама ДНҚ-ның "спутник" қабаттарының пайда болуымен байланысты алғашқы байқауға сілтеме жасайды. Олар ДНҚ профильдеуінде, қатерлі ісіктерді диагностикалауда, туыстық байланысты анықтауда (әсіресе әкелік тексеруде) және сот-медициналық саралауда кеңінен қолданылады. Сонымен қатар, олар белгілі бір қасиетке немесе ауруға жауапты генді немесе мутацияны анықтау үшін генетикалық байланыс талдауында қолданылады. Микросателлиттер популяциялық генетикада түрлердің топтары мен жеке тұлғалар арасындағы туыстық байланыс деңгейін өлшеу үшін де пайдаланылады.

Тарих

Алғашқы микроспутникті 1984 жылы Лестер университетінде Веллер, Джеффрис және олардың әріптестері адам миоглобині геніндегі полиморфты GGAT қайталануы ретінде сипаттағанмен, "микроспутник" термині кейін, 1989 жылы Литт пен Люти енгізді. Мысалы, адам геномында 50 000–100 000 динуклеотидтік микроспутниктер және одан аз сандағы три-, тетра- және пентануклеотидтік микроспутниктер бар. Олардың көптегені адам геномының кодталмаған бөліктерінде орналасқан, сондықтан ақуыздарды өндірмейді, бірақ реттеуші және кодтау аймақтарында да кездесуі мүмкін. Кодталмаған аймақтардағы микроспутниктердің нақты функциясы болмауы мүмкін, сондықтан оларға табиғи іріктеу әсер етпейді; бұл оларға ұрпақтар бойында мутацияларды жинақтауға мүмкіндік береді және ДНК саусақ іздері мен идентификация мақсатында қолданылатын өзгергіштікті тудырады. Басқа микроспутниктер гендердің фланкингтік немесе интрондық аймақтарында немесе тікелей гендердің кодондарында орналасқан. Мұндай жағдайларда микроспутниктердегі мутациялар фенотиптік өзгерістерге және ауруларға, әсіресе Х-хромосомаға байланысты әйелдердегі зиякерлік кемістік және Хантингтон ауруы сияқты үштік қайталану ауруларына әкелуі мүмкін. Теломерлер омыртқалы жануарлардағы TTAGGG гексануклеотидтік қайталану мотивінен тұратын қайталанатын ДНК-дан тұрады. Осылайша, олар миниспутниктер деп жіктеледі. Сол сияқты, жәндіктердің теломерлеріндегі қайталану мотивтері қысқарақ, оларды микроспутниктер деп санауға болады.

Мутация механизмдері мен мутация жылдамдығы

Бір ғана нуклеотидке әсер ететін нүктелік мутациялардан өзгеше, микросателлиттік мутациялар бүкіл қайталану бірлігінің жоғалуына немесе пайда болуына, кейде бірден екі немесе одан да көп қайталанудың өзгеруіне алып келеді. Сондықтан, микросателлиттік локустардағы мутация деңгейінің, базалық алмасу сияқты басқа мутация деңгейлерінен өзгеше болуы күтіледі. Микросателлиттік локустардағы мутация жылдамдығы қайталану мотивінің тізбегіне, қайталанатын мотивтік бірліктердің санына және канондық қайталану тізбегінің тазалығына байланысты. Микросателлиттік локустардың мутациялану механизмдерінің әртүрлі түрлері қарастырылды және олардың тудырған полиморфтық сипаттары сандық тұрғыдан бағаланды. Микросателлиттердегі мутацияның нақты себебі күрес жүріп жатыр. Мұндай ұзындық өзгерісінің бір себебі – мейоз кезінде ДНҚ тізбектерінің сәйкес келмейтініне байланысты туындайтын репликацияның қабынуы. Репликация кезінде ДНҚ-ны оқуға жауапты фермент – ДНҚ полимеразасы, матрицалық тізбек бойымен жылжығанда қабынуы мүмкін және бұрыс нуклеотидке өтуі мүмкін. ДНҚ полимеразасының қабынуы қайталанатын тізбек (мысалы, CGCGCG) көбейтілгенде жиірек болады. Микросателлиттер осындай қайталанатын тізбектерден тұратындықтан, ДНҚ полимеразасы осы тізбек аймақтарында қателерді жоғары деңгейде жасауы мүмкін. Көптеген зерттеулер қабынудың микросателлиттік мутациялардың себебі екенін көрсетеді. Әдетте, әрбір микросателлитте қабыну 1000 ұрпақ сайын шамамен бір рет болады. Осылайша, қайталанатын ДНҚ-дағы қабынуға байланысты өзгерістер геномның басқа бөліктеріндегі нүктелік мутациялардан үш есе көп кездеседі. Көптеген жағдайларда қабыну тек бір қайталану бірлігінің өзгеруіне әкеледі, ал қабыну деңгейі әртүрлі аллель ұзындықтары мен қайталану бірліктерінің мөлшеріне және түрлер арасында әртүрлі болады. Егер жеке аллельдер арасында үлкен айырмашылық болса, онда мейоз кезінде рекомбинация кезінде тұрақсыздық күшеюі мүмкін.

Микроспутниктердегі мутациялар

Көптеген организмдерде, жәндіктерден адамға дейін микросаттелиттердегі мутация деңгейі тікелей бағаланды. Шөл шегірткесі Schistocerca gregaria-да микросаттелиттердегі мутация жылдамдығы локусқа қатысты бір ұрпаққа 2,1 × 10−4 деп есептелді. Адамның еркек гермдық жасушаларындағы микросаттелиттердегі мутация деңгейі әйел гермдық жасушаларына қарағанда бес-алты есе жоғары және бір гаметаға, бір локусқа шаққанда бір ұрпаққа 0-ден 7 × 10−3 аралығында ауыспайды. Микросаттелиттердегі мутация деңгейі микросаттелитке қатысты базалық орнына, қайталану типіне және базалық сәйкестігіне байланысты өзгереді, әсіресе аллельдер арасындағы ұзындық айырмашылығы зор болғанда. Бұл, мейоз кезінде тұрақсыздық тудыратын, тең емес қолдары бар гомологтық хромосомаларға байланысты болуы мүмкін.

Микроспутниктік мутацияның биологиялық әсерлері

Көптеген микроспутниктер кодталмаған ДНК-да орналасқан және биологиялық жағынан белсенді емес. Басқалары реттегіш немесе тіпті кодтау ДНК-да орналасқан – мұндай жағдайларда микроспутниктік мутациялар фенотиптік өзгерістерге және ауруларға алып келуі мүмкін. Геномдық зерттеу микроспутниктік вариацияның адамдардағы мұраға берілетін гендік экспрессия вариациясының 10–15% құрайтынын көрсетеді. Геномның ақуызды кодтайтын бөліктеріндегі қысқа тізбек қайталауларының көпшілігі үш нуклеотидтен тұрады, себебі мутация кезінде бұл ұзындық кадрдың ығысуына себеп болмайды. Әр тринуклеотидтік қайталанатын тізбек бірдей аминқышқылынан тұратын қайталанатын тізбекке транскрипцияланады. Ашытқыларда ең көп кездесетін қайталанатын аминқышқылы – глутамин, глутамин қышқылы, аспарагин, аспартик қышқыл және серин. Осы қайталанатын сегменттердегі мутациялар ақуыздардың физикалық және химиялық қасиеттеріне әсер етуі мүмкін, нәтижесінде ақуыздың әрекетіндегі біртіндеп және болжамды өзгерістер пайда болуы мүмкін. Мысалы, Runx2 геніндегі тізбектей қайталану аймақтарының ұзындығының өзгеруі үй жануарларындағы иттердің (Canis familiaris) бетінің ұзындығындағы айырмашылықтарға әкеледі, сондай-ақ ұзын тізбек ұзындығы мен ұзын бет арасында байланыс бар. Бұл байланыс Carnivora түрінің кең ауқымына да қатысты. HOXA13 геніндегі полиаланин тракттарының ұзындығының өзгеруі адамдардағы даму бұзылысы – қол-аяқ-жыныс мүшелері синдромымен байланысты. Басқа үштік қайталаулардағы ұзындықтың өзгеруі адамдардағы 40-тан астам неврологиялық аурулармен байланысты, әсіресе тринуклеотидтік қайталау бұзылыстары, мысалы, нәзік Х синдромы және Хантингтон ауруы. Репликациядан болатын қателіктерден туындаған эволюциялық өзгерістер қарапайым организмдерде де кездеседі. Мысалы, микроспутниктік ұзындықтың өзгеруі ашытқының беткі мембраналық ақуыздарында жиі кездеседі, бұл жасуша қасиеттерінің жылдам эволюциясын қамтамасыз етеді. Атап айтқанда, FLO1 геніндегі ұзындықтың өзгеруі субстраттарға жабысу деңгейін реттейді. Қысқа тізбек қайталаулары патогенді бактериялардың беткі ақуыздарындағы жылдам эволюциялық өзгерістерді қамтамасыз етеді; бұл оларға хосттың иммунологиялық өзгерістерімен бірқатар жүруге мүмкіндік береді. Қысқа тізбек қайталауларындағы ұзындықтың өзгеруі саңырауқұлақтың (Neurospora crassa) циркадтық сағат циклдарының ұзақтығын реттейді.

Гендік реттеуге әсері

Промоторлар мен басқа да цис-реттеуші аймақтардағы микросателлиттердің ұзындығының өзгеруі гендік экспрессияны ұрпақтар арасында жылдам өзгерте алады. Адам геномында көптеген (>16 000) қысқа тізбекті қайталаулар бар, олар көптеген гендердің экспрессиясын реттеуге мүмкіндік береді. Бактериялық SSR-лердің ұзындығының өзгеруі Haemophilus influenzae бактериясында фимбриялардың қалыптасуына, промоторлар арасындағы қашықтықты өзгерту арқылы әсер етуі мүмкін. Юинг саркомасында (жас адамдардағы қауынсыз сүйек рагының түрі) бір нүктелік мутация GGAA микросателлитін ұзартады, ол транскрипциялық фактормен байланысады, бұл өз кезегінде ракқа себеп болатын EGR2 генін белсендіреді. Сонымен қатар, басқа GGAA микросателлиттері Юинг саркомасымен ауырған науқастардың клиникалық жағдайын анықтайтын гендердің экспрессиясына да әсер етуі мүмкін.

Интрондардағы әсерлер

Интрондардағы микросатelliттер фенотипке қазіргі уақытта түсінілмейтін механизмдер арқылы да әсер етеді. Мысалы, X25 генінің бірінші интронындағы GAA триплетінің ұзаруы транскрипцияға бөгет қойып, Фридрейх атаксиясын тудырады. Аспарагин синтетазасы генінің бірінші интронындағы тандемдік қайталаулар жедел лимфобласты лейкемиямен байланысты. NOS3 генінің төртінші интронындағы қайталау полиморфизмі Тунис халқындағы гипертониямен байланысты. EGFR геніндегі қайталау ұзындығының азаюы остеосаркомамен байланысты. Зейін балықтарында сақталған ескіше тігіс түрі U2AF2 және басқа тігіс машиналарынсыз интрондарды жою үшін интрондық мРНҚ ішіндегі микросатelliттерді пайдаланатыны белгілі. Бұл тізбектер 3' және 5' интрон тігіс орындарын жақынға әкеліп, шплицеосоманы тиімді түрде алмастыратын өте тұрақты үш жапырақты конфигурация құрайды деп есептеледі. Бұл РНК тігісінің әдісі тетраподтар пайда болған кезде адам эволюциясынан бөлініп, РНК әлемінің артефактісі болып табылады деп саналады.

Транспозондардағы әсерлер

Адам геномының шамамен 50% әртүрлі транспозициялық элементтерде (транспозондар немесе "қозғалмалы гендер" деп те аталады) қамтылған, олардың көпшілігі қайталанатын ДНК-ны құрайды. Осы аймақтардағы қысқа тізбектердің қайталануы гендік экспрессияны реттеуге де қатысуы мүмкін.

Қолданбалар

Микросателлиттер қатерлі ісіктерді диагностикалау кезінде хромосомалық ДНК-ның жоғалуын бағау үшін қолданылады. Микросателлиттер ДНК профильдеу үшін, сондай-ақ "генетикалық саусақ іздері" деп белгілі, қылмыстық істердегі (криминалистикада) және трансплантацияланған пациенттердің тіндерінде кеңінен қолданылады. Олар туыстық байланысты анықтауда (көбінесе әкелік тестілеуде) да жиі пайдаланылады. Сонымен қатар, микросателлиттер геномдағы орналасқан жерлерді іздеуге, әсіресе белгілі бір белгіге немесе ауруға жауапты генді немесе мутацияны анықтау үшін генетикалық байланыс талдауына қолданылады. Геномды іздеудің ерекше жағдайы ретінде, оларды геннің көшірмесін немесе жоғалуын зерттеу үшін де қолдануға болады. Ғалымдар микросателлиттерді популяциялық генетикада және түрлерді сақтау жобаларында пайдаланады. Өсімдік генетиктері өсімдіктерді селекциялау кезінде қажетті белгілерді маркерлік көмекпен іріктеу үшін микросателлиттерді қолдануды ұсынады.

Қатерлі ісік диагнозы

Репликацияны басқаруы бұзылған ісіктік жасушаларда митоздың әрбір айналымында микросаттелиттердің жоғалуы немесе пайда болуы айқын жоғары жиілікпен байқалуы мүмкін. Осылайша, ісіктік жасушалардың желісі қалыпты тіндерден өзгеше генетикалық ізбелгіге ие болуы мүмкін, әсіресе колоректальды қатерлі ісіктерде гетерозиготтылық жоғалуымен көрінеді. Сондықтан бастапқы тіндерде талданатын микросаттелиттер қатерлі ісіктің прогрессиясын бағалау үшін қатерлі ісікті диагностикалауда кеңінен қолданылады. Геномдық ауқымды ассоциация зерттеулері (GWAS) әртүрлі қатерлі ісіктердегі генетикалық бейімділіктің көзі ретінде микросаттелиттердің биомаркерлерін анықтау үшін пайдаланылды.

Сот-медициналық және медициналық саусақ іздерін алу

Микроспутниктік талдау 1990 жылдары сот-медициналық салада кең таралды. Қазіргі таңдағы сот сараптамасында қолданылатын микроспутниктер – тетра немесе пентануклеотидтік қайталамалар, себебі олар жоғары дәлдікпен қатесіз деректерді қамтамасыз етеді, сонымен қатар идеалды емес жағдайларда ыдырауға төтеп беру үшін жеткілікті түрде қысқа. Одан да қысқа қайталама тізбектері ПТР кекеулеуі және басымдықпен амплификациялану сияқты артефакттарға ұшырау ықтималдығы жоғары, ал ұзақ қайталама тізбектері қоршаған ортаның әсерінен көп зардап шегеді және ПТР арқылы нашар амплификацияланады. Сот-медициналық саладағы тағы бір маңызды мәселе – адамның медициналық құпиялылығын сақтау қажеттігі, сондықтан сот-медициналық STR-лер кодтамайтын, гендік реттеуге әсер етпейтін және әдетте тринуклеотидтік STR-лер емес, олар Гентингтон сияқты үштік кеңеюмен байланысты ауруларға қатысты болуы мүмкін. Соттық STR профильдері Ұлыбританияның Ұлттық ДНК деректер базасы (NDNAD), Американың CODIS немесе Австралияның NCIDD сияқты ДНК деректер базаларында сақталады.

Туғандықты талдау (аталық тексеру)

Автосомалық микросаттелиттер туыстық қатынастарды анықтауда ДНК профильдеу үшін кеңінен қолданылады (көбінесе әкелік тексеруде). Әкеден мұраға қалған Y STR (Y хромосомасындағы микросаттелиттер) генеалогиялық ДНК тестілеуде жиі пайдаланылады.

Генетикалық байланысты талдау

1990 жылдары және осы мыңжылдықтың басындағы бірнеше жылдар бойы микросателлиттер геномды кеңінен қарау үшін қолданылатын негізгі генетикалық маркерлер болды. Олар белгілі бір фенотипке немесе ауруға жауапты генді анықтау үшін, тексерілген шежіренің буындары бойынша бөлінуді бақылау арқылы пайдаланылды. Жоғары өнімділік және арзан бір нуклеотидтік полиморфизм (СНП) платформаларының пайда болуы геномды қарау үшін СНП дәуірін бастағанмен, микросателлиттер геномдық вариацияны анықтау үшін маңызды құрал болып қала береді, байланыс және ассоциациялық зерттеулерде қолданылады. Олардың артықшылығы – биаллельді СНП-лардан гөрі жоғары аллельдік әртүрлілікке ие болуы, сондықтан микросателлиттер СНП анықтаған байланыс тепе-теңдігі блогындағы аллельдерді ажырата алады. Осылайша, микросателлиттер 2-ші типті диабет (TCF7L2) және простата қатерлі ісігі гендерін (8q21 аймағы) табысқа жеткізді.

Халықтық генетика

Микроспутниктер 1990 жылдары популяциялық генетикада кеңінен танымал болды, себебі ПТР зертханаларда қолданысқа енгеннен кейін зерттеушілер арзан бағамен праймерлерді жобалай және микроспутниктер жиынтығын күшейте алды. Олардың қолданылу саласы өте кең. Эволюциялық тарихы бейтарап микроспутниктер популяцияның тарылуын, жергілікті бейімделуді, аллельдік бекіту индексін (FST), популяция мөлшерін және гендер ағынын өлшеуге немесе болжауға мүмкіндік береді. Жаңа буынның тізбектеу технологиясы қолжетімдірек бола бастағандықтан микроспутниктерді қолдану азайды, бірақ олар осы саладағы маңызды құрал болып қала береді.

Өсімдіктерді селекциялау

Маркерлік көмекпен таңдау немесе маркерлік көмекпен іріктеу (MAS) – қызығушылық тудыратын белгінің өзіне емес, оған байланысты маркерлерге (морфологиялық, биохимиялық немесе ДНК/РНК вариациясы) негізделген жанама таңдау процесі (мысалы, өнімділік, ауруға төзімділік, стресске төзімділік және сапа). Микросателлиттер өсімдіктерді селекциялауға көмектесетін маркерлер ретінде қолдануға ұсынылған.

Талдау

Қайталанатын ДНК-ны келесі буын ДНК секвенирлеу әдістерімен талдау қиын, себебі кейбір технологиялар гомополимерлік тізбектермен күреседі. Қайталанатын локустардағы генотиптерді және варианттарды анықтау үшін шикі некстген ДНК секвенирлеуін талдауға арналған әртүрлі бағдарламалық тәсілдер жасалған. Микросателлиттерді белгілі ПТР-амплификация және ампликон мөлшерін анықтау арқылы талдап, тексеруге болады, кейде Сангер ДНК секвенирлеуімен толықтырылады. Сот-медициналық сараптамада талдау қызығушылық тудыратын үлгідегі жасушалардан ядролық ДНК-ны бөліп алып, полимераза тізбектік реакциясы (ПТР) арқылы алынған ДНК-ның нақты полиморфтық аймақтарын күшейту арқылы жүргізіледі. Бұл тізбектер күшейтілгеннен кейін гельдік немесе капиллярлық электрофорез арқылы ажыратылады, бұл талдаушыға сұрақ туындаған микросателлиттер тізбегінің қанша рет қайталануын анықтауға мүмкіндік береді. Егер ДНК гельдік электрофорез арқылы ажыратылса, ДНК-ны күміс бояумен (төмен сезімталдық, қауіпсіз, арзан), этидий бромиді сияқты интеркаляциялық бояумен (жақсы сезімталдық, денсаулыққа орташа тәуекел, арзан) немесе, қазіргі заманғы сот-медициналық зертханаларда қолданылатындай, флуоресценттік бояулармен (жоғары сезімталдық, қауіпсіз, қымбат) көруге болады. Микросателлит фрагменттерін капиллярлық электрофорез арқылы ажыратуға арналған құралдар да флуоресценттік бояуларды пайдаланады. 10 локус және жыныс маркері қолданылады. Американдықтар бұл санды 13 локусқа дейін арттырды. Австралиялық деректер базасы NCIDD деп аталады, және 2013 жылдан бері ДНК профильдеу үшін 18 негізгі маркерді қолданып келеді.

Көшейткіш

Микроспутниктерді полимераза тізбекті реакция (ПТР) процесі арқылы идентификациялау үшін күшейтуге болады, мұнда жақтау аймақтарының ерекше тізбектері праймерлер ретінде қолданылады. ДНҚ екі тізбекті бөлу үшін жоғары температурада қайта-қайта денатурацияланады, содан кейін праймерлердің байланысуы және микроспутник арқылы нуклеотидтік тізбектердің кеңеюі үшін салқындатылады. Бұл процесс агароза немесе полиакриламид гельдерінде көрінетін жеткілікті ДНҚ өндірісіне әкеледі; күшейту үшін ДНҚ-ның шамалы ғана мөлшері қажет, себебі термоциклдеу репликацияланған сегменттің экспоненциалды өсуін қамтамасыз етеді. ПТР технологиясының кең таралғандығына байланысты микроспутниктік локустарды қоршап тұратын праймерлерді қолдану оңай және жылдам, бірақ дұрыс жұмыс істейтін праймерлерді әзірлеу көбінесе қиын және қымбат процесс болып табылады.

Микроспутниктік праймерлерді жобалау

Егер геномның белгілі бір аймақтарында микроспутниктік маркерлерді іздесе, мысалы, нақты бір интрон ішінде, праймерлерді қолмен жобалауға болады. Бұл геномдық ДНК тізбегін микроспутниктік қайталаулар үшін іздеуді қамтиды, оны көзге көріп немесе repeat masker сияқты автоматтандырылған құралдарды пайдалану арқылы жасауға болады. Әлеуетті пайдалы микроспутниктер анықталғаннан кейін, оларды қоршап тұратын тізбектерді ПТР (полимераза тізбектік реакция) арқылы нақты микроспутниктік қайталауды күшейту үшін олигонуклеотидтік праймерлерді жобастау үшін пайдалануға болады. Кездейсоқ микроспутниктік праймерлерді зерттелетін түрдің ДНК-сының кездейсоқ сегменттерін клондау арқылы жасауға болады. Бұл кездейсоқ сегменттер плазмидаға немесе бактериофаг векторына енгізіліп, одан әрі Escherichia coli бактериясына имплантацияланады. Содан кейін колониялар өсіріліп, ДНК сегментінде микроспутниктік қайталау болған жағдайда, оған гибридтелетін флуоресцентті белгіленген олигонуклеотидтік тізбектермен скринингтеледі. Егер осы процедурадан оң клондар алынса, ДНК тізбектеледі және нақты локусты анықтау үшін осындай аймақтарды қоршап тұратын тізбектерден ПТР праймерлері таңдалады. Бұл процесс зерттеушілердің көптеген сынақтар мен қателіктер жасауын қажет етеді, себебі микроспутниктік қайталау тізбектерін болжау қажет, ал кездейсоқ оқшауланған праймерлер маңызды полиморфизмді көрсетпеуі мүмкін. Микроспутниктік локустар геном бойынша кеңінен таралып, ескі үлгілердің жартылай ыдыраған ДНК-сынан да оқшаулануы мүмкін, себебі ПТР арқылы күшейту үшін қолайлы субстрат ғана қажет. Жақындағы әдістер микроспутниктік қайталауларға толыққанды қайталаулардан тұратын олигонуклеотидтік тізбектерді пайдаланып, алынған ДНК-ны "байытуды" (микроспутниктік байыту) қамтиды. Олигонуклеотидтік зонд микроспутниктік қайталаумен гибридтеліп, содан кейін зонд/микроспутник кешені ерітіндіден бөліп алынады. Байытылған ДНК әдеттегідей клондалады, бірақ сәттілік пайзысы қазір әлдеқайда жоғары болады, бұл пайдалану үшін аймақтарды дамытуға қажетті уақытты күрт қысқартады. Дегенмен, қандай зондтарды қолдану да өзіндік сынақ пен қателік процесі болуы мүмкін.

ISSR-PCR

ISSR (аралық қарапайым тізбек қайталануы үшін) – микросателлиттік локустар арасындағы геном аймағын белгілейтін жалпы термин. Екі жақын орналасқан микросателлиттің толықтырғыш тізбектері ПТР (ПЦР) праймерлері ретінде пайдаланылады; олардың арасындағы өзгергіш аймақ күшейтіледі. ПТР кезіндегі амплификация циклдарының шектеулі саны, тым ұзын үздіксіз ДНК тізбектерінің артық көбейіп кетуіне кедерес жасайды, сондықтан нәтижесінде әдетте қысқа, бірақ ұзындығы әртүрлі күшейтілген ДНК фрагменттерінің қоспасы пайда болады. ISSR ПТР арқылы күшейтілген тізбектер ДНК сақнау үшін қолданылуы мүмкін. ISSR сақталған немесе сақталмаған аймақ болуы мүмкін болғандықтан, бұл техника жеке тұлғаларды ажыратуға емес, филогеографиялық талдауларға немесе түрлерді анықтауға көбірек пайдалы; тізбектік әртүрлілік SSR ПТР-мен салыстырғанда төмен, бірақ нақты ген тізбектерінен жоғары. Сонымен қатар, микросателлиттік және ISSR тізбектемелері бір-біріне көмектеседі, себебі біреуі екіншісі үшін праймерлерді жасауға мүмкіндік береді.

Шектеулер

Қайталанатын ДНК-ны жаңа буын ДНК секвенирлеу әдістерімен талдау қиын, себебі олар гомополимерлік учаскелермен күреседі. Сондықтан микросателлиттер әдетте дәстүрлі ПТР-амплификация және ампликон мөлшерін анықтау арқылы талданады. ПТР қолданылуы микросателлит ұзындығын талдаудың, кез келген басқа ПТР-күшейтілген ДНК локусы сияқты, ПТР шектеулеріне ұшырауы мүмкін екенін білдіреді. Ерекше алаңдау тудыратын нәрсе – "жоқ аллельдердің" пайда болуы: кейде, жеке адамдардың үлгісінде, мысалы, әкелік тексеруде, микросателлиттің жанындағы ДНК-дағы мутация ПТР праймерінің байланысуына және ампликон жасауына кедергі келтіруі мүмкін (гельде "жоқ аллельді" құра отырып), нәтижесінде тек бір аллель күшейтіледі (мутацияланбаған әпкелік хромосомадан), ал жеке адам бұлжымайтын гомозиготты болып көрінуі мүмкін. Бұл әкелік істерде жаңылысқандыққа себеп болуы мүмкін. Сондықтан микросателлитті күшейту үшін басқа праймерлер жиынтығын қолдану қажет болуы мүмкін. Жоқ аллельдер, әсіресе, 3' бөлігінде, кеңейту басталатын жердегі мутациялардың салдарынан пайда болады. Түрлерді немесе популяцияларды талдау кезінде, мысалы, табиғатты қорғау жұмыстарында, бір жеке немесе түрде микросателлиттерді күшейтетін ПТР праймерлері басқа түрлерде де жұмыс істей алады. Дегенмен, ПТР праймерлерін әртүрлі түрлерге қолданудың тәуекелі – егер тізбектердің айырмашылығы праймерлердің байланысуы үшін тым үлкен болса, жоқ аллельдер пайда болуы мүмкін. Бұл жағдайда түрдің әртүрлілігі төмендегендей көрінуі мүмкін. Мұндай жағдайларда жоқ аллельдер кейде гомозиготтардың артық жиілігімен белгіленеді, бұл Харди-Вайнберг тепе-теңдігінен ауытқуларға әкеледі.