Рибонуклеазы: ферменты деградации РНК

Введение

Класс ферментов, катализирующих деградацию РНК.

Рибонуклеаза (обычно обозначаемая как RNase) — это тип нуклеазы, который катализирует расщепление РНК на более мелкие фрагменты. Рибонуклеазы можно разделить на эндорибонуклеазы и экзорибонуклеазы и включают несколько подклассов в классах ферментов EC 2.7 (для фосфоролитических ферментов) и 3.1 (для гидролитических ферментов).

Функция

Все изученные организмы содержат множество РНКаз двух различных классов, что свидетельствует о том, что деградация РНК – очень древний и важный процесс. Помимо удаления клеточной РНК, которая больше не требуется, РНКазы играют ключевую роль в созревании всех молекул РНК, как мРНК, несущих генетический материал для синтеза белков, так и некодирующих РНК, функционирующих в разнообразных клеточных процессах. Кроме того, активные системы деградации РНК являются первой линией защиты от РНК-вирусов и обеспечивают базовый механизм для более продвинутых клеточных иммунных стратегий, таких как РНК-интерференция. Некоторые клетки также секретируют значительное количество неспецифических РНКаз, таких как А и Т1. Следовательно, РНКазы чрезвычайно распространены, что приводит к очень короткому времени жизни любой РНК, не находящейся в защищенной среде. Важно отметить, что все внутриклеточные РНК защищены от активности РНКаз рядом механизмов, включая 5'-кэпирование, 3'-полиаденилирование, образование дуплекса РНК·РНК и формирование комплекса с белком РНК (рибонуклеопротеиновой частицы или РНП). Другим механизмом защиты является ингибитор рибонуклеазы (RI), который составляет относительно большую долю клеточного белка (~0,1%) в некоторых типах клеток и связывается с определенными рибонуклеазами с наивысшим сродством среди всех белок-белковых взаимодействий; константа диссоциации для комплекса RI-РНКаза А составляет около 20 фМ в физиологических условиях. RI используется в большинстве лабораторий, изучающих РНК, для защиты образцов от деградации под действием окружающих РНКаз. Подобно рестрикционным ферментам, расщепляющим высокоспецифические последовательности двухцепочечной ДНК, недавно были классифицированы различные эндорибонуклеазы, распознающие и расщепляющие специфические последовательности одноцепочечной РНК. РНКазы играют критическую роль во многих биологических процессах, включая ангиогенез и самонесовместимость у цветковых растений (ангиосперм). Было показано, что многие токсины стрессового ответа прокариотических систем токсин-антитоксин обладают РНКазной активностью и гомологией.

All organisms studied contain many RNases of two different classes, showing that RNA degradation is a very ancient and important process. As well as clearing of cellular RNA that is no longer required, RNases play key roles in the maturation of all RNA molecules, both messenger RNAs that carry genetic material for making proteins and non coding RNAs that function in varied cellular processes. In addition, active RNA degradation systems are the first defense against RNA viruses and provide the underlying machinery for more advanced cellular immune strategies such as RNAi. Some cells also secrete copious quantities of non specific RNases such as A and T1. RNases are, therefore, extremely common, resulting in very short lifespans for any RNA that is not in a protected environment. It is worth noting that all intracellular RNAs are protected from RNase activity by a number of strategies including 5' end capping, 3' end polyadenylation, formation of an RNA·RNA duplex, and folding within an RNA protein complex (ribonucleoprotein particle or RNP). Another mechanism of protection is ribonuclease inhibitor (RI), which comprises a relatively large fraction of cellular protein (~0.1%) in some cell types, and which binds to certain ribonucleases with the highest affinity of any protein protein interaction; the dissociation constant for the RI RNase A complex is ~20 fM under physiological conditions. RI is used in most laboratories that study RNA to protect their samples against degradation from environmental RNases. Similar to restriction enzymes, which cleave highly specific sequences of double stranded DNA, a variety of endoribonucleases that recognize and cleave specific sequences of single stranded RNA have been recently classified. RNases play a critical role in many biological processes, including angiogenesis and self incompatibility in flowering plants (angiosperms). Many stress response toxins of prokaryotic toxin antitoxin systems have been shown to have RNase activity and homology.

Основные типы эндорибонуклеаз

: RNase A – это рибонуклеаза, широко используемая в исследованиях. RNase A (например, панкреатическая рибонуклеаза A крупного рогатого скота) является одним из наиболее устойчивых ферментов, используемых в лаборатории; один из способов ее выделения – кипячение сырого клеточного экстракта до денатурации всех ферментов, кроме RNase A. Она специфична к одноцепочечным РНК. Она расщепляет 3'-конец несвязанных остатков C и U, в конечном итоге образуя 3'-фосфорилированный продукт через 2',3'-циклический монофосфатный интермедиат. Для своей активности не требует кофакторов. : RNase H – это рибонуклеаза, расщепляющая РНК в ДНК/РНК дуплексе с образованием одноцепочечной ДНК (ssDNA). RNase H является неспецифической эндонуклеазой и катализирует расщепление РНК посредством гидролитического механизма, которому способствует связанный с ферментом двухвалентный ион металла. RNase H оставляет 5'-фосфорилированный продукт. : RNase III – это тип рибонуклеазы, расщепляющей рРНК (16S рРНК и 23S рРНК) из транскрибированного полицистронного РНК-оперона у прокариот. Она также переваривает двухцепочечную РНК (dsRNA). Семейство RNAз Dicer разрезает пре-миРНК (длиной 60–70 п.н.) в определенном месте, превращая ее в миРНК (длиной 22–30 п.н.), которая активно участвует в регуляции транскрипции и времени жизни мРНК. Номер EC 3.1.26. : RNase L – это интерферон-индуцированная нуклеаза, которая при активации разрушает всю РНК в клетке. : RNase P – это тип рибонуклеазы, уникальный тем, что является рибозимом – рибонуклеиновой кислотой, действующей как катализатор, подобно ферменту. Одна из ее функций – отщепление лидирующей последовательности от 5'-конца пре-тРНК. RNase P является одним из двух известных рибозимов с множественным оборотом в природе (другой – рибосома). У бактерий RNase P также отвечает за каталитическую активность голоэнзимов, которые состоят из апоэнзима, образующего активную ферментную систему в сочетании с коэнзимом, и определяет специфичность этой системы к субстрату. Недавно была обнаружена форма RNase P, являющаяся белком и не содержащая РНК. Номер EC 3.1.?? : RNase PhyM специфична к одноцепочечным РНК. Она расщепляет 3'-конец несвязанных остатков A и U. : RNase T1 специфична к одноцепочечным РНК. Она расщепляет 3'-конец несвязанных остатков G. : RNase T2 специфична к одноцепочечным РНК. Она расщепляет 3'-конец всех 4 остатков, но преимущественно 3'-конец A. : RNase U2 специфична к одноцепочечным РНК. Она расщепляет 3'-конец несвязанных остатков A. : RNase V специфична к полиадениновой и полиуридиновой РНК. : RNase E – это рибонуклеаза растительного происхождения, которая модулирует SOS-ответ у бактерий в ответ на стресс, вызванный повреждением ДНК, путем активации SOS-механизма посредством транскрипционно-зависимого пути передачи сигнала RecA/LexA, который подавляет множественные гены, приводя к остановке клеточного деления и инициированию репарации ДНК. : RNase G участвует в процессинге 16'-го конца 5S рРНК. Она связана с разделением хромосом и делением клеток. Считается одним из компонентов цитоплазматических аксиальных пучков филаментов. Также предполагается, что она может регулировать формирование этой структуры.

: RNase A is an RNase that is commonly used in research. RNase A (e. g., bovine pancreatic ribonuclease A: ) is one of the hardiest enzymes in common laboratory usage; one method of isolating it is to boil a crude cellular extract until all enzymes other than RNase A are denatured. It is specific for single stranded RNAs. It cleaves the 3' end of unpaired C and U residues, ultimately forming a 3' phosphorylated product via a 2',3' cyclic monophosphate intermediate. It does not require any cofactors for its activity
: RNase H is a ribonuclease that cleaves the RNA in a DNA/RNA duplex to produce ssDNA. RNase H is a non specific endonuclease and catalyzes the cleavage of RNA via a hydrolytic mechanism, aided by an enzyme bound divalent metal ion. RNase H leaves a 5' phosphorylated product. : RNase III is a type of ribonuclease that cleaves rRNA (16s rRNA and 23s rRNA) from transcribed polycistronic RNA operon in prokaryotes. It also digests double stranded RNA (dsRNA) Dicer family of RNAse, cutting pre miRNA (60–70bp long) at a specific site and transforming it in miRNA (22–30bp), that is actively involved in the regulation of transcription and mRNA life time. EC number 3.1.26. ? ? : RNase L is an interferon induced nuclease that, upon activation, destroys all RNA within the cell
: RNase P is a type of ribonuclease that is unique in that it is a ribozyme – a ribonucleic acid that acts as a catalyst in the same way as an enzyme. One of its functions is to cleave off a leader sequence from the 5' end of one stranded pre tRNA. RNase P is one of two known multiple turnover ribozymes in nature (the other being the ribosome). In bacteria RNase P is also responsible for the catalytic activity of holoenzymes, which consist of an apoenzyme that forms an active enzyme system by combination with a coenzyme and determines the specificity of this system for a substrate. A form of RNase P that is a protein and does not contain RNA has recently been discovered. EC number 3.1.?? : RNase PhyM is sequence specific for single stranded RNAs. It cleaves 3' end of unpaired A and U residues. : RNase T1 is sequence specific for single stranded RNAs. It cleaves 3' end of unpaired G residues. : RNase T2 is sequence specific for single stranded RNAs. It cleaves 3' end of all 4 residues, but preferentially 3' end of As. : RNase U2 is sequence specific for single stranded RNAs. It cleaves 3' end of unpaired A residues. : RNase V is specific for polyadenine and polyuridine RNA. : RNase E is a ribonuclease of plant origin, which modulates SOS responses in bacteria, for a response to the stress of DNA damage by activation of the SOS mechanism by the RecA/LexA dependent signal transduction pathway that transcriptionally depresses a multiplicity of genes leading to transit arrest of cell division as well as initiation of DNA repair. : RNase G It is involved in processing the 16' end of the 5s rRNA. It is related to chromosome separation and cell division. It is considered one of the components of cytoplasmic axial filament bundles. It is also thought that it can regulate the formation of this structure.

Основные типы экзорибонуклеаз

Номер EC: Полинуклеотидная фосфорилаза (PNPase) функционирует как экзонуклеаза и как нуклеотидилтрансфераза. Номер EC: RNase PH функционирует как экзонуклеаза и как нуклеотидилтрансфераза. Номер EC 3.1.??: RNase R является близким гомологом RNase II, но в отличие от RNase II, он способен расщеплять РНК со вторичными структурами без помощи дополнительных факторов. Номер EC: RNase D участвует в 3'-5'-процессинге пре-тРНК. Номер EC 3.1.??: RNase T является основным участником созревания многих стабильных РНК в направлении 3'–5'. : Олигорибонуклеаза расщепляет короткие олигонуклеотиды до мононуклеотидов. : Экзорибонуклеаза I деградирует одноцепочечную РНК в направлении 5'–3', существует только у эукариот. : Экзорибонуклеаза II является близким гомологом экзорибонуклеазы I.

Специфика RNase

Активная область выглядит как рифтовая долина, где все аминокислотные остатки активной области формируют стенки и дно этой долины. Разлом очень узкий, и небольшая молекула-субстрат идеально помещается в середину активной области, обеспечивая оптимальное взаимодействие с аминокислотными остатками. При этом область имеет небольшую кривизну, которая также присутствует у субстрата. Хотя обычно большинство экзо- и эндорибонуклеаз не обладают специфичностью к последовательности, недавно система CRISPR/Cas, изначально распознающая и разрезающая ДНК, была модифицирована для специфичного к последовательности расщепления одноцепочечной РНК.

Загрязнение RNase во время экстракции РНК

Экстракция РНК в экспериментах молекулярной биологии значительно осложняется присутствием вездесущих и устойчивых рибонуклеаз, разрушающих образцы РНК. Некоторые рибонуклеазы могут быть чрезвычайно устойчивыми, и их инактивация затруднена по сравнению с нейтрализацией ДНКаз. Помимо высвобождающихся клеточных рибонуклеаз, в окружающей среде присутствует ряд рибонуклеаз. Рибонуклеазы эволюционировали, приобретая множество внеклеточных функций у различных организмов. Например, RNase 7, представитель суперсемейства RNase A, секретируется кожей человека и служит мощной защитой против патогенов. В этих секретируемых рибонуклеазах ферментативная активность рибонуклеазы может быть даже не нужна для ее новой, экспаптированной функции. Например, иммунные рибонуклеазы действуют, дестабилизируя клеточные мембраны бактерий.