Интроны: структура, типы и роль в генах.

Введение

Специфические последовательности пар оснований в гене.

Интрон – это любая нуклеотидная последовательность внутри гена, которая не экспрессируется и не является функциональной в конечном продукте РНК. Слово "интрон" происходит от термина "интрагенная область", то есть область внутри гена. Термин "интрон" относится как к последовательности ДНК в гене, так и к соответствующей последовательности РНК в РНК-транскриптах. Последовательности, не являющиеся интронами, соединяются в процессе обработки РНК, формируя зрелую РНК, и называются экзонами. Интроны встречаются в генах большинства эукариот и многих эукариотических вирусов и могут располагаться как в генах, кодирующих белки, так и в генах, функционирующих как РНК (некодирующих генах). Существует четыре основных типа интронов: интроны тРНК, интроны группы I, интроны группы II и сплайсосомные интроны (см. ниже). Интроны редки у бактерий и архей (прокариот).

Открытие и этимология

Интроны были впервые обнаружены в генах, кодирующих белки аденовируса, а впоследствии идентифицированы в генах, кодирующих транспортную РНК и рибосомные РНК. Сейчас известно, что интроны встречаются в широком разнообразии генов у организмов, бактерий и вирусов во всех биологических царствах. Тот факт, что гены разделены или прерываются интронами, был независимо открыт в 1977 году Филиппом Алленом Шарпом и Ричардом Дж. Робертсом, за что они разделили Нобелевскую премию по физиологии или медицине в 1993 году. Термин "интрон" был предложен американским биохимиком Уолтером Гилбертом:

Хотя интроны иногда называют интервенными последовательностями, термин "интервенная последовательность" может относиться к любому из нескольких семейств внутренних последовательностей нуклеиновых кислот, отсутствующих в конечном продукте гена, включая интеины, нетранслируемые области (UTR) и нуклеотиды, удаляемые посредством редактирования РНК, помимо интронов.

Распространение

Частота интронов в различных геномах значительно варьируется у разных биологических организмов. Например, интроны чрезвычайно распространены в ядерном геноме челюстноротых позвоночных (например, человека, мыши и фугу), где гены, кодирующие белки, почти всегда содержат несколько интронов, в то время как интроны редки в ядерных генах некоторых эукариотических микроорганизмов, например, пекарских/пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). В отличие от этого, митохондриальные геномы позвоночных полностью лишены интронов, тогда как у эукариотических микроорганизмов они могут присутствовать в большом количестве. Особенно ярким примером является ген *Drosophila dhc7*, содержащий интрон размером ≥3,6 мегабазы (Мб), транскрипция которого занимает около трех дней. На другом полюсе, исследование 2015 года показало, что самая короткая известная длина интрона у метазоанов составляет 30 пар оснований (bp) и принадлежит гену *MST1L* человека. Самые короткие интроны встречаются у гетеротрихных цилиат, таких как *Stentor coeruleus*, у которых большинство (>95%) интронов имеют длину 15 или 16 bp.

Сплицесомальные интроны

Ядерные пре-мРНК интроны (сплицеосомальные интроны) характеризуются специфическими последовательностями интронов, расположенными на границах между интронами и экзонами. Эти последовательности распознаются молекулами сплайсосомной РНК при инициации реакций сплайсинга. Кроме того, они содержат точку ветвления – определенную нуклеотидную последовательность вблизи 3'-конца интрона, которая ковалентно связывается с 5'-концом интрона в ходе процесса сплайсинга, формируя ветвленный интрон. Помимо этих трех коротких консервативных элементов, последовательности ядерных пре-мРНК интронов сильно варьируют. Ядерные пре-мРНК интроны часто значительно длиннее окружающих их экзонов.

интроны тРНК

Интроны транспортной РНК, удаление которых зависит от белков, располагаются в определенном месте внутри антикодоновой петли несплайсированных предшественников тРНК и удаляются тРНК-сплайсинговым эндонуклеазом. Затем экзоны соединяются друг с другом вторым белком – тРНК-сплайсинговой лигазой. Следует отметить, что самосплайсирующиеся интроны также иногда встречаются в генах тРНК.

Интроны группы I и группы II

Интроны группы I и группы II обнаруживаются в генах, кодирующих белки (мРНК), транспортную РНК и рибосомальную РНК у очень широкого круга живых организмов. После транскрипции в РНК интроны группы I и группы II также формируют обширные внутренние взаимодействия, позволяющие им сворачиваться в специфическую, сложную трехмерную структуру. Эти сложные структуры позволяют некоторым интронам группы I и группы II самосплайсироваться, то есть РНК-молекула, содержащая интрон, может перестраивать свою собственную ковалентную структуру для точного удаления интрона и соединения экзонов в правильном порядке. В некоторых случаях в сплайсинге участвуют специфические белки, связывающиеся с интронами, которые способствуют сворачиванию интрона в трехмерную структуру, необходимую для самосплайсинговой активности. Интроны группы I и группы II различаются различными наборами внутренних консервативных последовательностей и сформированных структур, а также тем, что сплайсинг РНК-молекул, содержащих интроны группы II, приводит к образованию разветвленных интронов (как у сплайсосомных РНК), в то время как интроны группы I используют некодированный нуклеотид гуанозин (обычно ГТФ) для инициирования сплайсинга, присоединяя его к 5'-концу вырезанного интрона.

О точности сплайсинга

Сплицеосома – очень сложная структура, содержащая до ста белков и пять различных РНК. Субстратом реакции является длинная молекула РНК, а реакции трансэстерификации, катализируемые сплайцеосомой, требуют сближения участков, разделенных тысячами нуклеотидов. Все биохимические реакции сопровождаются известными показателями ошибок, и чем сложнее реакция, тем выше этот показатель. Поэтому неудивительно, что реакция сплайсинга, катализируемая сплайцеосомой, имеет значительный показатель ошибок, несмотря на наличие вспомогательных факторов сплайцеосомы, подавляющих случайное расщепление криптических сайтов сплайсинга. В идеальных условиях реакция сплайсинга, вероятно, будет точной на 99,999% (показатель ошибки 10−5), при этом правильные экзоны будут соединены, а правильный интрон удален. Однако эти идеальные условия требуют очень точного соответствия лучшим последовательностям сайтов сплайсинга и отсутствия конкурирующих криптических сайтов сплайсинга внутри интронов, что редко встречается в крупных эукариотических генах, размер которых может превышать 40 килобаз пар. Недавние исследования показали, что фактический показатель ошибок может быть значительно выше 10−5 и достигать 2% или 3% ошибок (показатель ошибок 2 или 3 x 10−2) на ген. Дополнительные исследования указывают на то, что показатель ошибок составляет не менее 0,1% на интрон. Этот относительно высокий уровень ошибок сплайсинга объясняет, почему большинство вариантов сплайсинга быстро деградируют в результате нонсенс-опосредованного распада. Наличие нестрогих сайтов связывания в генах приводит к ошибкам сплайсинга, и может показаться странным, что эти сайты не были устранены естественным отбором. Аргумент в пользу их сохранения аналогичен аргументу в пользу "мусорной" ДНК. <blockquote>Хотя мутации, создающие или нарушающие сайты связывания, могут быть незначительно вредными, большое количество возможных таких мутаций делает неизбежным, что некоторые из них зафиксируются в популяции. Это особенно актуально для видов, таких как люди, с относительно небольшими эффективными популяциями в долгосрочной перспективе. Вероятно, геном человека несет значительную нагрузку субоптимальных последовательностей, вызывающих образование аберрантных транскриптных изоформ. В настоящем исследовании мы представляем прямые доказательства этого. Когда мутантный аллель находится в гетерозиготном состоянии, это приводит к образованию двух распространенных вариантов сплайсинга: одного функционального и одного нефункционального. В гомозиготном состоянии мутантные аллели могут вызывать генетические заболевания, такие как гемофилия, обнаруженная у потомков королевы Виктории, где мутация в одном из интронов гена фактора свертывания крови создает криптический 3'-сайт сплайсинга, приводящий к аберрантному сплайсингу. Значительная доля смертей людей от болезней может быть вызвана мутациями, нарушающими нормальный сплайсинг, в основном путем создания криптических сайтов сплайсинга.

The spliceosome is a very complex structure containing up to one hundred proteins and five different RNAs. The substrate of the reaction is a long RNA molecule and the transesterification reactions catalyzed by the spliceosome require the bringing together of sites that may be thousands of nucleotides apart. All biochemical reactions are associated with known error rates and the more complicated the reaction the higher the error rate. Therefore, it is not surprising that the splicing reaction catalyzed by the spliceosome has a significant error rate even though there are spliceosome accessory factors that suppress the accidental cleavage of cryptic splice sites. Under ideal circumstances, the splicing reaction is likely to be 99.999% accurate (error rate of 10−5) and the correct exons will be joined and the correct intron will be deleted. However, these ideal conditions require very close matches to the best splice site sequences and the absence of any competing cryptic splice site sequences within the introns and those conditions are rarely met in large eukaryotic genes that may cover more than 40 kilobase pairs. Recent studies have shown that the actual error rate can be considerably higher than 10−5 and may be as high as 2% or 3% errors (error rate of 2 or 3 x 10−2) per gene. Additional studies suggest that the error rate is no less than 0.1% per intron. This relatively high level of splicing errors explains why most splice variants are rapidly degraded by nonsense mediated decay. The presence of sloppy binding sites within genes causes splicing errors and it may seem strange that these sites haven't been eliminated by natural selection. The argument for their persistence is similar to the argument for junk DNA. <blockquote>Although mutations which create or disrupt binding sites may be slightly deleterious, the large number of possible such mutations makes it inevitable that some will reach fixation in a population. This is particularly relevant in species, such as humans, with relatively small long term effective population sizes. It is plausible, then, that the human genome carries a substantial load of suboptimal sequences which cause the generation of aberrant transcript isoforms. In this study, we present direct evidence that this is indeed the case. When the mutant allele is in a heterozygous state this will result in production of two abundant splice variants; one functional and one non functional. In the homozygous state the mutant alleles may cause a genetic disease such as the hemophilia found in descendants of Queen Victoria where a mutation in one of the introns in a blood clotting factor gene creates a cryptic 3' splice site resulting in aberrant splicing. A significant fraction of human deaths by disease may be caused by mutations that interfere with normal splicing; mostly by creating cryptic splice sites.

Биологические функции и эволюция

Хотя интроны не кодируют белковые продукты, они являются неотъемлемой частью регуляции экспрессии генов. Некоторые интроны сами кодируют функциональные РНК путем дальнейшей обработки после сплайсинга для генерации некодирующих молекул РНК. Альтернативный сплайсинг широко используется для создания нескольких белков из одного гена. Кроме того, некоторые интроны играют важную роль в широком диапазоне регуляторных функций экспрессии генов, таких как нонсенс-опосредованный распад и экспорт мРНК. После первоначального открытия интронов в генах, кодирующих белки, в эукариотическом ядре, шли значительные дебаты о том, унаследованы ли интроны в современных организмах от общего древнего предка (так называемая гипотеза «ранних интронов»), или они появились в генах относительно недавно в ходе эволюционного процесса (так называемая гипотеза «поздних интронов»). Другая теория заключается в том, что сплайцесома и структура интрон-экзон генов являются реликтом мира РНК (гипотеза «интроны прежде всего»). До сих пор существуют значительные споры о том, какая из этих гипотез наиболее верна, но в настоящее время преобладающее мнение заключается в том, что после образования первой эукариотической клетки интроны группы II из бактериального эндосимбионта проникли в геном хозяина. Вначале эти самосплайсирующиеся интроны вырезались из прекурсора мРНК, но со временем некоторые из них потеряли эту способность, и их вырезание стало нуждаться в помощи других интронов группы II в процессе, происходящем *in trans*. В конечном итоге эволюционировал ряд специфических интронов, действующих *in trans*, которые стали предшественниками малых ядерных РНК (snРНК) сплайцеосомы. Эффективность сплайсинга была повышена за счет ассоциации со стабилизирующими белками, что привело к формированию примитивной сплайцеосомы. Ранние исследования последовательностей геномной ДНК широкого спектра организмов показали, что структура интрон-экзон гомологичных генов у разных организмов может сильно различаться. Более поздние исследования целых геномов эукариот показали, что длина и плотность (интроны/ген) интронов значительно варьируют между родственными видами. Например, геном человека содержит в среднем 8,4 интрона на ген (139 418 в геноме), в то время как одноклеточный гриб *Encephalitozoon cuniculi* содержит всего 0,0075 интрона на ген (15 интронов в геноме). Поскольку эукариоты произошли от общего предка (общего происхождения), в ходе эволюции должно было произойти значительное увеличение или уменьшение числа интронов. Считается, что этот процесс подвержен отбору, с тенденцией к увеличению числа интронов у крупных видов из-за их меньшего размера популяций, и наоборот, у более мелких (особенно одноклеточных) видов. Биологические факторы также влияют на то, какие гены в геноме теряют или накапливают интроны. Альтернативный сплайсинг экзонов внутри гена после вырезания интронов вносит большую вариабельность в последовательности белков, транслируемых из одного гена, позволяя генерировать несколько родственных белков из одного гена и одного прекурсорного транскрипта мРНК. Контроль альтернативного сплайсинга РНК осуществляется сложной сетью сигнальных молекул, которые реагируют на широкий спектр внутриклеточных и внеклеточных сигналов. Интроны содержат несколько коротких последовательностей, важных для эффективного сплайсинга, таких как сайты акцептора и донора на обоих концах интрона, а также сайт ветвления, которые необходимы для правильного сплайсинга сплайцеосомой. Известно, что некоторые интроны усиливают экспрессию гена, в котором они находятся, посредством процесса, известного как интрон-опосредованное усиление (IME). Активно транскрибируемые области ДНК часто образуют R-петли, которые уязвимы для повреждения ДНК. В высокоэкспрессируемых генах дрожжей интроны ингибируют образование R-петель и возникновение повреждений ДНК. Анализ генома как дрожжей, так и человека показал, что гены, содержащие интроны, имеют сниженный уровень R-петель и сниженное повреждение ДНК по сравнению с генами без интронов с аналогичной экспрессией.

While introns do not encode protein products, they are integral to gene expression regulation. Some introns themselves encode functional RNAs through further processing after splicing to generate noncoding RNA molecules. Alternative splicing is widely used to generate multiple proteins from a single gene. Furthermore, some introns play essential roles in a wide range of gene expression regulatory functions such as nonsense mediated decay and mRNA export. After the initial discovery of introns in protein coding genes of the eukaryotic nucleus, there was significant debate as to whether introns in modern day organisms were inherited from a common ancient ancestor (termed the introns early hypothesis), or whether they appeared in genes rather recently in the evolutionary process (termed the introns late hypothesis). Another theory is that the spliceosome and the intron exon structure of genes is a relic of the RNA world (the introns first hypothesis). There is still considerable debate about the extent to which of these hypotheses is most correct but the popular consensus at the moment is that following the formation of the first eukaryotic cell, group II introns from the bacterial endosymbiont invaded the host genome. In the beginning these self splicing introns excised themselves from the mRNA precursor but over time some of them lost that ability and their excision had to be aided in trans by other group II introns. Eventually a number of specific trans acting introns evolved and these became the precursors to the snRNAs of the spliceosome. The efficiency of splicing was improved by association with stabilizing proteins to form the primitive spliceosome. Early studies of genomic DNA sequences from a wide range of organisms show that the intron exon structure of homologous genes in different organisms can vary widely. More recent studies of entire eukaryotic genomes have now shown that the lengths and density (introns/gene) of introns varies considerably between related species. For example, while the human genome contains an average of 8.4 introns/gene (139,418 in the genome), the unicellular fungus Encephalitozoon cuniculi contains only 0.0075 introns/gene (15 introns in the genome). Since eukaryotes arose from a common ancestor (common descent), there must have been extensive gain or loss of introns during evolutionary time. This process is thought to be subject to selection, with a tendency towards intron gain in larger species due to their smaller population sizes, and the converse in smaller (particularly unicellular) species. Biological factors also influence which genes in a genome lose or accumulate introns. Alternative splicing of exons within a gene after intron excision acts to introduce greater variability of protein sequences translated from a single gene, allowing multiple related proteins to be generated from a single gene and a single precursor mRNA transcript. The control of alternative RNA splicing is performed by a complex network of signaling molecules that respond to a wide range of intracellular and extracellular signals. Introns contain several short sequences that are important for efficient splicing, such as acceptor and donor sites at either end of the intron as well as a branch point site, which are required for proper splicing by the spliceosome. Some introns are known to enhance the expression of the gene that they are contained in by a process known as intron mediated enhancement (IME). Actively transcribed regions of DNA frequently form R loops that are vulnerable to DNA damage. In highly expressed yeast genes, introns inhibit R loop formation and the occurrence of DNA damage. Genome wide analysis in both yeast and humans revealed that intron containing genes have decreased R loop levels and decreased DNA damage compared to intronless genes of similar expression.

Как подвижные генетические элементы

Интроны могут быть потеряны или приобретены в ходе эволюции, как показывают многочисленные сравнительные исследования ортологичных генов. Последующие анализы выявили тысячи примеров событий потери и приобретения интронов, и было предложено, что возникновение эукариот или начальные этапы эволюции эукариот включали интронную инвазию. Два установленных механизма потери интронов – потеря интронов, опосредованная обратной транскриптазой (RTMIL), и геномные делеции – были идентифицированы и, как известно, происходят. Однако окончательные механизмы приобретения интронов остаются неуловимыми и вызывают споры. На данный момент описано по крайней мере семь механизмов приобретения интронов: транспозиция интронов, вставка транспозонов, тандемное геномное дублирование, перенос интронов, приобретение интронов во время восстановления двойных разрывов ДНК (DSBR), вставка интрона группы II и интронизация. Теоретически, должно быть проще всего установить происхождение недавно приобретенных интронов из-за отсутствия мутаций, индуцированных хозяином, однако даже недавно приобретенные интроны не возникли ни одним из вышеупомянутых механизмов. Эти результаты поднимают вопрос о том, не являются ли предложенные механизмы приобретения интронов неспособными описать механистическое происхождение многих новых интронов, потому что они не являются точными механизмами приобретения интронов, или существуют другие, еще не открытые, процессы, генерирующие новые интроны. В транспозиции интронов, наиболее часто предполагаемом механизме приобретения интронов, считается, что сплайсированный интрон обратным сплайсингом встраивается либо в свою собственную мРНК, либо в другую мРНК в ранее не содержавшую интронов позицию. Эта содержащая интрон мРНК затем обратной транскрибируется, и полученная содержащая интрон кДНК может вызвать приобретение интрона посредством полной или частичной рекомбинации с его исходным геномным локусом. Показано, что вставки транспозонов генерируют тысячи новых интронов в различных эукариотических видах. Вставки транспозонов иногда приводят к дупликации этой последовательности с обеих сторон от транспозона. Такая вставка может интронизировать транспозон, не нарушая кодирующую последовательность, когда транспозон вставляется в последовательность AGGT или кодирует сайты сплайсинга в последовательности транспозона. Если интронообразующие транспозоны не создают дупликации целевого участка, элементы включают в себя оба сайта сплайсинга GT (5') и AG (3'), обеспечивая точный сплайсинг без влияния на кодирующую белок последовательность. Пока неясно, почему эти элементы сплайсируются, случайно или в результате какого-то предпочтительного действия транспозона. При тандемном геномном дублировании, из-за сходства между консенсусными донорными и акцепторными сайтами сплайсинга, которые оба тесно напоминают AGGT, тандемное геномное дублирование экзонного сегмента, содержащего последовательность AGGT, генерирует два потенциальных сайта сплайсинга. При распознавании сплайсосомой последовательность между исходной и дуплицированной AGGT будет сплайсироваться, что приведет к созданию интрона без изменения кодирующей последовательности гена. Недавно было установлено, что восстановление двойных разрывов посредством некорректного соединения концов является источником приобретения интронов, когда исследователи идентифицировали короткие прямые повторы, фланкирующие 43% приобретенных интронов у Daphnia. Интроны группы II, вероятно, являются предполагаемыми предками сплайсосомных интронов, действуя как ретроэлементы, специфичные для конкретного сайта, и больше не отвечают за приобретение интронов. Тандемное геномное дублирование – единственный предложенный механизм, имеющий подтверждающие экспериментальные данные in vivo: короткая внутригенная тандемная дупликация может вставить новый интрон в ген, кодирующий белок, оставляя соответствующую пептидную последовательность неизменной. Этот механизм также имеет обширные косвенные доказательства, подтверждающие идею о том, что тандемное геномное дублирование является распространенным механизмом приобретения интронов. Тестирование других предложенных механизмов in vivo, в частности приобретения интронов во время DSBR, переноса интронов и интронизации, возможно, хотя эти механизмы должны быть продемонстрированы in vivo, чтобы закрепить их как реальные механизмы приобретения интронов. Дальнейшие геномные анализы, особенно проводимые на популяционном уровне, могут количественно оценить относительный вклад каждого механизма, возможно, выявив видоспецифические особенности, которые могут пролить свет на различные темпы приобретения интронов у разных видов.

Introns may be lost or gained over evolutionary time, as shown by many comparative studies of orthologous genes. Subsequent analyses have identified thousands of examples of intron loss and gain events, and it has been proposed that the emergence of eukaryotes, or the initial stages of eukaryotic evolution, involved an intron invasion. Two definitive mechanisms of intron loss, reverse transcriptase mediated intron loss (RTMIL) and genomic deletions, have been identified, and are known to occur. The definitive mechanisms of intron gain, however, remain elusive and controversial. At least seven mechanisms of intron gain have been reported thus far: intron transposition, transposon insertion, tandem genomic duplication, intron transfer, intron gain during double strand break repair (DSBR), insertion of a group II intron, and intronization. In theory it should be easiest to deduce the origin of recently gained introns due to the lack of host induced mutations, yet even introns gained recently did not arise from any of the aforementioned mechanisms. These findings thus raise the question of whether or not the proposed mechanisms of intron gain fail to describe the mechanistic origin of many novel introns because they are not accurate mechanisms of intron gain, or if there are other, yet to be discovered, processes generating novel introns. In intron transposition, the most commonly purported intron gain mechanism, a spliced intron is thought to reverse splice into either its own mRNA or another mRNA at a previously intron less position. This intron containing mRNA is then reverse transcribed and the resulting intron containing cDNA may then cause intron gain via complete or partial recombination with its original genomic locus. Transposon insertions have been shown to generate thousands of new introns across diverse eukaryotic species. Transposon insertions sometimes result in the duplication of this sequence on each side of the transposon. Such an insertion could intronize the transposon without disrupting the coding sequence when a transposon inserts into the sequence AGGT or encodes the splice sites within the transposon sequence. Where intron generating transposons do not create target site duplications, elements include both splice sites GT (5') and AG (3') thereby splicing precisely without affecting the protein coding sequence. It is not yet understood why these elements are spliced, whether by chance, or by some preferential action by the transposon. In tandem genomic duplication, due to the similarity between consensus donor and acceptor splice sites, which both closely resemble AGGT, the tandem genomic duplication of an exonic segment harboring an AGGT sequence generates two potential splice sites. When recognized by the spliceosome, the sequence between the original and duplicated AGGT will be spliced, resulting in the creation of an intron without alteration of the coding sequence of the gene. Double stranded break repair via non homologous end joining was recently identified as a source of intron gain when researchers identified short direct repeats flanking 43% of gained introns in Daphnia. Group II introns are therefore likely the presumed ancestors of spliceosomal introns, acting as site specific retroelements, and are no longer responsible for intron gain. Tandem genomic duplication is the only proposed mechanism with supporting in vivo experimental evidence: a short intragenic tandem duplication can insert a novel intron into a protein coding gene, leaving the corresponding peptide sequence unchanged. This mechanism also has extensive indirect evidence lending support to the idea that tandem genomic duplication is a prevalent mechanism for intron gain. The testing of other proposed mechanisms in vivo, particularly intron gain during DSBR, intron transfer, and intronization, is possible, although these mechanisms must be demonstrated in vivo to solidify them as actual mechanisms of intron gain. Further genomic analyses, especially when executed at the population level, may then quantify the relative contribution of each mechanism, possibly identifying species specific biases that may shed light on varied rates of intron gain amongst different species.