Введение

График кинетики ферментов

В биохимии график Линевера–Берка (или график двойных обратных величин) является графическим представлением уравнения Михаэлиса–Ментен кинетики ферментов, описанного Хансом Линевеером и Дином Берком в 1934 году. График двойных обратных величин искажает структуру ошибок в данных и, следовательно, не является наиболее точным инструментом для определения кинетических параметров фермента. Хотя график Линевера–Берка исторически использовался для оценки параметров, наряду с альтернативными линейными формами уравнения Михаэлиса–Ментен, такими как график Ханеса–Вульфа или график Эди–Хофсти, следует избегать всех линеаризованных форм уравнения Михаэлиса–Ментен для расчета кинетических параметров. Правильно взвешенные методы нелинейной регрессии значительно точнее и стали широко доступны благодаря повсеместному распространению настольных компьютеров.

Приложения

При использовании для определения типа ингибирования ферментов, график Линевейвера — Берка позволяет различать конкурентное, чисто неконкурентное и смешанное (неконкурентное) ингибирование. Различные типы ингибирования можно сравнить с реакцией, протекающей без ингибитора.

Ингибирование конкуренции

Видимое значение Km не изменяется под действием конкурентных ингибиторов. Следовательно, конкурентные ингибиторы имеют такое же пересечение с осью ординат, как и неингибированные ферменты. Конкурентное ингибирование увеличивает видимое значение Km или снижает аффинность субстрата. Графически это проявляется в том, что ингибированный фермент имеет большее пересечение с осью абсцисс.

Чистое неконкурентное торможение

При чистом неконкурентном ингибировании кажущееся значение *Km* уменьшается. Это можно увидеть на графике Линевейвера — Берка как увеличение ординатного перехвата при отсутствии влияния на абсциссный перехват, поскольку чистое неконкурентное ингибирование не влияет на сродство субстрата.

Смешанное ингибирование

Чистое неконкурентное ингибирование встречается редко, а смешанное ингибирование гораздо более распространено. При смешанном ингибировании кажущееся значение *K*<sub>m</sub> уменьшается, а кажущееся значение *V*<sub>max</sub> изменяется – обычно увеличивается, что означает, что аффинность обычно снижается при смешанном ингибировании. Клеланд отметил, что чистое неконкурентное ингибирование крайне редко встречается на практике, в основном наблюдаясь при воздействии протонов и некоторых ионов металлов, и он переопределил термин «неконкурентное» как «смешанное». Многие авторы последовали его примеру в этом отношении, но не все.

Неконкурентное торможение

Очевидное значение *V*max уменьшается при неконкурентном ингибировании, в то время как *Km* остается неизменным. Это можно увидеть на графике Линевейвера — Берка как увеличение пересечения с осью ординат при неизменном наклоне. При неконкурентном ингибировании повышается сродство субстрата к ферменту, или снижается кажущееся значение *V*max. Графически неконкурентное ингибирование можно определить по параллельным линиям на графике Линевейвера — Берка для разных концентраций ингибитора.

Недостатки

Схема Lineweaver–Burk плохо визуализирует экспериментальную ошибку. В частности, если ошибки имеют одинаковые стандартные ошибки, то ошибки величины 1/v варьируются в очень широком диапазоне, как видно из следующего примера:

Если , то диапазон 1/v составляет 0,91–1,11, что примерно 20%.
Если (при том же стандартном отклонении), то диапазон 1/v составляет 0,0990–0,1001, что примерно 1%. Линевейвер и Берк были осведомлены об этой проблеме и, после экспериментального исследования распределения ошибок и обнаружения равномерного стандартного отклонения в v, проконсультировались с выдающимся статистиком У. Эдвардсом Демингом. Следуя его рекомендациям, они использовали веса при аппроксимации своих данных. Этот аспект их работы почти повсеместно игнорируется теми, кто ссылается на «метод Линевейвера и Берка». Значения, измеренные при низких значениях v, а следовательно, при больших значениях 1/v, приводят к точкам в крайней правой части графика и оказывают значительное влияние на наклон линии, и, в частности, на значение Km.