Расшифровка генетического кода: эксперименты Ниренберга-Ледера и открытие тройственности кодонов.

Введение

Эксперимент Ниренберга и Ледера — научный эксперимент, проведенный в 1964 году Маршаллом В. Ниренбергом и Филиппом Ледером. Эксперимент установил триплетную природу генетического кода и позволил расшифровать оставшиеся неоднозначные кодоны генетического кода. В ходе эксперимента, с использованием анализа связывания рибосом, известного как метод триплетного связывания, различные комбинации мРНК пропускались через фильтр, содержащий рибосомы. Уникальные триплеты стимулировали связывание специфических тРНК с рибосомой. Сопоставив тРНК с соответствующей аминокислотой, удалось определить последовательность триплетной мРНК, кодирующую каждую аминокислоту.

Предыстория

Освальд Эйвери обнаружил, что веществом, ответственным за возникновение наследственных изменений в бактериях, вызывающих заболевания, являлась не белок и не липид, а дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Он и его коллеги Колин МакЛеод и Маклин МакКарти предположили, что ДНК отвечает за передачу генетической информации. Позднее Эрвин Чаргафф обнаружил, что состав ДНК различается у разных видов. Эти эксперименты подготовили почву для открытия структуры ДНК. В 1953 году, опираясь на рентгенокристаллографические данные, полученные Морисом Уилкинсом и Розалинд Франклин, Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик предложили, что ДНК имеет структуру двойной спирали. В 1960-х годах одной из главных загадок ДНК, которую необходимо было разгадать ученым, было определение количества оснований в каждом кодовом слове, или кодоне. Ученые знали, что существует в общей сложности четыре основания (гуанин, цитозин, аденин и тимин). Они также знали о существовании 20 известных аминокислот. Джордж Гамов предположил, что генетический код состоит из трех нуклеотидов на аминокислоту. Он рассуждал, что поскольку существует 20 аминокислот и всего четыре основания, кодирующие единицы не могут быть одиночными (4 комбинации) или парными (всего 16 комбинаций). Скорее, он полагал, что тройки (64 возможных комбинации) являются кодирующей единицей генетического кода. Однако он предположил, что эти тройки перекрываются и не являются вырожденными. Сеймур Бензер в конце 1950-х годов разработал метод анализа, основанный на мутациях фагов, который позволил создать первую подробную линейно структурированную карту генетического региона. Крик считал, что он может использовать мутагенез и генетическую рекомбинацию фагов для дальнейшего изучения природы генетического кода. В эксперименте Крика, Бреннера и др. с использованием этих фагов была подтверждена триплетная природа генетического кода. Они использовали сдвиговые мутации и процесс, называемый реверсиями, для добавления и удаления различного количества нуклеотидов. Когда к последовательности ДНК добавлялся или удалялся нуклеотидный триплет, кодируемый белок практически не изменялся. Таким образом, они пришли к выводу, что генетический код является триплетным, поскольку это не вызывало сдвига рамки считывания. Они правильно заключили, что код является вырожденным, что тройки не перекрываются и что каждая нуклеотидная последовательность считывается с определенной точки начала.

Oswald Avery discovered that the substance responsible for producing inheritable change in the disease causing bacteria was neither a protein nor a lipid, rather deoxyribonucleic acid (DNA). He and his colleagues Colin MacLeod and Maclyn McCarty suggested that DNA was responsible for transferring genetic information. Later, Erwin Chargaff discovered that the makeup of DNA differs from one species to another. These experiments helped pave the way for the discovery of the structure of DNA. In 1953, with the help of Maurice Wilkins and Rosalind Franklin’s X ray crystallography, James Watson and Francis Crick proposed DNA is structured as a double helix. In the 1960s, one main DNA mystery scientists needed to figure out was in translation how many bases would be in each code word, or codon. Scientists knew there were a total of four bases (guanine, cytosine, adenine, and thymine). They also knew that were 20 known amino acids. George Gamow suggested that the genetic code was made of three nucleotides per amino acid. He reasoned that because there are 20 amino acids and only four bases, the coding units could not be single (4 combinations) or pairs (only 16 combinations). Rather, he thought triplets (64 possible combinations) were the coding unit of the genetic code. However, he proposed that the triplets were overlapping and non degenerate. Seymour Benzer in the late 1950s had developed an assay using phage mutations which provided the first detailed linearly structured map of a genetic region. Crick felt he could use mutagenesis and genetic recombination phage to further delineate the nature of the genetic code. In the Crick, Brenner et al. experiment, using these phages, the triplet nature of the genetic code was confirmed. They used frameshift mutations and a process called reversions, to add and delete various numbers of nucleotides. When a nucleotide triplet was added to or deleted from the DNA sequence, the encoded protein was minimally affected. Thus, they concluded that the genetic code is a triplet code because it did not cause a frameshift in the reading frame. They correctly concluded that the code is degenerate, that triplets are not overlapping, and that each nucleotide sequence is read from a specific starting point.

Экспериментальная работа

Самый первый кодон аминокислоты (UUU, кодирующий фенилаланин) был расшифрован Ниренбергом и его постдоком Генрихом Маттеем (см. эксперимент Ниренберга и Маттея) с использованием длинной синтетической РНК. Однако, при создании подобных РНК, содержащих более одной РНК-основы, порядок оснований был случайным. Например, можно было синтезировать длинную РНК с соотношением C к U равным 2:1, которая бы содержала кодоны CCU, CUC и UCC в высокой частоте. При трансляции рибосомами это привело бы к образованию белка, содержащего аминокислоты пролин, лейцин и серин, но было невозможно определить, какой кодон соответствует какой аминокислоте. Вместо этого группа Ниренберга перешла к использованию очень коротких синтетических РНК. Они обнаружили, что тринуклеотид UUU (кодон для фенилаланина) способен вызывать специфическое связывание фенилаланин-заряженной тРНК с рибосомами. Это связывание можно было обнаружить, пропуская смесь через нитроцеллюлозный фильтр: фильтр удерживает рибосомы, но не свободную тРНК; однако, если тРНК была связана с рибосомой, она также задерживалась бы (вместе с радиоактивным фенилаланином, присоединенным к тРНК). Аналогично, они обнаружили, что тринуклеотиды AAA или CCC вызывали связывание рибосом с лизин-тРНК или пролин-тРНК соответственно. Таким образом, план эксперимента был ясен: синтезировать все 64 различные комбинации тринуклеотидов и использовать фильтрующий анализ с тРНК, заряженными всеми 20 аминокислотами, чтобы определить, какая аминокислота связывается с каким тринуклеотидом. Однако получение чистых тринуклеотидов со смешанными последовательностями оснований, например GUU, представляло собой сложную задачу. Пионерские исследования Ледера использовали тринуклеотиды, полученные путем расщепления длинной случайной поли-ГУ РНК с помощью нуклеазы и очистки специфических тринуклеотидов методом бумажной хроматографии: цистеина и лейцина соответственно. Впоследствии группа Ниренберга конструировала тринуклеотиды, используя ДНК-полимеразы в сочетании с нуклеотидами и РНК-полимеразы для создания длинной случайной поли-ГУ РНК, а также для искусственного реплицирования очищенных тринуклеотидов. После получения достаточно высоких концентраций мРНК, деградация и реформирование продуктов полимеразы осуществлялись с помощью ферментативных процессов. Например, AGU можно было получить из AG и U с помощью полинуклеотидной фосфорилазы; UAG можно было получить из AG и U с помощью рибонуклеазы A в высокой концентрации метанола. Постдок Ниренберга Мертон Бернфилд использовал эти методы, чтобы установить, что UUU и UUC кодируют фенилаланин, UCU и UCC кодируют серин, а CCC и CCU кодируют пролин, что подчеркивает закономерность избыточного кодирования аминокислот генетическим кодом. Многие другие сотрудники лаборатории Ниренберга и Национального института здоровья внесли вклад в полное расшифровку генетического кода.

The very first amino acid codon (UUU encoding phenylalanine) was deciphered by Nirenberg and his postdoc Heinrich Matthaei (see Nirenberg and Matthaei experiment) using long synthetic RNA. However, when similar RNAs are made containing more than one RNA base, the order of the bases was random. For example, a long RNA could be made that had a ratio of C to U of 2:1, and so would contain codons CCU, CUC, UCC at high frequency. When translated by ribosomes, this would produce a protein containing the amino acids proline, leucine, and serine; but it was not possible to say which codon matched which amino acid. Instead, Nirenberg's group turned to very short synthetic RNAs. They found that the trinucleotide UUU (which is the codon for phenylalanine), was able to cause specific association of phenylalanine charged tRNA with ribosomes. This association could be detected by passing the mixture through a nitrocellulose filter: the filter captures ribosomes but not free tRNA; however if tRNA was associated with the ribosome, it would also be captured (along with the radioactive phenylalanine attached to the tRNA). They similarly found that trinucleotides AAA or CCC caused ribosome association of lysine tRNA or proline tRNA, respectively. So an experimental plan was clear: synthesize all 64 different trinucleotide combinations, and use the filter assay with tRNAs charged with all 20 amino acids, to see which amino acid associated with which trinucleotide. However, obtaining pure trinucleotides with mixed base sequences, for example GUU, was a daunting challenge. Leder's pioneering studies used trinucleotides made by breaking down long random poly GU RNA with nuclease and purifying specific trinucleotides by paper chromatography: cysteine and leucine, respectively. Subsequently, Nirenberg's group constructed trinucleotides by using DNA polymerases coupled with nucleotides and RNA polymerases to create the long random poly GU RNA as well as artificially replicate the purified trinucleotides. Once high enough concentrations of mRNA were produced, degradation and reformation of polymerase products was accomplished through enzymatic processes. For example, AGU could be made from AG and U with polynucleotide phosphorylase; UAG could be made from AG and U with ribonuclease A in a high concentration of methanol. Nirenberg's postdoc Merton Bernfield used these techniques to determine that UUU and UUC encode phenylalanine, UCU and UCC encode serine, and CCC and CCU encode proline, highlighting a pattern in the way the genetic code redundantly encodes amino acids. Many others in the Nirenberg lab and at NIH contributed to the full decipherment of the genetic code.