Опиоидные рецепторы: история открытия и эволюция.

Введение

Группа биологических рецепторов

Опиоидные рецепторы — это группа ингибирующих G-белок-связанных рецепторов, для которых опиоиды выступают в качестве лигандов. Эндогенными опиоидами являются динорфины, энкефалины, эндорфины, эндоморфины и ноцицептин. Опиоидные рецепторы примерно на 40% идентичны соматостатиновым рецепторам (SSTR). Опиоидные рецепторы широко распространены в головном мозге, спинном мозге, на периферических нейронах и в пищеварительном тракте.

Открытие

К середине 1960-х годов фармакологические исследования показали, что опиоиды, вероятно, реализуют свое действие посредством специфических рецепторных участков, и что таких участков, скорее всего, несколько. Более ранние исследования указывали на то, что опиаты накапливаются в мозге. Рецепторы впервые были идентифицированы как специфические молекулы с использованием исследований связывания, в ходе которых опиаты, меченные радиоизотопами, обнаруживались, связываясь с гомогенатами мембран мозга. Первое такое исследование было опубликовано в 1971 году с использованием 3H-леворфанола. В 1973 году Кандис Перт и Соломон Х. Снайдер опубликовали первое подробное исследование связывания того, что впоследствии оказалось μ-опиоидным рецептором, используя 3H-налоксон. Это исследование широко признано первым убедительным доказательством существования опиоидного рецептора, хотя вскоре после него были опубликованы еще два исследования.

Очищение

Очистка рецептора дополнительно подтвердила его существование. Первая попытка очистки рецептора включала использование нового опиоидного антагониста под названием хлорналтрексамин, который продемонстрировал способность связываться с опиоидным рецептором. Позже Карузо очистил компонент, выделенный из мембран мозга крысы с помощью детергента, который элюировался вместе со специфически связанным 3H-хлорналтрексамином.

Эволюция

Семейство опиоидных рецепторов (ОР) произошло от двух событий дупликации единого предкового опиоидного рецептора на ранних этапах эволюции позвоночных. Филогенетический анализ демонстрирует, что семейство опиоидных рецепторов уже существовало в момент появления челюстных позвоночных более 450 миллионов лет назад. У человека этот паралогон, возникший в результате двойной тетраплоидизации, привел к локализации генов рецепторов на хромосомах 1, 6, 8 и 20. События тетраплоидизации часто приводят к потере одного или нескольких дублированных генов, но в данном случае почти все виды сохраняют все четыре опиоидных рецептора, что свидетельствует о биологической значимости этих систем. Стефано проследил совместную эволюцию ОР и иммунной системы, лежащую в основе того факта, что эти рецепторы помогали ранним животным выживать при боли и воспалительном шоке в агрессивных условиях. Семейства рецепторов дельта, каппа и мю демонстрируют 55–58% идентичности друг с другом и 48–49% гомологии с ноцицептиновым рецептором. В совокупности это указывает на то, что ген NOP-рецептора, OPRL1, имеет такое же эволюционное происхождение, но более высокую скорость мутаций, чем другие гены рецепторов. Хотя семейства опиоидных рецепторов имеют много общего, их структурные различия приводят к функциональным различиям. Таким образом, мю-опиоидные рецепторы индуцируют расслабление, доверие, удовлетворение и анальгезию. Эта система также может способствовать установлению стабильных, эмоционально привязанных отношений. Эксперименты на молодых морских свинках показали, что социальная привязанность опосредована опиоидной системой. Эволюционная роль опиоидной сигнализации в этих видах поведения была подтверждена на собаках, цыплятах и крысах. Опиоидные рецепторы также играют роль в репродуктивном поведении. Однако мю-опиоидные рецепторы контролируют не только социальное поведение, но и вызывают чувство расслабления в самых разных ситуациях. Каппа- и дельта-опиоидные рецепторы могут быть менее связаны с расслаблением и анальгезией, поскольку каппа-опиоидный рецептор подавляет активацию мю-опиоидного рецептора, а дельта-опиоидный рецептор по-разному взаимодействует с агонистами и антагонистами. Каппа-опиоидные рецепторы участвуют в перцептивной мобилизации при хронической тревоге, в то время как дельта-опиоидные рецепторы индуцируют инициацию действий, импульсивность и поведенческую мобилизацию. Эти различия заставили некоторых исследователей предположить, что регуляция вверх или вниз в трех семьях опиоидных рецепторов лежит в основе различной эмоциональной предрасположенности, наблюдаемой при психических расстройствах. Специфические для человека когнитивные особенности, модулируемые опиоидами, обусловлены не различиями в кодировании рецепторов или лигандов, которые имеют 99% сходства с приматами, а регуляторными изменениями в уровнях экспрессии.

The opioid receptor (OR) family originated from two duplication events of a single ancestral opioid receptor early in vertebrate evolution. Phylogenetic analysis demonstrates that the family of opioid receptors was already present at the origin of jawed vertebrates over 450 million years ago. In humans, this paralogon resulting from a double tetraploidization event resulted in the receptor genes being located on chromosomes 1, 6, 8, and 20. Tetraploidization events often result in the loss of one or more of the duplicated genes, but in this case, nearly all species retain all four opioid receptors, indicating biological significance of these systems. Stefano traced the co evolution of OR and the immune system underlying the fact that these receptors helped earlier animals to survive pain and inflammation shock in aggressive environments. The receptor families delta, kappa, and mu demonstrate 55–58% identity to one another, and a 48–49% homology to the nociceptin receptor. Taken together, this indicates that the NOP receptor gene, OPRL1, has equal evolutionary origin, but a higher mutation rate, than the other receptor genes. Although opioid receptor families share many similarities, their structural differences lead to functional difference. Thus, mu opioid receptors induce relaxation, trust, satisfaction, and analgesia. This system may also help mediate stable, emotionally committed relationships. Experiments with juvenile guinea pigs showed that social attachment is mediated by the opioid system. The evolutionary role of opioid signaling in these behaviors was confirmed in dogs, chicks, and rats. Opioid receptors also have a role in mating behaviors. However, mu opioid receptors do not just control social behavior because they also make individuals feel relaxed in a wide range of other situations. Kappa and delta opioid receptors may be less associated with relaxation and analgesia because kappa opioid receptor suppresses mu opioid receptor activation, and delta opioid receptor interacts differently with agonists and antagonists. Kappa opioid receptors are involved in chronic anxiety's perceptual mobilization, whereas delta opioid receptors induce action initiation, impulsivity, and behavioural mobilization. These differences led some researches to suggest that up or down regulations within three opioid receptors families are the basis of different dispositional emotionality seen in psychiatric disorders. Human specific opioid modulated cognitive features are not attributable to coding differences for receptors or ligands, which share 99% similarity with primates, but to regulatory changes in expression levels.

Номенклатура

Рецепторы были названы по первой букве первого лиганда, который был обнаружен, связывающегося с ними. Морфин был первым химическим веществом, показавшим связывание с "мю"-рецепторами. Первая буква названия препарата морфин – m, которая отображается соответствующей греческой буквой μ. Аналогичным образом, препарат кетоциклазоцин впервые продемонстрировал связывание с "κ" (каппа)-рецепторами, а "δ" (дельта)-рецептор был назван в честь ткани придатка яичка мыши, в которой рецептор был впервые охарактеризован. Позднее был идентифицирован и клонирован дополнительный опиоидный рецептор на основе гомологии с кДНК. Этот рецептор известен как ноцицептин-рецептор или ORL1 (опиоидоподобный рецептор 1). Типы опиоидных рецепторов почти на 70% идентичны, при этом различия локализованы в N- и C-концевых областях. Мю-рецептор, вероятно, является наиболее важным. Считается, что G-белок связывается с третьим внутриклеточным циклом всех опиоидных рецепторов. У мышей и у людей гены различных подтипов рецепторов расположены на разных хромосомах. В тканях человека были идентифицированы отдельные подтипы опиоидных рецепторов. До настоящего времени исследования не выявили генетических доказательств существования подтипов, и предполагается, что они возникают в результате посттрансляционной модификации клонированных типов рецепторов. Подкомитет IUPHAR рекомендовал использовать следующую терминологию для трех классических (μ, δ, κ) рецепторов и неклассического (ноцицептин) рецептора: MOP ("Mu OPiate receptor"), DOP, KOP и NOP соответственно.

Дополнительные рецепторы

Сигма (σ) рецепторы когда-то считались опиоидными рецепторами, поскольку антитуссивное действие многих опиоидных препаратов опосредовалось через σ рецепторы, а первые селективные агонисты σ были производными опиоидов (например, аллильнорметазоцин). Однако было установлено, что эндогенные опиоидные пептиды не активируют σ рецепторы, и они значительно отличаются от других опиоидных рецепторов как по функции, так и по генной последовательности, поэтому в настоящее время их обычно не классифицируют как опиоидные рецепторы. Существование дополнительных опиоидных рецепторов (или подтипов рецепторов) также предполагалось на основании фармакологических данных о действиях, вызываемых эндогенными опиоидными пептидами, но не опосредованных ни одним из четырех известных подтипов опиоидных рецепторов. Основания для предположения о существовании подтипов рецепторов или дополнительных рецепторов, отличных от классических опиоидных рецепторов (μ, δ, κ), были ограничены, поскольку идентифицированы только три гена для трех основных рецепторов. Единственным из этих дополнительных рецепторов, который был окончательно идентифицирован, является дзета (ζ) опиоидный рецептор, который, как было показано, является модулятором фактора клеточного роста, а мет-энкeфалин – его эндогенным лигандом. В настоящее время этот рецептор чаще всего называют рецептором опиоидного фактора роста (OGFr).

Эпсилон (ε) опиоидный рецептор

Другим постулируемым опиоидным рецептором является ε-опиоидный рецептор. О существовании этого рецептора предположили после того, как было показано, что эндогенный опиоидный пептид бета-эндорфин оказывает дополнительные эффекты, которые, по-видимому, не опосредованы ни одним из известных опиоидных рецепторов. Активация этого рецептора вызывает выраженную анальгезию и высвобождение мет-энкeфалина; ряд широко используемых опиоидных агонистов, таких как μ-агонист эторфин и κ-агонист бремазоцин, продемонстрировали агонистическую активность в отношении этого эффекта (даже в присутствии антагонистов к их более известным мишеням), в то время как бупренорфин выступает в роли ε-антагониста. В настоящее время доступны несколько селективных агонистов и антагонистов для предполагаемого ε-рецептора; однако попытки обнаружить ген, кодирующий этот рецептор, не увенчались успехом, а эффекты, опосредованные ε-рецептором, отсутствовали у мышей с "тройным нокаутом" по генам μ/δ/κ, что позволяет предположить, что ε-рецептор, скорее всего, является либо сплайс-вариантом, полученным в результате альтернативной посттрансляционной модификации, либо гетеродимером, образованным в результате гибридизации двух или более известных опиоидных рецепторов.

Механизм активации

Опиоидные рецепторы являются типом G-белок-связанных рецепторов (GPCR). Эти рецепторы распределены по всей центральной нервной системе и в периферических тканях нервного и не нервного происхождения. Они также локализованы в высоких концентрациях в сером веществе вокруг водопровода, голубом ядре и ростральной вентромедиальной части продолговатого мозга. Рецепторы состоят из внеклеточного N-концевого аминокислотного фрагмента, семи трансмембранных спиральных петель, трех внеклеточных петель, трех внутриклеточных петель и внутриклеточного карбоксильного C-конца. Три внеклеточных петли GPCR обеспечивают пространство, где сигнальные молекулы могут присоединяться для генерации ответа. Гетеротримерный G-белок содержит три различных субъединицы, включая альфа (α), бета (β) и гамма (γ) субъединицы. Гамма и бета субъединицы постоянно связаны друг с другом, образуя единую Gβγ субъединицу. Гетеротримерные G-белки действуют как «молекулярные переключатели», играющие ключевую роль в передаче сигнала, поскольку они передают информацию от активированных рецепторов к соответствующим эффекторным белкам. Все α субъединицы G-белка содержат пальмитат – 16-углеродную насыщенную жирную кислоту, присоединенную вблизи N-конца посредством нестабильной, обратимой тиоэфирной связи к аминокислоте цистеину. Именно эта пальмитоилирование позволяет G-белку взаимодействовать с мембранными фосфолипидами благодаря гидрофобной природе α субъединиц. Гамма субъединица также модифицирована липидами и может прикрепляться к плазматической мембране. Эти свойства двух субъединиц позволяют G-белку опиоидного рецептора постоянно взаимодействовать с мембраной посредством липидных якорей. Когда агонистический лиганд связывается с опиоидным рецептором, происходит конформационное изменение, и молекула GDP высвобождается из α субъединицы G. Этот механизм сложен и является основным этапом пути передачи сигнала. Когда молекула GDP связана, α субъединица G находится в неактивном состоянии, а карман связывания нуклеотидов закрыт внутри белкового комплекса. Однако при связывании лиганда рецептор переключается в активную конформацию, что обусловлено межмолекулярной перестройкой между трансмембранными спиралями. Активация рецептора высвобождает «ионный замок», удерживающий вместе цитоплазматические стороны трансмембранных спиралей три и шесть, заставляя их вращаться. Это конформационное изменение обнажает внутриклеточные домены рецептора на цитозольной стороне, что, в свою очередь, приводит к активации G-белка. Когда молекула GDP диссоциирует от α субъединицы G, молекула GTP связывается со свободным карманом связывания нуклеотидов, и G-белок становится активным. Образуется комплекс Gα(GTP), который имеет более низкий аффинность к Gβγ субъединице, чем комплекс Gα(GDP), что приводит к отделению α субъединицы G от Gβγ субъединицы, образуя две части G-белка. Субъединицы теперь свободны для взаимодействия с эффекторными белками; однако они все еще прикреплены к плазматической мембране липидными якорями. После связывания активные субъединицы G-белка диффундируют в мембране и действуют на различные внутриклеточные эффекторные пути. Это включает в себя ингибирование активности нейронной аденилатциклазы, а также увеличение гиперполяризации мембраны. Когда стимулируется ферментный комплекс аденилатциклазы, он приводит к образованию циклического аденозин-3',5'-монофосфата (cAMP) из аденозин-5'-трифосфата (ATP). cAMP действует как вторичный посредник, перемещаясь из плазматической мембраны в клетку и передавая сигнал. cAMP связывается и активирует cAMP-зависимую протеинкиназу A (PKA), которая находится внутриклеточно в нейроне. PKA состоит из голофермента – соединения, которое становится активным в результате объединения фермента с коферментом. Фермент PKA также содержит две каталитические субъединицы PKS Cα и регуляторный димер субъединицы PKA R. Голофермент PKA неактивен в нормальных условиях, однако, когда молекулы cAMP, образовавшиеся ранее в механизме передачи сигнала, объединяются с ферментом, PKA претерпевает конформационное изменение. Это активирует его, давая ему возможность катализировать фосфорилирование субстрата. CREB (белок, связывающий элемент ответа на cAMP) принадлежит к семейству факторов транскрипции и расположен в ядре нейрона. Когда PKA активируется, он фосфорилирует белок CREB (добавляет высокоэнергетическую фосфатную группу) и активирует его. Белок CREB связывается с элементами ответа на cAMP (CRE) и может увеличивать или уменьшать транскрипцию определенных генов. Описанный выше путь передачи сигнала cAMP/PKA/CREB имеет решающее значение для формирования памяти и модуляции боли. Он также важен для индукции и поддержания долговременной потенциации, феномена, лежащего в основе синаптической пластичности – способности синапсов укрепляться или ослабевать с течением времени. Вольтаж-зависимый кальциевый канал (VDCC) играет ключевую роль в деполяризации нейронов и играет важную роль в усилении высвобождения нейротрансмиттеров. Когда агонисты связываются с опиоидными рецепторами, G-белки активируются и диссоциируют на свои составные субъединицы Gα и Gβγ. Субъединица Gβγ связывается с внутриклеточной петлей между двумя трансмембранными спиралями VDCC. Когда субъединица связывается с вольтаж-зависимым кальциевым каналом, она производит вольтаж-зависимый блок, который ингибирует канал, предотвращая поток ионов кальция в нейрон. В клеточную мембрану также встроен G-белок-связанный внутрь-исправляющий калиевый канал. Когда молекула Gβγ или Gα(GTP) связывается с C-концом калиевого канала, он становится активным, и ионы калия выкачиваются из нейрона. Активация калиевого канала и последующая деактивация кальциевого канала вызывают гиперполяризацию мембраны. Это изменение мембранного потенциала в сторону более отрицательных значений. Снижение концентрации ионов кальция приводит к снижению высвобождения нейротрансмиттеров, поскольку кальций необходим для этого события. Это означает, что нейротрансмиттеры, такие как глутамат и субстанция P, не могут быть высвобождены из пресинаптического окончания нейронов. Эти нейротрансмиттеры жизненно важны для передачи боли, поэтому активация опиоидных рецепторов снижает высвобождение этих веществ, тем самым создавая сильный обезболивающий эффект.

Opioid receptors are a type of G protein–coupled receptor (GPCR). These receptors are distributed throughout the central nervous system and within the peripheral tissue of neural and non neural origin. They are also located in high concentrations in the Periaqueductal gray, Locus coeruleus, and the Rostral ventromedial medulla. The receptors consist of an extracellular amino acid N terminus, seven trans membrane helical loops, three extracellular loops, three intracellular loops, and an intracellular carboxyl C terminus. Three GPCR extracellular loops provide a compartment where signaling molecules can attach to generate a response. Heterotrimeric G protein contain three different sub units, which include an alpha (α) subunit, a beta (β) subunit, and a gamma (γ) sub unit. The gamma and beta sub units are permanently bound together, producing a single Gβγ sub unit. Heterotrimeric G proteins act as ‘molecular switches’, which play a key role in signal transduction, because they relay information from activated receptors to appropriate effector proteins. All G protein α sub units contain palmitate, which is a 16 carbon saturated fatty acid, that is attached near the N terminus through a labile, reversible thioester linkage to a cysteine amino acid. It is this palmitoylation that allows the G protein to interact with membrane phospholipids due to the hydrophobic nature of the alpha sub units. The gamma sub unit is also lipid modified and can attach to the plasma membrane as well. These properties of the two sub units, allow the opioid receptor's G protein to permanently interact with the membrane via lipid anchors. When an agonistic ligand binds to the opioid receptor, a conformational change occurs, and the GDP molecule is released from the Gα sub unit. This mechanism is complex, and is a major stage of the signal transduction pathway. When the GDP molecule is attached, the Gα sub unit is in its inactive state, and the nucleotide binding pocket is closed off inside the protein complex. However, upon ligand binding, the receptor switches to an active conformation, and this is driven by intermolecular rearrangement between the trans membrane helices. The receptor activation releases an ‘ionic lock’ which holds together the cytoplasmic sides of transmembrane helices three and six, causing them to rotate. This conformational change exposes the intracellular receptor domains at the cytosolic side, which further leads to the activation of the G protein. When the GDP molecule dissociates from the Gα sub unit, a GTP molecule binds to the free nucleotide binding pocket, and the G protein becomes active. A Gα(GTP) complex is formed, which has a weaker affinity for the Gβγ sub unit than the Gα(GDP) complex, causing the Gα sub unit to separate from the Gβγ sub unit, forming two sections of the G protein. The sub units are now free to interact with effector proteins; however, they are still attached to the plasma membrane by lipid anchors. After binding, the active G protein sub units diffuses within the membrane and acts on various intracellular effector pathways. This includes inhibiting neuronal adenylate cyclase activity, as well as increasing membrane hyper polarisation. When the adenylyl cyclase enzyme complex is stimulated, it results in the formation of Cyclic Adenosine 3', 5' Monophosphate (cAMP), from Adenosine 5' Triphosphate (ATP). cAMP acts as a secondary messenger, as it moves from the plasma membrane into the cell and relays the signal. cAMP binds to, and activates cAMP dependent protein kinase A (PKA), which is located intracellularly in the neuron. The PKA consists of a holoenzyme it is a compound which becomes active due to the combination of an enzyme with a coenzyme. The PKA enzyme also contains two catalytic PKS Cα subunits, and a regulator PKA R subunit dimer. The PKA holoenzyme is inactive under normal conditions, however, when cAMP molecules that are produced earlier in the signal transduction mechanism combine with the enzyme, PKA undergoes a conformational change. This activates it, giving it the ability to catalyse substrate phosphorylation. CREB (cAMP response element binding protein) belongs to a family of transcription factors and is positioned in the nucleus of the neuron. When the PKA is activated, it phosphorylates the CREB protein (adds a high energy phosphate group) and activates it. The CREB protein binds to cAMP response elements CRE, and can either increase or decrease the transcription of certain genes. The cAMP/PKA/CREB signalling pathway described above is crucial in memory formation and pain modulation. It is also significant in the induction and maintenance of long term potentiation, which is a phenomenon that underlies synaptic plasticity the ability of synapses to strengthen or weaken over time. Voltage gated dependent calcium channel, (VDCCs), are key in the depolarisation of neurons, and play a major role in promoting the release of neurotransmitters. When agonists bind to opioid receptors, G proteins activate and dissociate into their constituent Gα and Gβγ sub units. The Gβγ sub unit binds to the intracellular loop between the two trans membrane helices of the VDCC. When the sub unit binds to the voltage dependent calcium channel, it produces a voltage dependent block, which inhibits the channel, preventing the flow of calcium ions into the neuron. Embedded in the cell membrane is also the G protein coupled inwardly rectifying potassium channel. When a Gβγ or Gα(GTP) molecule binds to the C terminus of the potassium channel, it becomes active, and potassium ions are pumped out of the neuron. The activation of the potassium channel and subsequent deactivation of the calcium channel causes membrane hyperpolarization. This is when there is a change in the membrane's potential, so that it becomes more negative. The reduction in calcium ions causes a reduction neurotransmitter release because calcium is essential for this event to occur. This means that neurotransmitters such as glutamate and substance P cannot be released from the presynaptic terminal of the neurons. These neurotransmitters are vital in the transmission of pain, so opioid receptor activation reduces the release of these substances, thus creating a strong analgesic effect.

Патология

Некоторые формы мутаций в δ-опиоидных рецепторах привели к конститутивной активации рецепторов.