Трансдуцин: механизм фототрансдукции в сетчатке глаза.

Введение

Трансдуцин (Gt) – это белок, естественным образом экспрессирующийся в палочках и колбочках сетчатки позвоночных, играющий важную роль в фототрансдукции позвоночных. Это гетеротримерный G-белок, содержащий различные α-субъединицы в палочковых и колбочковых фоторецепторах. Свет вызывает конформационные изменения в родопсине, что, в свою очередь, приводит к активации трансдуцина. Активированный трансдуцин активирует фосфодиэстеразу, что приводит к расщеплению циклического гуанозинмонофосфата (cGMP). Интенсивность ответа на вспышку света напрямую пропорциональна количеству активированного трансдуцина.

Функция в фототрансдукции

Трансдуцин активируется метародопсином II, конформационным изменением родопсина, вызванным поглощением фотона ретиналем – светочувствительной частью родопсина. Свет вызывает изомеризацию ретиналя из 11-цис-формы в все-транс-форму. Изомеризация приводит к изменению опсина, превращая его в метародопсин II. Когда метародопсин активирует трансдуцин, гуанозиндифосфат (GDP), связанный с α-субъединицей (Tα), обменивается на гуанозинтрифосфат (GTP) из цитоплазмы. α-субъединица диссоциирует от βγ-субъединиц (Tβγ). Активированная α-субъединица трансдуцина активирует cGMP-фосфодиэстеразу. cGMP-фосфодиэстераза расщепляет cGMP – внутриклеточный вторичный мессенджер, который открывает cGMP-зависимые катионные каналы. Фосфодиэстераза гидролизует cGMP до 5'-GMP. Снижение концентрации cGMP приводит к уменьшению открытия катионных каналов и, как следствие, к гиперполяризации мембранного потенциала. Трансдуцин деактивируется, когда GTP, связанный с α-субъединицей, гидролизуется до GDP. Этот процесс ускоряется комплексом, содержащим белок RGS (Regulator of G protein Signaling) и гамма-субъединицу эффектора – циклическую GMP-фосфодиэстеразу.

Механизм активации

Tα-субъединица трансдуцина содержит три функциональных домена: один для взаимодействия родопсина/Tβγ, один для связывания с GTP и последний – для активации cGMP-фосфодиэстеразы. Существуют различные изоформы Tα, обнаруживаемые в клетках палочек и колбочек. Однако изоформы демонстрируют функциональную взаимозаменяемость в каскаде фототрансдукции и не должны полностью объяснять различия в светочувствительности. Хотя основное внимание в фототрансдукции уделяется Tα, Tβγ имеет решающее значение для связывания родопсина с трансдуцином. Домен связывания родопсина/Tβγ содержит амино- и карбоксильный терминалы Tα. Аминотерминал является местом взаимодействия с родопсином, а карбоксильный – местом связывания Tβγ. Аминотерминал может быть закреплен или находиться в непосредственной близости от карбоксильного терминала для активации молекулы трансдуцина родопсином. Взаимодействие с фотолизированным родопсином открывает GTP-связывающее место, позволяя быстро обменивать GDP на GTP. Связывающее место находится в закрытой конформации в отсутствие фотолизированного родопсина. Обычно в закрытой конформации α-спираль, расположенная рядом со связывающим местом, находится в положении, препятствующем обмену GTP/GDP. Конформационное изменение Tα, вызванное фотолизированным родопсином, приводит к наклону спирали, открывая GTP-связывающее место. После обмена GTP на GDP комплекс GTP-Tα претерпевает два основных изменения: диссоциацию от фотолизированного родопсина и Tβγ-субъединицы, а также экспонирование связывающего участка фосфодиэстеразы (PDE) для взаимодействия с латентной PDE. Конформационные изменения, инициированные в трансдуцине связыванием GTP, передаются на PDE-связывающий участок и вызывают его экспонирование для связывания с PDE. Индуцированные GTP конформационные изменения также могут нарушить связывание родопсина/Tβγ и привести к диссоциации от комплекса GTP-Tα. Считается, что избыток Tβ и Tγ свободно перемещается в ROS, хотя он не может быть связан с Tα в любой момент времени. Одним из возможных объяснений избытка Tβγ является повышенная доступность для повторного связывания с Tα. Поскольку Tβγ имеет решающее значение для связывания трансдуцина, повторное приобретение гетеротримерной конформации может привести к более быстрому связыванию с другой молекулой GTP и, следовательно, к более быстрой фототрансдукции. Связывание родопсина вызывает образование спирали на карбоксильном терминале Tγ и сближает карбоксильные терминалы Tγ и Tα, чтобы облегчить обмен нуклеотидами. Tα может ускорить скорость активации протеинкиназы А, индуцированной выключением света, благодаря связыванию с родопсином. Кроме того, трансдуцин достигает полной функциональной активации при связывании с активированным родопсином. Мутации в этом домене отменяют взаимодействие родопсина с трансдуцином. Этот конформационный переключатель в Tγ может быть сохранен в семействе γ-субъединиц G-белка. α- и β-субъединицы имеют более высокую молекулярную массу и составляют каталитический компонент PDE. В системе фототрансдукции Tα, связанный с GTP, связывается с γ-субъединицей PDE. Существует два предложенных механизма активации PDE. Первый предполагает, что Tα, связанный с GTP, высвобождает γ-субъединицу PDE из каталитических субъединиц для активации гидролиза. Второй, более вероятный механизм, предполагает, что связывание вызывает позиционный сдвиг γ-субъединицы, обеспечивая лучший доступ каталитической субъединицы к гидролизу cGMP. GTP-аза активность Tα гидролизует GTP до GDP и изменяет конформацию субъединицы Tα, увеличивая ее аффинность к связыванию с α- и β-субъединицами на PDE. Связывание Tα с этими более крупными субъединицами приводит к другому конформационному изменению PDE и ингибирует способность каталитической субъединицы к гидролизу. Это связывающее место на более крупной молекулярной субъединице может быть непосредственно прилегающим к Tα-связывающему месту на γ-субъединице. Это можно объяснить активацией PDE свободным Tα, связанным с GDP. Однако аффинность γ-субъединицы PDE к Tα, связанному с GDP, кажется примерно в 100 раз меньше, чем к Tα, связанному с GTP. Механизм, с помощью которого Tα, связанный с GDP, активирует PDE, остается неизвестным, однако предполагается, что он аналогичен активации PDE Tα, связанным с GTP.

The Tα subunit of transducin contains three functional domains: one for rhodopsin/Tβγ interaction, one for GTP binding, and the last for activation of cGMP phosphodiesterase. There are different isoforms of Tα, seen in rod and cone cells. However, the isoforms exhibit functional interchangeability in the phototransduction cascade and shouldn't solely account for differences in light sensitivity. Although the focus for phototransduction is on Tα, Tβγ is crucial for rhodopsin to bind to transducin. The rhodopsin/Tβγ binding domain contains the amino and carboxyl terminal of the Tα. The amino terminal is the site of interaction for rhodopsin while the carboxyl terminal is that for Tβγ binding. The amino terminal might be anchored or in close proximity to the carboxyl terminal for activation of the transducin molecule by rhodopsin. Interaction with photolyzed rhodopsin opens up the GTP binding site to allow for rapid exchange of GDP for GTP. The binding site is in the closed conformation in the absence of photolyzed rhodopsin. Normally in the closed conformation, an α helix located near the binding site is in a position which hinders the GTP/GDP exchange. A conformational change of the Tα by photolyzed rhodopsin causes the tilting of the helix, opening the GTP binding site. Once GTP has been exchanged for GDP, the GTP Tα complex undergoes two major changes: dissociation from photolyzed rhodopsin and the Tβγ subunit and exposure of the phosphodiesterase (PDE) binding site for interaction with latent PDE. The conformational changes initiated in the transducin by binding of GTP are transmitted to the PDE binding site and cause it to be exposed for binding to PDE. The GTP induced conformational changes could also disrupt the rhodopsin/Tβγ binding site and lead to dissociation from the GTP Tα complex. The excess Tβ and Tγ have been concluded to be floating freely around in the ROS, though it cannot be associated with the Tα at any given time. One possible explanation for the excess Tβγ is increased availability for Tα to rebind. Since Tβγ is crucial for the binding of transducin, reacquisition of the heterotrimeric conformation could lead to more rapid binding to another GTP molecule and thus faster phototransduction. Rhodopsin binding causes helix formation at the carboxyl terminal on the Tγ and brings the Tγ carboxyl and Tα. Carboxyl terminals closer together to facilitate nucleotide exchange. Tα can accelerate the rate of activation of light off induced Protein Kinase A due to binding to rhodopsin. As well as, transducin achieves full functional activation upon binding to activated rhodopsin. Mutations in this domain abolish rhodopsin transducin interaction. This conformational switch in the Tγ may be preserved in the G protein γ subunit family. The α and β subunits are the larger molecular weight subunits and make up the catalytic moiety of PDE. In the phototransduction system, GTP bound Tα binds to the γ subunit of PDE. There are two proposed mechanisms for the activation of PDE. The first proposes that the GTP bound Tα releases the PDE γ subunit from the catalytic subunits in order to activate hydrolysis. The second more likely mechanism proposes that binding causes a positional shift of the γ subunit, allowing better accessibility of the catalytic subunit for cGMP hydrolysis. The GTPase activity of Tα hydrolyzes GTP to GDP and changes the conformation of the Tα subunit, increasing its affinity to bind to the α and β subunits on the PDE. The binding of Tα to these larger subunits results in another conformational change in PDE and inhibits the hydrolysis ability of the catalytic subunit. This binding site on the larger molecular subunit may be immediately adjacent to the Tα binding site on the γ subunit. This can be explained by the activation of PDE by free GDP bound Tα. PDE γ subunit affinity for GDP bound Tα, however, seems to be about 100 fold smaller than for GTP bound Tα. The mechanism by which GDP bound Tα activates PDE remains unknown however, it is speculated to be similar to the activation of PDE by GTP bound Tα.