Фосфатидная кислота: структура, синтез и роль в мембранных процессах.

Введение

Класс липидных соединений. Фосфатидные кислоты – это анионные фосфолипиды, играющие важную роль в клеточной сигнализации и непосредственной активации ионных каналов, активируемых липидами. Гидролиз фосфатидной кислоты приводит к образованию одной молекулы глицерина и одной молекулы фосфорной кислоты, а также двух молекул жирных кислот. Они составляют приблизительно 0,25% от общего количества фосфолипидов в бислое.

Структура

Фосфатидная кислота состоит из глицеринового остова, к которому, как правило, насыщенная жирная кислота присоединена к углероду 1, ненасыщенная жирная кислота — к углероду 2, а фосфатная группа — к углероду 3.

Роль в биосинтезе

ПА является жизненно важным клеточным липидом, который выступает в качестве биосинтетического предшественника для образования (прямо или косвенно) всех липидов ацилглицерола в клетке. В клетках млекопитающих и дрожжей известны два различных пути de novo синтеза ПА: путь глицерин-3-фосфата или путь дигидроксиацетонфосфата. У бактерий присутствует только первый путь, и мутации, блокирующие этот путь, летальны, что демонстрирует важность ПА. В клетках млекопитающих и дрожжей, где ферменты в этих путях избыточны, мутация любого из них не является летальной. Однако стоит отметить, что in vitro различные ацилтрансферазы проявляют различную специфичность к субстратам в отношении ацил-КоА, которые включаются в ПА. Различные ацилтрансферазы также имеют разную внутриклеточную локализацию, например, в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), митохондриях или пероксисомах, и локальные концентрации активированных жирных кислот. Это позволяет предположить, что различные ацилтрансферазы, присутствующие в клетках млекопитающих и дрожжей, могут отвечать за производство различных пулов ПА. Эти роли могут быть связаны с биофизическими свойствами ПА, а также с процессами фузии и почкования.

В местах формирования или слияния мембран мембрана становится изогнутой или сильно искривленной. Основным событием при почковании везикул, таких как транспортные носители из аппарата Гольджи, является создание и последующее сужение шейки мембраны. Исследования показали, что этот процесс может быть обусловлен липидами и предположили центральную роль DAG из-за его уникальной молекулярной формы. Наличие двух ацильных цепей, но отсутствие головной группы приводит к большой отрицательной кривизне мембран. LPAAT BARS 50 также был вовлечен в почкование из аппарата Гольджи. Было показано, что индуцируемая этими липидами кривизна зависит не только от структуры лизо-ПА по сравнению с ПА, но и от динамических свойств, таких как гидратация головных групп и меж- и внутримолекулярные взаимодействия. Например, Ca2+ может взаимодействовать с двумя молекулами ПА, образуя нейтральный, но сильно изогнутый комплекс. Нейтрализация в противном случае отталкивающих зарядов головных групп и отсутствие стерических препятствий обеспечивает сильные межмолекулярные взаимодействия между ацильными цепями, что приводит к образованию микродоменов, богатых ПА. Таким образом, in vitro физиологические изменения pH, температуры и концентрации катионов оказывают сильное влияние на кривизну мембраны, индуцированную ПА и лизо-ПА. Например, TREK1-каналы активируются при локальном взаимодействии с PLD и образованием ПА. Константа диссоциации ПА для TREK1 составляет приблизительно 10 микромоляр. Относительно слабое связывание в сочетании с низкой концентрацией ПА в мембране позволяет каналу выключаться. Высокая локальная концентрация, необходимая для активации, предполагает некоторые ограничения в локальной диффузии липидов. Низкая общая концентрация ПА в сочетании с высокими локальными всплесками является противоположностью сигнализации PIP2. PIP2 поддерживается на относительно высоком уровне в мембране, а затем временно гидролизуется вблизи белка, чтобы временно снизить сигнализацию PIP2. Сигнализация ПА отражает сигнализацию PIP2 в том смысле, что для оказания мощного локального эффекта на целевой белок не требуется изменения общей концентрации сигнального липида. Как описано выше, PLD гидролизует PC с образованием ПА и холина. Поскольку холин очень распространен в клетке, активность PLD не оказывает существенного влияния на уровень холина, и маловероятно, что холин играет какую-либо роль в сигнализации. Роль активации PLD в многочисленных контекстах сигнализации в сочетании с отсутствием роли холина позволяет предположить, что ПА важна в сигнализации. Однако ПА быстро превращается в DAG, и DAG также является сигнальной молекулой. Это поднимает вопрос о том, играет ли ПА какую-либо прямую роль в сигнализации или же он просто выступает в качестве предшественника для производства DAG. Если будет установлено, что ПА действует только как предшественник DAG, то возникает вопрос, почему клетки должны производить DAG с использованием двух ферментов, когда они содержат PLC, который может производить DAG за один шаг. ПА, полученный PLD или DAGK, можно различить путем добавления [γ-32P]АТФ. Это покажет, является ли фосфатная группа новым производным от активности киназы или она происходит от PC. Хотя ПА и DAG взаимопревращаемы, они не действуют в одних и тех же путях. Стимулы, активирующие PLD, не активируют ферменты ниже по течению от DAG, и наоборот. Например, было показано, что добавление PLD к мембранам приводит к образованию [32P]-меченного ПА и [32P]-меченных фосфоинозитидов. Добавление ингибиторов DAGK устраняет образование [32P]-меченного ПА, но не PLD-стимулированное образование фосфоинозитидов. Возможно, что, хотя ПА и DAG взаимопревращаемы, поддерживаются отдельные пулы сигнальных и несигнальных липидов. Исследования показали, что сигнализация DAG опосредована полиненасыщенным DAG, в то время как ПА, полученный из PLD, является мононенасыщенным или насыщенным. Таким образом, функциональный насыщенный/мононенасыщенный ПА может быть деградирован путем гидролиза с образованием нефункционального насыщенного/мононенасыщенного DAG, в то время как функциональный полиненасыщенный DAG может быть деградирован путем превращения в нефункциональный полиненасыщенный ПА. Эта модель предполагает, что эффекторы ПА и DAG должны быть способны различать липиды с одинаковыми головными группами, но с разными ацильными цепями. Хотя некоторые белки, связывающиеся с липидами, способны встраиваться в мембраны и гипотетически распознавать тип ацильной цепи или результирующие свойства мембраны, многие белки, связывающиеся с липидами, являются цитозольными и локализуются в мембране, связываясь только с головными группами липидов. Возможно, разные ацильные цепи могут влиять на угол наклона головной группы в мембране. Если это так, то это предполагает, что домен связывания с ПА должен быть способен не только специфически связывать ПА, но и идентифицировать те головные группы, которые находятся под правильным углом. Каким бы ни был механизм, такая специфичность возможна. Это наблюдается в DAGK семенников свиней, специфичном для полиненасыщенного DAG, и в двух LPP гепатоцитов крысы, которые дефосфорилируют различные виды ПА с разной активностью. Кроме того, стимуляция активности SK1 PS in vitro значительно варьируется в зависимости от того, использовались ли диолеоил (C18:1), дистеароил (C18:0) или 1 стеароил, 2 олеоил виды PS. Таким образом, кажется, что, хотя ПА и DAG взаимопревращаемы, различные виды липидов могут обладать различной биологической активностью, и это может позволить двум липидам поддерживать отдельные пути сигнализации.

At sites of membrane budding or fusion, the membrane becomes or is highly curved. A major event in the budding of vesicles, such as transport carriers from the Golgi, is the creation and subsequent narrowing of the membrane neck. Studies have suggested that this process may be lipid driven, and have postulated a central role for DAG due to its, likewise, unique molecular shape. The presence of two acyl chains but no headgroup results in a large negative curvature in membranes. The LPAAT BARS 50 has also been implicated in budding from the Golgi. The curvature induced by these lipids was shown to be dependent not only on the structure of lysoPA versus PA but also on dynamic properties, such as the hydration of head groups and inter and intramolecular interactions. For instance, Ca2+ may interact with two PAs to form a neutral but highly curved complex. The neutralisation of the otherwise repulsive charges of the headgroups and the absence of any steric hindrance enables strong intermolecular interactions between the acyl chains, resulting in PA rich microdomains. Thus in vitro, physiological changes in pH, temperature, and cation concentrations have strong effects on the membrane curvature induced by PA and lysoPA. For example TREK 1 channels are activated by local association with PLD and production of PA. The dissociation constant of PA for TREK 1 is approximately 10 micromolar. The relatively weak binding combined with a low concentration of PA in the membrane allows the channel to turn off. The local high concentration for activation suggests at least some restrictions in local lipid diffusion. The bulk low concentration of PA combined with high local bursts is the opposite of PIP2 signaling. PIP2 is kept relatively high in the membrane and then transiently hydrolized near a protein in order to transiently reduce PIP2 signaling. PA signaling mirrors PIP2 signaling in that the bulk concentration of signaling lipid need not change to exert a potent local effect on a target protein. As described above, PLD hydrolyzes PC to form PA and choline. Because choline is very abundant in the cell, PLD activity does not significantly affect choline levels; and choline is unlikely to play any role in signaling. The role of PLD activation in numerous signaling contexts, combined with the lack of a role for choline, suggests that PA is important in signaling. However, PA is rapidly converted to DAG, and DAG is also known to be a signaling molecule. This raises the question as to whether PA has any direct role in signaling or whether it simply acts as a precursor for DAG production. If it is found that PA acts only as a DAG precursor, then one can raise the question as to why cells should produce DAG using two enzymes when they contain the PLC that could produce DAG in a single step. PA produced by PLD or by DAGK can be distinguished by the addition of [γ 32P]ATP. This will show whether the phosphate group is newly derived from the kinase activity or whether it originates from the PC. Although PA and DAG are interconvertible, they do not act in the same pathways. Stimuli that activate PLD do not activate enzymes downstream of DAG, and vice versa. For example, it was shown that addition of PLD to membranes results in the production of [32P] labeled PA and [32P] labeled phosphoinositides. The addition of DAGK inhibitors eliminates the production of [32P] labeled PA but not the PLD stimulated production of phosphoinositides. It is possible that, though PA and DAG are interconvertible, separate pools of signaling and non signaling lipids may be maintained. Studies have suggested that DAG signaling is mediated by polyunsaturated DAG, whereas PLD derived PA is monounsaturated or saturated. Thus functional saturated/monounsaturated PA can be degraded by hydrolysing it to form non functional saturated/monounsaturated DAG, whereas functional polyunsaturated DAG can be degraded by converting it into non functional polyunsaturated PA. This model suggests that PA and DAG effectors should be able to distinguish lipids with the same headgroups but with differing acyl chains. Although some lipid binding proteins are able to insert themselves into membranes and could hypothetically recognize the type of acyl chain or the resulting properties of the membrane, many lipid binding proteins are cytosolic and localize to the membrane by binding only the headgroups of lipids. Perhaps the different acyl chains can affect the angle of the head group in the membrane. If this is the case, it suggests that a PA binding domain must not only be able to bind PA specifically but must also be able to identify those head groups that are at the correct angle. Whatever the mechanism is, such specificity is possible. It is seen in the pig testes DAGK that is specific for polyunsaturated DAG and in two rat hepatocyte LPPs that dephosphorylate different PA species with different activities. Moreover, the stimulation of SK1 activity by PS in vitro was shown to vary greatly depending on whether dioleoyl (C18:1), distearoyl (C18:0), or 1 stearoyl, 2 oleoyl species of PS were used. Thus it seems that, though PA and DAG are interconvertible, the different species of lipids can have different biological activities; and this may enable the two lipids to maintain separate signaling pathways.

Измерение производства ПА

Поскольку фосфатидиновая кислота (ФК) быстро превращается в диацилглицерин (ДАГ), она имеет очень короткий период полураспада в клетке. Это затрудняет измерение продукции ФК и, следовательно, изучение роли ФК в клетке. Однако активность PLD можно измерить, добавляя первичные спирты в клетку. В этом случае PLD осуществляет реакцию трансфосфатидилирования вместо гидролиза, образуя фосфатидилспирты вместо ФК. Фосфатидилспирты являются метаболически неактивными соединениями и могут быть легко извлечены и измерены. Таким образом, можно измерить активность PLD и продукцию ФК (но не саму ФК), а также, блокируя образование ФК, можно судить об участии ФК в клеточных процессах.