Введение
Метод в масс-спектрометрии
Диссоциация захвата электронов (ECD) – это метод фрагментации ионов в газовой фазе, используемый для определения структуры пептидов и белков методом тандемной масс-спектрометрии. Это один из наиболее распространенных методов активации и диссоциации масс-селектированного иона-предшественника в МС/МС. Метод заключается в непосредственном введении низкоэнергетических электронов к ионам, удерживаемым в газовой фазе.
История
Диссоциация захвата электронов была разработана Романом Зубаревым и Нилом Келлехером в лаборатории Фреда Маклафферти в Корнелльском университете. Облучение ионов мелиттина 4+ и ионов убиквитина 10+ (заключенных в ячейку FT MS) лазерными импульсами приводило не только к характерной фрагментации c', z, но и к уменьшению заряда. Было предложено, что если ячейку FT модифицировать для одновременного захвата катионов и электронов, то вторичные электроны, испускаемые ультрафиолетовыми фотонами, усилят эффект уменьшения заряда и фрагментацию c′, z•. Замена ультрафиолетового лазера источником EI привела к разработке этой новой методики.
Принципы
Диссоциация захвата электронов обычно включает в себя многократно протонированную молекулу M, взаимодействующую со свободным электроном с образованием иона с нечетным числом электронов. Освобождение электрической потенциальной энергии приводит к фрагментации иона-продукта. Скорость диссоциации захвата электронов зависит не только от частоты реакций фрагментации ион-электрон, но и от количества ионов в объеме взаимодействия ион-электрон. Плотность электронного тока и сечение ЭЗЭ прямо пропорциональны частоте фрагментации. Использование диспенсерного катода с косвенным нагревом в качестве источника электронов обеспечивает больший электронный ток и большую площадь излучения. Устройства ЭЗЭ могут быть двух типов: они могут захватывать анализируемые ионы на стадии ЭЗЭ или работать в режиме проточного потока, когда диссоциация происходит по мере непрерывного прохождения анализируемых ионов через область ЭЗЭ. Проточный режим имеет преимущество перед другими режимами, поскольку используется почти весь пучок анализируемых ионов. Однако это снижает эффективность ЭЗЭ в проточном режиме. ЭЗЭ генерирует значительно отличающиеся типы фрагмент-ионов (хотя преимущественно типов c и z, ионы типа b также были идентифицированы при ЭЗЭ) по сравнению с другими методами фрагментации MS/MS, такими как диссоциация отрыва электронов (EDD) (преимущественно типы a и x), диссоциация, индуцированная столкновениями (CID) (преимущественно типы b и y) и инфракрасная многофотонная диссоциация. CID и IRMPD вводят внутреннюю колебательную энергию тем или иным способом, что приводит к потере посттрансляционных модификаций в процессе фрагментации. При ЭЗЭ наблюдаются уникальные фрагменты (и комплементарные CID), а способность эффективно фрагментировать целые макромолекулы представляется перспективной. Хотя ЭЗЭ в основном используется в фурье-трансформационной ионно-циклотронной резонансной масс-спектрометрии, исследователи показали, что ее успешно применяли и в ионном ловуше-масс-спектрометре. ЭЗЭ также может быстро интегрировать несколько сканирований в FTICR MS при использовании в сочетании с внешней аккумуляцией. Механизм ЭЗЭ все еще обсуждается, но, по-видимому, он не обязательно разрывает самую слабую связь и поэтому считается быстрым (неэргодическим) процессом, при котором энергия не может свободно релаксировать внутримолекулярно. Предполагается, что радикальные реакции, инициированные электроном, могут быть ответственны за действие ЭЗЭ. В аналогичной технике фрагментации MS/MS, называемой диссоциацией переноса электронов, электроны передаются посредством столкновений между анализируемыми катионами и реагент-анионами.
Постпереводные изменения
Фрагменты ECD MS могут сохранять посттрансляционные модификации, такие как карбоксилирование, фосфорилирование и O-гликозилирование. ECD обладает потенциалом для проведения характеризации "сверху вниз" основных типов посттрансляционных модификаций в белках. Он успешно расщепил 87 из 208 пептидных связей и обеспечил первую прямую характеристику фосфопротеина – бета-казеина крупного рогатого скота, одновременно точно определив локализацию пяти участков фосфорилирования. ECD имеет преимущества перед CAD при измерении степени фосфорилирования с минимальной потерей фосфатных групп, а также для картирования фосфопептидов/фосфопротеинов, что делает ECD превосходящим методом.
Соединение ЭКД с методами разделения
Электронный захват диссоциации (ЭЗД) был объединен с капиллярным электрофорезом (КЭ) для получения информации о структурном анализе смеси пептидов и протеолитического дайджеста белков. Микро-ВЭЖХ в сочетании с ЭЗД FTICR использовалась для анализа пепсин-дайджеста цитохрома c. Теги последовательности были получены при анализе смеси пептидов и триптического дайджеста сывороточного альбумина крупного рогатого скота с использованием LC ЭЗД FTICR MS. Кроме того, LC ЭЗД MS/MS обеспечивает более длинные теги последовательности, чем LC CID MS/MS, для идентификации белков.
Протеомика
Анализ белков может быть выполнен как с использованием подхода сверху вниз, так и снизу вверх. Однако, анализ сверху вниз обеспечивает лучшее покрытие последовательности. Комбинация ЭКД с ФТИЦР МС способствовала популяризации этого подхода. Он также позволил определить несколько участков модификации в интактных белках. Нативный метод диссоциации с захватом электронов (NECD) был использован для изучения димера цитохрома c и недавно применен для выяснения каналов связывания железа в ферритине селезенки лошади.
Синтетические полимеры
Исследования методом ЭКД полиалкеновых гликолей, полиамидов, полиакрилатов и полиэстеров полезны для определения состава образцов полимеров. Этот метод стал мощным инструментом для анализа структурной информации о ионах-предшественниках в процессе МС/МС применительно к синтетическим полимерам. Склонность ЭКД к разрыву одной химической связи упрощает интерпретацию спектров дочерних ионов, что делает его удобным для полимерной химии.